本發明涉及生產方法領域，特別是一種磁性固定化酶的生產方法領域。

背景技術：

于2015年4月8日公布的中國發明專利申請CN104498472A中，記載了一種磁性固定化纖維二糖酶納米介孔材料及其制備方法，該方法通過對酶進行固定化，實現酶的可重復使用，并通過包合的磁性材料來提高酶回收的可操作性。

但在該發明專利中，并未公開固定化酶的生產工藝。由實驗室擴大化到工業生產，是一個復雜而艱巨的工程，工藝方案的差異會造成產品的性能的不同，這也是工業生產的特點。針對專利申請CN104498472A中公開的制備方法在工業生產上出現的實際問題主要有：

1.針對反應過程中產生大量的熱量，在常溫下進行反應會對體系的生產安全造成影響，因此在工業生產中應考慮到如何避免熱量的聚集；同時若采用反應液一次性加入，由于反應速率變快，也會造成反應過于劇烈，這也會對工業的安全生產造成危害；

2.若在加入堿溶液中和之前添加磁性材料進行包合，由于體系的粘度小、酸性高，磁性材料容易發生團聚現象，而在加入堿溶液中和之后添加磁性材料進行包合，由于體系的粘度過大，磁性材料不易分散，這些情況容易造成磁性材料不能有效地實現均勻包合；

3.在凝膠過程中，若采用中性條件直接凝膠，會造成產物覆著在反應釜中不易取出，同時由于凝膠速率過快也會造成凝膠不均勻的問題；

生產出的固定化酶容易造成酶失活的問題，因此也需考慮到如何保持固定化酶的穩定性。

技術實現要素：

本發明的目的在于解決現有技術中的問題，提供一種生產安全、可操作性高、生產工藝簡便、磁性包合均勻、酶的穩定性高、凝膠均勻的磁性固定化酶的生產方法。

為達成上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種磁性固定化酶的生產方法，包括如下步驟：步驟1：按質量份稱取下列組份：反應底物100份、模板溶液50-200份、四氧化三鐵粉末1-2份、纖維素酶2-30份；所述的反應底物包括正硅酸四乙酯或正硅酸四甲酯；所述的模板溶液為質量百分比在28-32％的葡萄糖、麥芽糖、果糖、二苯甲酰基-L-酒石酸、環糊精、尿素、甘油、可溶性淀粉、檸檬酸、抗壞血酸或寡肽中的任一種的溶液；步驟2：按步驟1中稱取的反應底物的物質量，并按以下摩爾比稱取鹽酸，反應底物與鹽酸的摩爾比為100∶1-200∶1，所述的鹽酸濃度等于或低于0.2mol/L；步驟3：將步驟1中稱取的反應底物加入反應釜中；步驟4：將反應底物冷卻至15℃以下；步驟5：向反應釜中的反應底物滴加步驟2中稱取的鹽酸并攪拌直至得到的溶液變得澄清透明，控制反應溫度小于或等于30℃；步驟6：將步驟1中稱取的模板溶液加入步驟5得到的溶液中，并攪拌至混合均勻；步驟7：減壓蒸餾去除反應溶液中的副產物乙醇或甲醇，得到溶膠；所述的減壓蒸餾壓力為0.005MPa以下，溫度為30℃以下；步驟8：向步驟7得到的溶膠滴加濃度為0.38-0.42mol/L的氫氧化鈉溶液并攪拌，滴加速率小于或等于1L/min，直至pH值大于或等于3.5，加入步驟1中稱取的四氧化三鐵粉末和纖維素酶后，繼續滴加氫氧化鈉溶液，直至pH值達到或超過4.2結束；步驟9：將步驟8得到的反應產物轉移至開口容器中，冷卻至0℃以下并保持10小時以上，得到凝膠。

進一步地，在步驟1中所述的反應底物還包括二甲基二硅氧烷或甲基三硅氧烷，所述的二甲基二硅氧烷或甲基三硅氧烷的加入量小于或等于反應底物質量的20％。

進一步地，在步驟4中通過冷水浴或設置冷卻夾層、盤管以實現將反應底物冷卻至15℃以下。

進一步地，在步驟4中將反應底物冷卻至10℃以下。

進一步地，在步驟2中所述的鹽酸濃度優選0.10-0.15mol/L。

進一步地，在步驟5、步驟6和步驟8中所述的攪拌的速率均為60-180轉/分鐘。

進一步地，在步驟9之后還包括步驟10：將所述的凝膠采用粉碎機粉碎成粒度為0.2mm以下的顆粒，并進行干燥，采用鋁箔袋包裝干燥后的磁性固定化酶。

本發明所述的技術方案相對于現有技術，取得的有益效果是：

1、步驟4中將反應底物溫度控制在15℃以下，避免常溫下反應導致熱量聚集造成的生產危險，確保工業生產的可操作性。

2、步驟5中采用滴加的方式添加鹽酸，避免一次性加入導致反應過于劇烈，以便于更好地控制反應速率，提高反應安全性。

3、步驟7中通過減壓蒸餾去除反應副產物乙醇或甲醇，避免了乙醇或甲醇對纖維素酶的活力造成影響，同時也可避免后續的凝膠速率過慢。

4、步驟8中通過在中和過程中間加入四氧化三鐵和纖維素酶的方式，避免了在反應前期加入，由于粘度小、酸性高，四氧化三鐵和纖維素酶直接加入時容易發生團聚的問題，同時也避免到了在反應后期加入，由于體系粘度高，四氧化三鐵和纖維素酶不易分散的問題，從而根本上解決了包覆不均勻問題。

5、步驟9中采用酸性條件下進行凝膠，避免了中性條件下凝膠不易轉移的問題，并避免了中性條件下凝膠出現的凝膠不均勻的問題。

6、通過在反應底物中添加二甲基二硅氧烷或甲基三硅氧烷調節最終產品的特點，使磁性固定化酶具有更好的韌性，避免在使用過程中易破碎從而導致反應活力下降的問題。

7、采用冷水浴或通過冷卻夾層或盤管的方式實現冷卻條件，技術簡單可靠、穩定性好。

8、采用鋁箔袋包裝生產的磁性固定化酶，可避免酶失活，從而提高磁性固定化酶的存儲穩定性。

9、由于本發明的主要步驟均在反應釜中實現，因此本生產方法具有對設備要求不高、工藝簡便、可操作性高等優勢。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：

圖1為本發明實施例所使用的設備示意圖；

具體實施方式

為了使本發明所要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚、明白，以下結合附圖和實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

本發明的實施例采用附圖1所示的設備，并通過如下步驟制得磁性固定化酶：

步驟1：按質量份稱取下列組份：反應底物100份、模板溶液100份、四氧化三鐵粉末2份、纖維素酶20份；反應底物為正硅酸四乙酯和二甲基二硅氧烷，其中正硅酸四乙酯質量占比80％、二甲基二硅氧烷質量占比20％；模板溶液為葡萄糖溶液，葡萄糖質量百分比為30％；

步驟2：按步驟1中稱取的反應底物的物質量，并按以下摩爾比稱取鹽酸，反應底物與鹽酸的摩爾比為150∶1，所述的鹽酸濃度為0.1mol/L；

步驟3：將步驟1中稱取的反應底物置于儲罐1中，并通過泵11加入反應釜5中；

步驟4：通過冷水浴將反應底物冷卻至8℃；

步驟5：將步驟2中的鹽酸置于儲罐2中，并通過泵21向反應釜5中的反應底物滴加鹽酸并攪拌直至得到的溶液變得澄清透明，控制反應溫度30℃，攪拌速度為100轉/分鐘；

步驟6：將步驟1中稱取的模板溶液置于儲罐3中，并通過泵31向步驟5得到的溶液加入模板溶液，并攪拌至混合均勻，攪拌速度為100轉/分鐘；

步驟7：通過真空泵6和冷卻器7對反應釜5中步驟6所得溶液進行減壓蒸餾直至不再產生氣泡，以去除反應溶液中的副產物乙醇，得到溶膠；所述的減壓蒸餾壓力為0.005MPa，溫度為25℃，副產物乙醇冷卻回到到回收罐8中

步驟8：關停真空泵6和冷卻器7，將濃度為0.4mol/L的氫氧化鈉溶液加入儲罐4中，通過泵41向步驟7得到的溶膠滴加上述氫氧化鈉溶液并攪拌，滴加速率為1L/min，并實時監測pH值，直至pH值達到3.5，通過加料口51向反應釜5加入步驟1中稱取的四氧化三鐵粉末和纖維素酶，繼續滴加氫氧化鈉溶液，直至pH值達到4.2，攪拌速度為100轉/分鐘；

步驟9：將步驟8得到的反應產物從反應釜5轉移至開口容器9中，冷卻至0℃并保持12小時，得到凝膠；

步驟10：將所述的凝膠采用粉碎機粉碎成粒度為0.2mm以下的顆粒，并進行干燥，采用鋁箔袋包裝干燥后的磁性固定化酶。

上述實施例中，在步驟1中，通過在反應底物中添加二甲基二硅氧烷調節最終產品的特點，使磁性固定化酶具有更好的韌性，避免在使用過程中易破碎的問題。在步驟4中通過冷水浴將反應底物溫度控制在8℃，有效避免了常溫下反應導致熱量聚集造成的生產危險，確保工業生產的可操作性。在步驟5中，通過滴加方式添加鹽酸，避免一次性加入導致反應過于劇烈，以便于更好地控制反應速率，提高反應安全性。在步驟7中通過減壓蒸餾去除反應副產物乙醇，避免了乙醇對纖維素酶的活力造成影響，同時也可避免后續的凝膠速率過慢。在步驟8中通過在中和過程中間加入四氧化三鐵和纖維素酶的方式，避免了在反應前期加入，由于粘度小、酸性高，四氧化三鐵和纖維素酶直接加入時容易發生團聚的問題，同時也避免到了在反應后期加入，由于體系粘度高，四氧化三鐵和纖維素酶不易分散的問題，從而根本上解決了包覆不均勻問題。在步驟9中采用酸性條件下進行凝膠，避免了中性條件下凝膠不易轉移的問題，并避免了中性條件下凝膠出現的凝膠不均勻的問題。在步驟10中，采用鋁箔袋包裝生產的磁性固定化酶，可避免酶失活，從而提高磁性固定化酶的存儲穩定性。由于本發明的實施例主要步驟均在反應釜中實現，因此本生產方法具有對設備要求不高、工藝簡便、可操作性高等優勢。

上述說明描述了本發明的優選實施例，但應當理解本發明并非局限于上述實施例，且不應看作對其他實施例的排除。通過本發明的啟示，本領域技術人員結合公知或現有技術、知識所進行的改動也應視為在本發明的保護范圍內。