本發明涉及過塵螨過敏原檢測技術領域，具體是一種利用夜蛾細胞生產塵螨過敏原重組蛋白及驗證方法。

背景技術：

塵螨是全球室內變應原最重要的來源之一，被證實是哮喘、過敏性鼻炎主要致敏原。對塵螨粗提浸混合物的分析表明約有30余種的可以引起機體產生ige抗體的蛋白質。研究表明，第1組份和第2組份是塵螨提取液的主要致敏物質，85%以上的塵螨過敏性疾病患者對第1、2組分變應原皮膚試驗陽性或ige抗體檢測呈陽性，此類患者體內塵螨特異性ige絕大部分是因為這兩組變應原引起，這兩組變應原特異性ige是機體總ige的主要組成部分（thomaswr,smithwa,halesbj,millskl,o'brienrm.characterizationandimmunobiologyofhousedustmiteallergens.intarchallergyimmunol2002;129(1):1-18.[2]thomaswr,heinrichtk,smithwa,halesbj.pyroglyphidhousedustmiteallergens.proteinpeptlett2007;14(10):943-53.）。把塵螨粗提浸液中的第1、2組分清除后，剩余部分仍然具有致敏性（vanderzeeetal.1988），其中第4組分非常重要，與血清特異性ige結合率均達到10%以上，被認為是中等效價變應原組分（mid-potencyspecificities）（batardt,hrabinaa,bixz,chabreh,lemoinep,couretmn,etal.productionandproteomiccharacterizationofpharmaceutical-gradedermatophagoidespteronyssinusanddermatophagoidesfarinaeextractsforallergyvaccines.intarchallergyimmunol2006;140(4):295-305.)。為獲得塵螨過敏性疾病患者最靈敏的檢測指標，學術界認為應選用最具代表性的螨變應原分子進行檢測，而不是用螨粗提浸液混合物。

研究表明，重組變應原用于免疫診斷是有效的。采用21種不同的重組變應原診斷1600例患者，證實重組變應原并沒有增加免疫診斷副反應(schmid-grendelmeierp,cramerir.recombinantallergensforskintesting.intarchallergyimmunol2001;125:96-111)。以120例對屋塵螨粗提浸液皮試陽性的哮喘和/或鼻炎患者為研究對象，以大腸桿菌(escherichiacoli)、畢氏酵母(pichiapastoris)為工程菌生產的rderp1、rderf1、rderp2、rderp5、rblot5及其含有第1、2組份的組合體dm1、dm2進行皮膚試驗，并用elisa方法對患者derp1、derp2特異性ige進行定量檢測，重組變應原的濃度為5mg/ml和50mg/ml；皮膚試驗結果表明患者對第1組分、derp2和第5組份陽性率為78%、85%和48-55%，對dm1、dm2陽性率依次為95%、98%，dm1、dm2、屋塵螨粗提浸液皮膚反應的風團大小具有顯著相關性；皮膚試驗陽性反應強度與血清derp1、derp2特異性ige抗體含量具有較強的相關性。分別采用nderp1和rderp1進行皮膚試驗，二者風團大小顯著相關(r=0.73，p<0.0001)，同理nderf1和rderf1皮膚試驗風團大小正相關(r=0.87，p<0.0001)；此項研究也表明機體對重組變應原具有較好的耐受性，并未發生副反應，用于診斷哮喘和/或鼻炎安全、有效(kronqvistm,johanssone,whitleyp,olssons,gafveling,scheyniusa,vanhage-hamstenm.ahypoallergenicderivativeofthemajorallergenofthedustmitelepidoglyphusdestructor,lepd2.6cys,induceslessigereactivityandcellularresponseintheskinthanrecombinantlepd2.intarchallergyimmunol.2001;126:41-49.)。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種利用夜蛾細胞生產塵螨過敏原重組蛋白的方法，該方法通過實現塵螨過敏原derf1、derf2和derf4在昆蟲細胞中表達與純化，通過elisa驗證重組蛋白的免疫反應性，為制備塵螨重組變應原提供了一種新方法。

為實現上述發明目的。本發明的技術方案如下：

一種利用夜蛾細胞生產塵螨過敏原重組蛋白的方法，包括以下步驟：

11）質粒pfastbachta-derf1、pfastbachta-derf2、pfastbachta-derf4載體構建及鑒定：

分別以質粒pet28a(+)-derf1、pet28a(+)-derf2、pet28b(+)-derf4為模板，擴增目的基因derf1、derf2和derf4，pcr反應體系為：5μl10×lapcrbuffer、0.5μltakarapyrobest?dnapolymerase、8μldntp、1μl上游引物f、1μl下游引物r、0.5μl質粒pet28a(+)-derf1或pet28a(+)-derf2或pet28a(+)-derf4、34μlddh2o，總反應體積為50μl；

反應條件為：94℃變性2min后進入循環，循環參數為94℃30s、55℃30s、72℃2min，循環數為30；循環后72℃延伸10min，電泳鑒定擴增產物的大小；瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段derf1或derf2或derf4；取pfastbachta質粒()進行雙酶切，電泳膠回收后，分別與derf1或derf2或derf4連接得重組質粒pfastbachta-derf1、pfastbachta-derf2、pfastbachta-derf4，將此質粒轉化感受態細胞top10，涂lb平板，次日用藍白斑篩選法挑選發生重組的白色克隆，pcr驗證。

12）重組桿狀病毒質粒轉座及重組bacmid鑒定：

將重組質粒pfastbachta-derf1、pfastbachta-derf2、pfastbachta-derf4分別轉化大學桿菌dh10bac，涂lb平板(k+，tet+，gen+，x-gal，iptg)，37℃培養。48h后，挑白色單克隆再轉涂另一平板(k+，tet+，gen+，x-gal，iptg)，37℃培養；48h后挑白色單克隆2個，搖菌，并抽提bacmid，用pcr驗證，上游引物為derf1“ctggggtgatagcggatac”、derf2“ggtgttttggcttgcgc”、derf4“ctgtctgacatctacgttgg”，下游引物為m13r。

13）重組bacmid轉染及重組病毒擴增：

取抽提的bacmiddna轉染昆蟲細胞sf9，約4~6后收病毒，離心棄細胞碎片，取上清加至2%fbs，避光保存，此命名為p1viralstock；以p1virusstock在10cmdish中感染sf9細胞，約4~6天收病毒，命名為p2viralstock。以p2viralstock感染搖瓶中懸浮培養的sf9細胞，4天后收病毒。

14）重組蛋白純化：

上述轉染后第3代細胞培養物，置室溫經4000g、10min離心收集昆蟲細胞，加入1.5ml平衡buffer重懸，置冰上，使用超聲波破碎儀破碎(超3second停3second，200w，5個循環)；然后置4℃13000rpm離心30min，取上清和破碎后的沉淀，分別用50μl的鎳柱進行純化，過程包括平衡、上樣、洗雜、洗脫，(1)平衡，即用1ml的平衡buffer(50mmpbs、0.3mnacl、10mm咪唑5%甘油，ph8.0)平衡50μl的鎳柱，離心棄去上清；(2)上樣：上清樣品加入到50μl的鎳柱，4℃混勻孵育2h，離心收集流穿；(3)洗雜：加入500μl洗雜buffer(50mmpbs、0.3mnacl、20mm咪唑、5%甘油，ph8.0)洗雜，重復洗3次；(4)洗脫：加入100μl洗脫buffer(50mmpbs、0.3mnacl、250mm咪唑、5%甘油，ph8.0)洗脫，混勻孵育10min，離心收集洗脫產物。結束后，取破碎沉淀、破碎上清、流穿、洗脫進行sds-page電泳檢測。

進一步的，在所述步驟11）之前還需設計引物：根據已公布的核酸序列分別設計derf1(genbankaccessionno.eu095368)、derf2(genbankaccessionno.fj436110)、derf4(genbankaccessionno.kj400030)引物，其長度分別為963bp、441bp、1578bp。

一種上述重組蛋白復性的方法，包括以下步驟：

收集洗脫獲得的目的蛋白，使用0.22μm的膜過濾后，用截流量為10kd的millipor超濾管進行濃縮；然后用50mmpbs、0.3mnacl、10mm咪唑5%甘油，ph8.0的buffer稀釋4倍，然后置4℃混勻4h，然后對pbs5%甘油ph7.4的buffer徹底透析；復性好的目的蛋白使用0.22μm的膜過濾后，使用截流量為10kd的millipore超濾管進行濃縮，濃縮后分裝保存。

一種驗證上述重組蛋白的免疫反應性的方法，包括以下步驟：

收集純化獲得的產物，復性后，以此重組蛋白為包被抗原，建立elisa方法檢測其與哮喘患兒血清的陽性結合率；elisa檢測操作流程為：①配制抗原包被液：吸取重組蛋白溶解在0.1mpbs緩沖液中，終濃度為1μg/ml，制成包被溶液；②抗原包被：每孔包被100μl，包被溫度：2-8℃過夜，包被時間：不少于15小時；③配制pbst洗液后洗板，每孔液量300μl，洗2次，拍干；④配制封閉液后進行封閉，每孔加封閉液300μl，封閉溫度為37℃，封閉時間2小時；洗板5次，拍干；⑤血清按照1：4的比例稀釋（樣本稀釋液稀釋），加入100μl/孔，4℃過夜；⑥pbst洗滌5次，拍干；⑦鼠抗人ige-hrp（二抗）：1∶5000倍稀釋，每孔100μl，37℃溫育1h；⑧用pbst洗滌5次，拍干；⑨加入底物顯色溶液，每孔100μl，避光顯色15min；⑩加入終止液，50μl/孔，酶標儀測定od405值；同一份血清與同一重組過敏原測定三次，計算（平均值±sd）；以此elisa方法檢測陰性血清的od值，以其（平均值±3sd）為閾值，高于此值者即為陽性。

本發明的一種利用夜蛾細胞生產塵螨過敏原重組蛋白及驗證方法，通過實現塵螨過敏原derf1、derf2和derf4在昆蟲細胞中表達與純化，通過elisa驗證重組蛋白的免疫反應性，該方法獲得的重組蛋白純度高，復性好，能夠更精確地實現對環境中塵螨過敏原的檢測，醫療和實用價值很高，為定量監測環境中塵螨過敏原含量提供了重要的方法途徑。

附圖說明

圖1為重組質粒pfastbachta-derf1、pfastbachta-derf2、pfastbachta-derf4的pcr驗證結果圖；

圖2為sds-page電泳檢測ni離子親和層析純化結果圖；

圖3為以rderf1為包被抗原用elisa檢測其ige結合率結果圖；

圖4為以rderf2為包被抗原用elisa檢測其ige結合率結果圖；

圖5為以rderf4為包被抗原用elisa檢測其ige結合率結果圖。

具體實施方式

下面結合附圖，對本發明提出的一種利用夜蛾細胞生產塵螨過敏原重組蛋白及驗證方法進行詳細說明。

在一個具體的實施例中，本發明的一種利用夜蛾細胞生產塵螨過敏原重組蛋白及驗證方法包括以下步驟：

1.材料與方法

1.1質粒、菌株、試劑

大腸桿菌dh10bac感受態細胞、pfastbachta質粒。

質粒pet28a(+)-derf1、pet28a(+)-derf2、pet28b(+)-derf4為本室保存。

血清：哮喘患兒血清樣本由南京醫科大學附屬南京兒童醫院提供。變應原特異性ige檢測采用德國mediwiss公司生產的敏篩（allergyscreen）變應原檢測系統，由德國mediwiss公司生產的rapidreader（model:read100）專用閱讀儀，配套漢化軟件，孵育暗盒和固定頻率的混勻儀組成，致敏原診斷試劑盒由德國mediwissanalyticgmbh。以血清總ige>200iu/ml，粉塵螨特異性ige陽性、濃度分級均大于2級為標準篩選得27份血清。陰性血清入選標準：患者既過敏史，體檢正常，血清總ige<100iu/ml，濃度分級均為0級，篩選獲得5份陰性血清。

1.2重組蛋白及驗證的方法

1.2.1引物設計

根據已公布的核酸序列分別設計derf1(genbankaccessionno.eu095368)、derf2(genbankaccessionno.fj436110)、derf4(genbankaccessionno.kj400030)引物，其長度分別為963bp、441bp、1578bp。

表1.pcr擴增時引物序列

1.2.2重組質粒pfastbachta-derf1、pfastbachta-derf2、pfastbachta-derf4載體構建及鑒定

分別以質粒pet28a(+)-derf1、pet28a(+)-derf2、pet28b(+)-derf4為模板，擴增目的基因derf1、derf2和derf4，pcr反應體系為：5μl10×lapcrbuffer、0.5μltakarapyrobest?dnapolymerase、8μldntp、1μl上游引物f、1μl下游引物r、0.5μl質粒pet28a(+)-derf1或pet28a(+)-derf2或pet28a(+)-derf4、34μlddh2o，總反應體積為50μl。反應條件為：94℃變性2min后進入循環，循環參數為94℃30s、55℃30s、72℃2min，循環數為30。循環后72℃延伸10min，電泳鑒定擴增產物的大小。瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段derf1或derf2或derf4。取pfastbachta質粒()進行雙酶切，電泳膠回收后，分別與derf1或derf2或derf4連接得重組質粒pfastbachta-derf1、pfastbachta-derf2、pfastbachta-derf4，將此質粒轉化感受態細胞top10，涂lb平板，次日用藍白斑篩選法挑選發生重組的白色克隆，pcr驗證。

1.2.3重組桿狀病毒質粒轉座及重組bacmid鑒定

將重組質粒pfastbachta-derf1、pfastbachta-derf2、pfastbachta-derf4分別轉化大學桿菌dh10bac，涂lb平板(k⁺，tet⁺，gen⁺，x-gal，iptg)，37℃培養。48h后，挑白色單克隆再轉涂另一平板(k⁺，tet⁺，gen+，x-gal，iptg)，37℃培養。48h后挑白色單克隆2個，搖菌，并抽提bacmid，用pcr驗證，上游引物為derf1“ctggggtgatagcggatac”、derf2“ggtgttttggcttgcgc”、derf4“ctgtctgacatctacgttgg”，下游引物為m13r。

1.2.4重組bacmid轉染及重組病毒擴增

取抽提的bacmiddna轉染昆蟲細胞sf9，約4~6后收病毒，離心棄細胞碎片，取上清加至2%fbs，避光保存，此命名為p1viralstock。以p1virusstock在10cmdish中感染sf9細胞，約4~6天收病毒，命名為p2viralstock。以p2viralstock感染搖瓶中懸浮培養的sf9細胞，4天后收病毒。

1.2.5重組蛋白純化

取上述轉染后第3代細胞培養物，置室溫經4000g、10min離心收集昆蟲細胞，加入1.5ml平衡buffer重懸，置冰上，使用超聲波破碎儀破碎(超3second停3second，200w，5個循環)。然后置4℃13000rpm離心30min，取上清和破碎后的沉淀，分別用50μl的鎳柱進行純化，過程包括平衡、上樣、洗雜、洗脫，(1)平衡，即用1ml的平衡buffer(50mmpbs、0.3mnacl、10mm咪唑5%甘油，ph8.0)平衡50μl的鎳柱，離心棄去上清；(2)上樣：上清樣品加入到50μl的鎳柱，4℃混勻孵育2h，離心收集流穿；(3)洗雜：加入500μl洗雜buffer(50mmpbs、0.3mnacl、20mm咪唑、5%甘油，ph8.0)洗雜，重復洗3次；(4)洗脫：加入100μl洗脫buffer(50mmpbs、0.3mnacl、250mm咪唑、5%甘油，ph8.0)洗脫，混勻孵育10min，離心收集洗脫產物。結束后，取破碎沉淀、破碎上清、流穿、洗脫進行sds-page電泳檢測。

1.2.6重組蛋白復性

收集洗脫獲得的目的蛋白，使用0.22μm的膜過濾后，用截流量為10kd的millipor超濾管進行濃縮。然后用50mmpbs、0.3mnacl、10mm咪唑5%甘油，ph8.0的buffer稀釋4倍，然后置4℃混勻4h，然后對pbs5%甘油ph7.4的buffer徹底透析。復性好的目的蛋白使用0.22μm的膜過濾后，使用截流量為10kd的millipore超濾管進行濃縮，濃縮后分裝保存。

1.2.7elisa驗證重組蛋白的免疫反應性

收集純化獲得的產物，復性后，以此重組蛋白為包被抗原，建立elisa方法檢測其與哮喘患兒血清的陽性結合率。elisa檢測操作流程為：①配制抗原包被液：吸取重組蛋白溶解在0.1mpbs緩沖液中，終濃度為1μg/ml，制成包被溶液。②抗原包被：每孔包被100μl，包被溫度：2-8℃過夜，包被時間：不少于15小時。③配制pbst洗液后洗板，每孔液量300μl，洗2次，拍干。④配制封閉液后進行封閉，每孔加封閉液300μl，封閉溫度為37℃，封閉時間2小時。洗板5次，拍干。⑤血清按照1：4的比例稀釋（樣本稀釋液稀釋），加入100μl/孔，4℃過夜。⑥pbst洗滌5次，拍干。⑦鼠抗人ige-hrp（二抗）：1∶5000倍稀釋，每孔100μl，37℃溫育1h。⑧用pbst洗滌5次，拍干。⑨加入底物顯色溶液，每孔100μl，避光顯色15min。⑩加入終止液，50μl/孔，酶標儀測定od405值。同一份血清與同一重組過敏原測定三次，計算（平均值±sd）。以此elisa方法檢測陰性血清的od值，以其（平均值±3sd）為閾值，高于此值者即為陽性。

2.上述重組蛋白結果

2.1重組質粒pfastbachta-derf1、pfastbachta-derf2、pfastbachta-derf4載體構建及鑒定

以本室保存的質粒pet28a(+)-derf1、pet28a(+)-derf2、pet28b(+)-derf4為為模板，pcr擴增獲得目的基因derf1、derf2、derf4后，分別與pfastbachta載體連接，pcr驗證，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

2.2重組蛋白純化及sds-page鑒定

組質粒分別轉化大腸桿菌dh10bac，涂lb平板，篩選陽性克隆后，抽提bacmid，轉染sf9細胞，經三代培養后，收集昆蟲細胞，超聲波破碎，經鎳親和層樣柱純化，sds-page電泳驗證結果見下圖，與預期結果一致。根據生物學信息學軟件預測，derf1、derf2、derf4相對分子質量分別為34.469kda、14.076kda、57.8575kda。sds-page電泳檢測ni離子親和層析純化結果如圖2所示。

2.3重組蛋白的反應性

如圖3所示，以rderf1為包被抗原用elisa檢測其ige結合率，經粉塵螨粗提浸液皮膚挑刺試驗陰性的5例健康體檢合者od值為(0.577)，以其（平均值±3sd=0.577+3*0.090）為閾值，其臨界值（cut-offvalue）為0.848，高于此值者判為ige陽性，據此推測本組約23（85.2%）例塵螨過敏性哮喘患者因第1組分致敏引起。

如圖4所示，以rderf2為包被抗原用elisa檢測其ige結合率，經粉塵螨粗提浸液皮膚挑刺試驗陰性的5例健康體檢合者od值為(0.673)，以其（平均值±3sd=0.673+3*0.092）為閾值，其臨界值（cut-offvalue）為0.949，高于此值者判為ige陽性，據此推測本組約24(88.9%)例塵螨過敏性哮喘患者因第2組分致敏引起。

如圖5所示，以rderf4為包被抗原用elisa檢測其ige結合率，經粉塵螨粗提浸液皮膚挑刺試驗陰性的5例健康體檢合者od值為(1.246)，以其（平均值±3sd=1.246+3*0.085）為閾值，其臨界值（cut-offvalue）為1.502，高于此值者判為ige陽性，據此推測本組約12(44.4%)例塵螨過敏性哮喘患者因第4組分致敏引起。

表2.elisa法檢重組蛋白rderf1、rderf2和rderf4與血清ige結合反應情況

本發明具體應用途徑很多，以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護范圍。