本發明屬于工業生物技術領域，具體涉及一種高效發酵生產生物納米纖維素的方法。

背景技術：

生物納米纖維素與植物纖維素相比有許多獨特的性質，如高持水性、高結晶度、較高的生物相容性、超精細網狀結構、高抗張強度和彈性模量等，由于這些特性使其廣泛應用于食品、生物醫學、聲學器材、造紙、燃料電池、離子交換膜及膜分離等領域。例如，在醫學材料領域，它可以被制成人造皮膚、紗布、繃帶和“創可貼”等傷口輔料商品。

目前生物納米纖維素發酵方式有動態和靜態兩種，發酵方式的不同導致其聚合度差、結構等性質異較大，也影響了其應用方向。而且，相對靜態發酵，常規的動態發酵方法產量較低，其中一個重要的原因是由于動態發酵剪切力大，使部分菌株突變成非生產性菌株。在產生纖維素的醋桿菌中也發現有引起遺傳不穩定性的插入序列的存在。

崔思穎等在“不同培養方式制備的細菌纖維素性質的比較“(崔思穎等，《造紙科學與技術》，2010年第29卷第1期)中對比研究了靜態發酵制得的細菌纖維素凝膠和動態發酵制得的細菌纖維素凝膠的纖維素結構、吸水\復水性能、灰分等性質，發現動態發酵制得的細菌纖維素凝膠的纖維結構更加疏松，并具有相對更好的吸水\復水性能。在提高產量方面，主要是通過優化工藝條件，降低剪切力。鐘春燕公開了一種動態發酵制備細菌纖維素凝膠產品的方法，即在動態發酵之前，在細菌纖維素液體發酵培養基中加入0.2-1.0％重量的瓊脂。該方法能夠大幅提高細菌纖維素凝膠的產量，得到呈小球形，纖維結構更疏松、具有優良吸水\復水性能的細菌纖維素凝膠產品。蘭水(2014)等人別以木薯酶解液和糖蜜處理液作為發酵碳源，在機械攪拌式發酵罐中生產細菌纖維素(BC)。通過考察纖維素產量、活菌增殖、耗糖量以及溶氧率等參數研究添加0-0.8％(w/y)瓊脂對BC產量的影響。結果表明，未添加瓊脂時，木薯酶解液的BC產量為6.8g/L，發酵效果優于糖蜜的4.8g/L。添加瓊脂可以顯著提高BC產量。Cheng等人(2011)在培養基中加了1.5％的CMC(羧甲基纖維素)，得率比對照提高了70％。Song和Kim等以Acetobacter xylinum KJl為試驗用菌株，利用廉價的糖化廢棄物(SFW)和經改良后具有高傳氧率的生物反應器來探討果膠的加入量和生物反應器的攪拌速率對BC產量的影響，結果表明：在SFM為原料的培養基中加入0.4％的果膠和反應器的攪拌線速為0.93cm/min時，能有效提高BC的產量。

雖然已經在研究上取得了一定的成果，但是真正將研究轉化為生產的還很不夠成熟。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是，提供一種高效發酵生產生物納米纖維素的方法。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種細菌纖維素的制備方法，包括如下步驟：

(1)搖瓶菌種制備：將木醋桿菌ATCC 700178接種到種子培養基中，28～33℃培養12～24h，得到一級種子液；

(2)種子液擴大培養：將一種種子液接種到種子培養基中，進行擴大培養得到二級種子液；

(3)發酵：將二級種子液接種到裝有糖蜜培養基的發酵罐中，所述發酵罐中裝有固定化介質，發酵6～8天；

(4)提取：從發酵液中提取生物納米纖維素。

步驟(1)和(2)中，所述的種子培養基包括如下組分：葡萄糖20～50g/L、酵母膏1～10g/L、蛋白胨1～10g/L、CaCO₃ 0.5～5g/L，溶劑為水。

步驟(2)中，擴大培養的培養條件如下：溫度28～33℃，溫度優選30℃；攪拌轉速80～150r/min，攪拌轉速優選120r/min；通氣量0.5～2.0vvm，通氣量優選1.5vvm。

步驟(3)中，所述的糖蜜培養基包括如下組分：還原糖20～50g/L、甘油0.5～5g/L、玉米漿5～30g/L、硫酸銨0.5～5g/L、檸檬酸0.5～3g/L、磷酸氫二鈉0.5～3g/L、硫酸鎂0.2～2g/L，pH4.0～6.0，溶劑為水；糖蜜培養基優選：還原糖30g/L、甘油3g/L、玉米漿20g/L、硫酸銨3g/L、檸檬酸1.8g/L、磷酸氫二鈉3g/L、硫酸鎂1g/L，pH4.5。

步驟(3)中，糖蜜為甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜，所述還原糖的制備方法如下：將原糖蜜預先稀釋2～10倍，用硫酸調pH值為1.0～3.0，90～120℃下水解15～30min，靜置，取上清液，再稀釋5～25倍，即得還原糖溶液。

步驟(3)中，發酵條件如下：攪拌轉速50～150rpm，攪拌轉速優選100rpm；發酵溫度28～33℃，發酵溫度優選30℃；通氣量0.5～2.0vv/min，通氣量優選1.2vvm，罐壓0.05～0.15Mpa，罐壓優選0.1Mpa。

步驟(3)中，所述的固定化介質為：聚氨酯、棉纖維織物、活性炭纖維、聚酯纖維織物、絲綢織物、竹纖維織物、聚乙烯醇纖維織物、滌綸織物、丙綸織物、錦綸織物、氨綸織物或腈綸織物，所述的固定化介質可拆卸地固定在發酵罐內部。

步驟(4)中，從發酵液中提取生物納米纖維素的方法如下：過濾步驟(3)得到的發酵液，將細菌纖維素投入儲罐加水攪拌，分別經過熱浸、堿煮、熱浸、漂泊循環處理，當樣品呈乳白色透明狀，pH值呈中性，再進行干燥，即得細菌纖維素成品。

其中，所述的熱浸的條件：為將細菌纖維素在50℃～100℃的水中浸泡1～10小時，再抽濾，如此循環2-4次。

其中，所述的堿煮的條件為：將細菌纖維素在0.1～1mol/L的氫氧化鈉水溶液中煮沸0.5～3小時，抽濾，清洗，如此循環熱浸2～4次。

有益效果：

(1)本發明中發酵所用碳氮源均為工業常用原料，成本低廉，大幅降低生產BC的發酵成本；

(2)本發明的所用工藝較為簡單，常用發酵罐進行簡單改造即可；

(3)反應器內填裝吸附介質可明顯降低發酵過程中攪拌和鼓氣剪切力對菌體生長造成的影響，介質上吸附的菌體可更快產生BC膜；

(4)通過改變載體種類和數量可控制BC聚合度，以實現不同用途。

附圖說明

圖1為支撐物鋼絲網和多孔介質。

圖2為裝有吸附介質的生物反應器簡易圖。

具體實施方式

根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。

實施例1：7L NBS罐發酵

1)搖瓶菌種制備：刮取一環斜面種子接于滅菌后的種子培養基(葡萄糖20、酵母膏2、蛋白胨2、CaCO3 0.5，單位g/L，pH值自然)，28℃、100r/min培養16小時后擴陪培養；

2)糖蜜制備:將原甘蔗糖蜜預先稀釋2倍，用硫酸調pH值為2.0，90℃水解30分鐘，靜置一夜后離心或過濾取上清液再稀釋10倍，pH值為6.0；

3)發酵：將種子按5％接種于裝有一定量的甘蔗糖蜜培養基(糖蜜25，甘油0.5，玉米漿10g/L，硫酸銨0.5，檸檬酸1.0，磷酸氫二鈉2.0，硫酸鎂0.2，單位g/L)的發酵罐進行攪拌發酵8天；其中，攪拌罐是裝有紗布的生物反應器，紗布掛于反應器擋板上；攪拌轉速為50r/min；發酵溫度為28℃，通氣量為0.5vv/min，罐壓0.05Mpa。

4)發酵后處理：將發酵液用紗布過濾掉發酵液后，將生物納米纖維素用80℃熱水浸泡2小時，循環3次。所述換堿煮為加0.1M的氫氧化鈉煮沸2小時，過濾后用同樣的熱水清洗，循環熱浸2次；加次氯酸鈉0.2％，溫度維持在50℃，浸泡1小時，抽濾后用熱水清洗，循環若干次至pH值為中性。最后進行凍干處理，所得產品產量為3.9g/L，相比對照組(未填裝載體，其他條件一致)增加了1.3倍，產品聚合度為1690。

實施例2：50升攪拌罐發酵

1)菌種制備：刮取一環斜面種子接于滅菌后的種子培養基(葡萄糖40、酵母膏5、蛋白胨5、CaCO3 1，單位g/L，pH值自然)，32℃、150r/min培養24小時后移至實施例1中的NBS罐擴陪，裝液量為3L，培養基與搖瓶類似，轉速100r/min、通氣量1.0vvm、溫度32℃攪拌培養20小時；

2)糖蜜制備:將甜菜糖蜜預先稀釋5倍，用硫酸調pH值為2.5，100℃水解20分鐘，靜置一夜后離心或過濾取上清液再稀釋2倍，pH值為5.5；

3)發酵：將種子接種于裝有30L糖蜜培養基(糖蜜50，甘油0.2，玉米漿20g/L，硫酸銨1.5，檸檬酸1.5，磷酸氫二鈉3.0，硫酸鎂0.6，單位g/L)的發酵罐進行攪拌發酵7天；其中，發酵罐中載體填裝與實施例1類似；攪拌轉速為100r/min；發酵溫度為30℃，通氣量為1.0vv/min，罐壓0.05Mpa。

4)發酵后處理：將發酵液用紗布過濾掉發酵液后，將生物納米纖維素用70℃熱水浸泡3小時，循環2次。所述換堿煮為加0.5M的氫氧化鈉煮沸1.5小時，過濾后用同樣的熱水清洗，循環熱浸2次；加次氯酸鈉0.5％，溫度維持在40℃，浸泡2小時，抽濾后用熱水清洗，循環若干次至pH值為中性。最后進行烘干處理，所得產品產量為3.3g/L，產品聚合度為1490。

實施例3：2噸攪拌罐發酵

1)菌種制備：刮取一環斜面種子接于滅菌后的裝有100mL的種子培養基(葡萄糖25、酵母膏2.5、蛋白胨2.5、CaCO₃ 3，單位g/L，pH值自然)500mL三角瓶，30℃、150r/min培養20小時后用裝有1L培養基的5L三角瓶，同樣條件培養20小時。移至裝有100L培養基的200L種子罐擴陪，培養基與搖瓶類似，轉速90r/min、通氣量1.5vvm、溫度30℃攪拌培養24小時；

2)糖蜜制備:將甘蔗糖蜜預先稀釋4倍，用硫酸調pH值為3.0，120℃水解15分鐘，靜置一夜后離心或過濾取上清液再稀釋2.5倍，pH值為4.8；

3)發酵：將種子移至接種于裝有1200L糖蜜培養基(糖蜜50，甘油0.8，玉米漿15g/L，硫酸銨2.5，檸檬酸1.2，磷酸氫二鈉2.2，硫酸鎂1.0，單位g/L)的發酵罐進行攪拌發酵8天；其中，發酵罐中填裝圓筒狀的聚氨酯載體；攪拌轉速為80r/min；發酵溫度為28℃，通氣量為0.6vv/min，罐壓0.12Mpa。

4)發酵后處理：將發酵液通過板框過濾掉發酵液后，將生物納米纖維素投入儲罐加70℃熱水攪拌3小時，再泵到抽濾缸進行抽濾，循環3次。換0.8M的氫氧化鈉煮沸2小時，再泵入抽濾缸，抽濾后再次投入儲罐，用同樣的熱水清洗，循環熱浸3次；加次氯酸鈉0.6％，溫度維持在45℃，浸泡3小時，再泵入抽濾缸，抽濾后再次投入儲罐，用熱水清洗，循環若干次至pH值為中性。最后進行烘干處理，所得產品產量為1.9g/L，產品聚合度為1220。

實施例4：2噸攪拌罐發酵

1)菌種和糖蜜制備及發酵條件：與實施例3相同。

2)發酵罐中填裝3層圓筒狀的竹纖維紗布載體(紗布固定于鋼絲網表面上)，間距為8cm；攪拌轉速為100r/min；發酵溫度為30℃，通氣量為0.4vv/min，罐壓0.10Mpa。

4)發酵后處理：將發酵液通過板框過濾掉發酵液后，將生物納米纖維素投入儲罐加65℃熱水攪拌2小時，再泵到抽濾缸進行抽濾，循環4次。換1.0M的氫氧化鈉煮沸1.5小時，再泵入抽濾缸，抽濾后再次投入儲罐，用同樣的熱水清洗，循環熱浸2次；加次氯酸鈉0.3％，溫度維持在55℃，浸泡2小時，再泵入抽濾缸，抽濾后再次投入儲罐，用熱水清洗，循環若干次至pH值為中性。最后進行打漿噴干處理，所得產品產量為2.7g/L，產品聚合度為1362。