本發(fā)明屬于蚊濃核病毒
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及白紋伊蚊濃核病毒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蚊媒傳染病是以蚊蟲(chóng)為媒介傳播的疾病，包括瘧疾、絲蟲(chóng)病、登革熱、流行性乙型腦炎、黃熱病等。蚊媒病流行范圍廣，傳播力強(qiáng)，發(fā)病率高，盡管經(jīng)過(guò)了幾個(gè)世紀(jì)的努力防制，蚊媒傳播的疾病仍然在世界各地繁榮。全球每年有上億人感染瘧疾，瘧疾每年致使100多萬(wàn)兒童的死亡，主要在非洲撒哈拉以南。登革熱的主要傳播媒介是白紋伊蚊和埃及伊蚊，在過(guò)去幾十年中，隨著其傳播媒介的全球性擴(kuò)散，傳播范圍也逐漸擴(kuò)大，埃及伊蚊(Aedesaegypti)回到其在20世紀(jì)中期被消滅的區(qū)域并引起廣泛流行的出血熱，而白紋伊蚊則起源于東南亞。西尼羅河病毒在過(guò)去10年間在整個(gè)美洲已成為流行病，而基孔肯雅病毒已經(jīng)出現(xiàn)在印度洋盆地和亞洲大陸，影響到數(shù)百萬(wàn)人。日本腦炎病毒也在印度次大陸和澳大拉西亞擴(kuò)散，主要影響幼兒。我國(guó)已知蚊類(lèi)18個(gè)屬、371個(gè)種和亞種，涵蓋瘧疾、登革熱、乙型腦炎、絲蟲(chóng)病的主要媒介。蚊媒傳染病的流行嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康，影響社會(huì)的穩(wěn)定，阻礙經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。限制蚊蟲(chóng)病在流行地區(qū)的影響的努力面臨著控制蚊子數(shù)量和提供有效的公共衛(wèi)生干預(yù)的雙重挑戰(zhàn)。媒介蚊蟲(chóng)防制是控制蚊媒傳染病流行的重要措施。目前，對(duì)于登革熱、黃熱病、西尼羅病毒病等蚊媒性病毒傳染病尚無(wú)特效治療方法或特異性預(yù)防手段，媒介控制在預(yù)防其發(fā)生和流行方面的重要性就顯得更加突出，而尋求有效的控制方法則成為世界醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題。媒介化學(xué)防制由于其突出的效果在蚊媒防制中一度占有統(tǒng)治地位，但是隨著傳統(tǒng)上的化學(xué)防制所造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，易引起蚊蟲(chóng)藥物抗性產(chǎn)生等弊端的日益顯現(xiàn)，蚊蟲(chóng)的生物防制愈來(lái)愈受到人們的青睞。生物防制主要應(yīng)用蚊蟲(chóng)病原體、寄生物、捕食物來(lái)達(dá)到防治效果，對(duì)非目標(biāo)生物和有益生物無(wú)害，不污染環(huán)境，蚊蟲(chóng)對(duì)其不易產(chǎn)生抗性。蚊濃核病毒(mosquitodensovirus，MDV)屬細(xì)小病毒科(Parvovirinae)濃核病毒屬，是單正鏈DNA病毒，病毒衣殼無(wú)包被，直徑為20nm的正二十面體結(jié)構(gòu)。蚊濃核病毒的基因組長(zhǎng)4000nt左右，由左側(cè)的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2編碼區(qū)與右側(cè)的結(jié)構(gòu)蛋白VP編碼區(qū)，以及兩端的重復(fù)序列(invertedrepeatsequences，IRS)組成。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的作用主要是輔助病毒復(fù)制，激活結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄。結(jié)構(gòu)蛋白VP是病毒的衣殼蛋白IRS則作為病毒復(fù)制起始位點(diǎn)與包裝信號(hào)。MDV是一類(lèi)特異性感染蚊類(lèi)的病原，感染蚊類(lèi)后引起宿主特征性的細(xì)胞核致密增生病變(densonucleosis)嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致宿主發(fā)病或死亡。人們相繼從自然界中的埃及伊蚊、白紋伊蚊、微小按蚊等多種蚊類(lèi)以及多種實(shí)驗(yàn)室蚊細(xì)胞系/實(shí)驗(yàn)室株中相繼分離到該類(lèi)病毒，目前共分離得到20余株，約60％從野外種群分離得到。其宿主特異性強(qiáng)，僅感染蚊類(lèi)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其不能感染其它種類(lèi)昆蟲(chóng)、魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。MDV在高滴度情況下對(duì)白紋伊蚊個(gè)體有致死效應(yīng)，在低濃度情況下，對(duì)蚊蟲(chóng)個(gè)體具有亞致死效應(yīng)，包括延長(zhǎng)白紋伊蚊幼蟲(chóng)的幼蟲(chóng)期，延長(zhǎng)化蛹時(shí)間，延長(zhǎng)羽化時(shí)間等。蚊蟲(chóng)孳生水體中的病毒可入侵蚊蟲(chóng)脂肪體、成蟲(chóng)盤(pán)、氣管周?chē)?xì)胞、馬氏管等多種組織器官。蚊幼蟲(chóng)感染MDV后活動(dòng)力大大降低，畸變，受到刺激后痙攣性抽搐，部分死亡。幸存幼蟲(chóng)成蛹與羽化時(shí)間延遲，易于蛻皮時(shí)死亡。病毒感染后成蚊的壽命會(huì)縮短，從而減少蚊傳播病原的機(jī)會(huì)，而感染后的雌蚊產(chǎn)卵率及所產(chǎn)卵的活力也都大為下降。病毒不僅可以經(jīng)由幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)水平傳播，還可以由雌蚊垂直傳播，從而使病毒可播散到各種孳生水體并在自然界中不斷延續(xù)。蚊濃核病毒MDV的宿主特異性，生物安全性等病原學(xué)特點(diǎn)使其具有蚊蟲(chóng)防制的潛在價(jià)值與其它種類(lèi)病原不能比擬的優(yōu)勢(shì)，有作為高效的蚊類(lèi)生物殺蟲(chóng)劑的應(yīng)用前景，具有在蚊媒傳染病防控方面的潛在價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種白紋伊蚊濃核病毒和其制備方法及其在制備生物殺蚊劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種白紋伊蚊濃核病毒，其名稱(chēng)為白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO.V201652。該病毒白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6是由南方醫(yī)科大學(xué)顧金保副教授等首次由廣州野外捕獲的白紋伊蚊分離得到，并對(duì)其體外細(xì)胞培養(yǎng)，形態(tài)結(jié)構(gòu)，安全性等方面進(jìn)行了深入研究，病毒基因組結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。本發(fā)明還提供了上述白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6的全序列，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，該序列包含有白紋伊蚊濃核病毒的反向重復(fù)序列ITR，兩種非結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列NS1和NS2，以及一種結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列VP。上述白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6的制備方法包括培養(yǎng)所述細(xì)胞系增殖蚊濃核病毒AalDV-6株和飼養(yǎng)蚊幼蟲(chóng)增殖蚊濃核病毒AalDV-6。其中大量飼養(yǎng)蚊幼蟲(chóng)的方法培養(yǎng)增殖蚊濃核病毒可以較大地提高病毒產(chǎn)量，降低病毒生產(chǎn)的成本，操作也相對(duì)簡(jiǎn)便。具體地，所述的蚊細(xì)胞系培養(yǎng)增殖的方法為：(1)將白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6(本發(fā)明分離獲得的)接種于易感蚊細(xì)胞系，并培養(yǎng)接種后的細(xì)胞，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物；(2)將步驟(1)中的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融多次，離心后，收集上清液即是蚊濃核病毒AalDV-6懸液。步驟(2)中優(yōu)選將步驟(1)中的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，離心優(yōu)選3750轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。其中易感細(xì)胞可以是傳代細(xì)胞系，也可以是原代細(xì)胞。適合于蚊濃核病毒的易感細(xì)胞包括但不限于白紋伊蚊C6/36細(xì)胞系(ATCC編號(hào)：CRL-1660)、埃及伊蚊aag2細(xì)胞等傳代細(xì)胞系；原代細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，用蚊幼蟲(chóng)或其組織進(jìn)行分離和制備。所述易感細(xì)胞，是指適合于蚊濃核病毒感染和增殖的易感細(xì)胞。包括但不限于白紋伊蚊C6/36細(xì)胞，埃及伊蚊aag2細(xì)胞等蚊類(lèi)傳代細(xì)胞系。所述飼養(yǎng)幼蟲(chóng)制備蚊濃核病毒的方法為：(1)每組將約200只易感蚊蟲(chóng)暴露于108個(gè)/毫升的蚊濃核病毒AalDV-6中(來(lái)源于蚊濃核病毒AalDV-6懸液)，并飼養(yǎng)感染的蚊幼蟲(chóng)，收集死亡幼蟲(chóng)，7天后收集全部幼蟲(chóng)；(2)將步驟(1)中獲得的幼蟲(chóng)用1毫升PBS研磨，3750轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，上清用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，濾液即是蚊濃核病毒懸液。所述易感蚊蟲(chóng)，是指適合于感染蚊濃核病毒的易感蚊蟲(chóng)。包括但不限于白紋伊蚊、埃及伊蚊、致倦庫(kù)蚊等蚊幼蟲(chóng)。進(jìn)一步的上述白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6的制備方法包括以下步驟：(1)病毒感染幼蟲(chóng)將剛蛻皮的白紋伊蚊幼蟲(chóng)置于蚊濃核病毒AalDV-6(本發(fā)明分離獲得的)中，24小時(shí)后，再改用龜糧飼養(yǎng)，病毒感染幼蟲(chóng)后在體內(nèi)逐漸增殖；(2)病毒分離飼養(yǎng)過(guò)程中，每天收集死亡幼蟲(chóng)的尸體，低溫保存，將全部幼蟲(chóng)用PBS研磨，離心后，上清液采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，吸取50μL提取DNA并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)病毒進(jìn)行定量，其余低溫保藏，即獲得含有蚊濃核病毒AalDV-6的懸液。步驟(1)～(2)飼養(yǎng)條件優(yōu)選為恒溫28±1℃，濕度為70％～80％，一天中光照和黑暗各12h。步驟(1)中優(yōu)選將剛蛻皮的約200只白紋伊蚊幼蟲(chóng)加入200毫升108個(gè)/毫升濃度的蚊濃核病毒AalDV-6中。步驟(2)中優(yōu)選7天后，全部幼蟲(chóng)用1毫升PBS研磨，3750轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，上清液采用0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌。上述病毒濃度定量的方法，采用本領(lǐng)域公知的實(shí)時(shí)定量熒光PCR絕對(duì)定量的方法，可以按照實(shí)施例2中敘述的SYBRGreen法，亦可采用Taqman探針?lè)ā?shí)施例2的方法中采用引物如下：正向引物：5’-CAGGAGGAAACAGCACAAGA-3’，反向引物：5’-GTTTCGATACCGTAACGGATGC-3’，退火溫度為55℃，熒光定量PCR反應(yīng)體系的配制如下：2SuperRealGreenPreMixPlus10μL模板1μL正向引物(10μm)0.6μL反向引物(10μm)0.6μL50ROXReferenceDye0.4μLRNase-free7.4μL熒光定量PCR儀采用life公司的ABI7500，反應(yīng)程序如下：上述白紋伊蚊濃核病毒在制備生物殺蚊劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種生物殺蚊劑，其包括白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6，將白紋伊蚊幼蟲(chóng)暴露于1010個(gè)/毫升的白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6，白紋伊蚊的半數(shù)致死時(shí)間LT50為11.54天。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明提供的白紋伊蚊濃核病毒是一種只感染蚊蟲(chóng)的病毒，而不能感染其它種類(lèi)昆蟲(chóng)、魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物，而病毒具有高度的寄生性，完全依賴(lài)宿主細(xì)胞的能量和代謝系統(tǒng)，獲取生命活動(dòng)所需的物質(zhì)和能量。(2)本發(fā)明中的白紋伊蚊濃核病毒離開(kāi)宿主細(xì)胞，它只是一個(gè)大化學(xué)分子，停止活動(dòng)，可制成蛋白質(zhì)結(jié)晶，為一個(gè)非生命體，只有遇到蚊類(lèi)及其細(xì)胞才會(huì)通過(guò)吸附、進(jìn)入、復(fù)制、裝配、釋放子代病毒而顯示典型的生命體特征，根據(jù)該特點(diǎn)表明了其安全性，并且相比于其他種類(lèi)諸如細(xì)菌真菌開(kāi)發(fā)的生物殺蚊劑，對(duì)儲(chǔ)存運(yùn)輸過(guò)程中的溫度、時(shí)間等條件要求更低，運(yùn)輸和儲(chǔ)存成本更低。(3)隨著登革熱、寨卡熱以及基孔肯雅熱等蚊媒傳染病毒的流行，蚊蟲(chóng)對(duì)于化學(xué)殺蟲(chóng)劑抗藥性增強(qiáng)的問(wèn)題逐漸凸顯，新型蚊媒控制方法的發(fā)明顯得尤為重要，而本發(fā)明中的蚊濃核病毒就可開(kāi)發(fā)成為一類(lèi)高效安全的生物殺蚊劑。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例2中感染蚊濃核病毒AalDV-67天內(nèi)C6/36細(xì)胞內(nèi)的增殖情況；圖2是實(shí)施例3中蚊濃核病毒AalDV-6在白紋伊蚊幼蟲(chóng)體內(nèi)和孳生水體中的增殖情況；圖3是實(shí)施例4中C6/36細(xì)胞培養(yǎng)后純化的蚊濃核病毒AalDV-6的電鏡照片；圖4是實(shí)施例5中蚊濃核病毒AalDV-6基因組，其中AalDV-6基因組全長(zhǎng)3961nt，編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，以及一種結(jié)構(gòu)蛋白VP，病毒基因組兩側(cè)為末端重復(fù)序列(Invertedterminalrepeatsequence，ITR)；圖5是實(shí)施例6中蚊濃核病毒AalDV-6在1010個(gè)病毒/毫升的劑量下，白紋伊蚊的累積死亡率。具體實(shí)施方式本發(fā)明在下述各實(shí)施例中被給予了具體的說(shuō)明。這些實(shí)施例都是說(shuō)明性的，并不在任何方面限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。定義：“編碼序列”在本申請(qǐng)中是指一種DNA序列，其能夠被轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的RNA序列?！癐TR”在本申請(qǐng)中是指病毒基因組兩側(cè)的末端反向重復(fù)序列，具有ITR結(jié)構(gòu)是細(xì)小病毒科的特征之一，該結(jié)構(gòu)具有調(diào)控病毒基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、病毒拯救等多種功能?！癗S1和NS2”在本申請(qǐng)中指的是病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1和2，該結(jié)構(gòu)主要起到輔助病毒轉(zhuǎn)錄，包裝等作用。“VP”在本申請(qǐng)中指的是病毒結(jié)構(gòu)蛋白，該結(jié)構(gòu)主要表達(dá)病毒的衣殼。“載體”在本申請(qǐng)中是指人工構(gòu)建的，用于克隆的重組質(zhì)粒?！癆alDV-6”在本申請(qǐng)中是指一株從白紋伊蚊體內(nèi)分離得到的蚊濃核病毒，由于現(xiàn)在全世界范圍內(nèi)報(bào)導(dǎo)的，在白紋伊蚊的體內(nèi)或者白紋伊蚊C6/36細(xì)胞系內(nèi)分離得到了5株蚊濃核病毒，故而目前本發(fā)明中分離獲得的株病毒是由白紋伊蚊分離得到的第六株病毒，根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)2015年頒布的病毒分類(lèi)命名規(guī)則將該株病毒命名為AalDV-6，該病毒在中國(guó)典型微生物保藏中心的保藏號(hào)是CCTCCV201652?！癓T50”在本申請(qǐng)中是指每組中半數(shù)數(shù)量蚊蟲(chóng)死亡的時(shí)間。實(shí)施例1蚊濃核病毒AalDV-6的分離與鑒定材料與方法：白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6(AedesalbopictusdensovirusAalDV-6)，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號(hào)：CCTCCV201652。保藏日期：2016年11月29日，保藏地點(diǎn)：中國(guó)武漢，武漢大學(xué)。本實(shí)驗(yàn)所用的0.01mM的pH7.2磷酸鹽緩沖液PBS購(gòu)自美國(guó)life生物科技有限公司，病毒基因組提取試劑盒TaKaRaminiBESTViralRNA/DNAExtractionKit購(gòu)自Takara公司，ThermoScientificMaximaHotStartGreenPCRMasterMix酶購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司，T載體購(gòu)自Promega公司，Trans1-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司，引物合成和DNA測(cè)序均在上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。廣州野外捕捉的白紋伊蚊以20只為一組，分別用2mLPBS緩沖液進(jìn)行研磨，3750轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集上清，0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌，取100μL上清提取病毒基因組，在蚊濃核病毒中保守的NS1編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)蚊濃核病毒，引物采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NCBI的引物設(shè)計(jì)工具Primer-blast進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物序列為：正向引物：5’-CAGGAGGAAACAGCACAAGA-3’，反向引物：5’-GTTTCGATACCGTAACGGATGC-3’反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃，退火55℃，延伸72℃,延伸時(shí)間為15秒。含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為150bp左右，將PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣本的PCR產(chǎn)物，純化回收，連接T載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定之后，提交上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序。各樣本PCR檢測(cè)后，得到一個(gè)陽(yáng)性樣本，PCR產(chǎn)物連接T載體后經(jīng)公司測(cè)序，與NCBI上已發(fā)現(xiàn)的濃核病毒進(jìn)行blast，發(fā)現(xiàn)其與已發(fā)現(xiàn)的蚊濃核病毒序列相似。實(shí)施例2白紋伊蚊濃核病毒-6在白紋伊蚊C6/36細(xì)胞內(nèi)增殖情況材料與方法：本實(shí)驗(yàn)所用的病毒基因組提取試劑盒TaKaRaminiBESTViralRNA/DNAExtractionKit購(gòu)自Takara公司，EcoRV限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自ThermoFisher公司，SuperRealPreMixPlus購(gòu)自北京天根生物科技有限公司。C6/36細(xì)胞傳代至25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，24h后細(xì)胞覆蓋度約70～90％，將培養(yǎng)基棄掉，1mL28℃預(yù)熱的PBS漂洗細(xì)胞一次，加入實(shí)施例1中檢測(cè)到的AalDV-6，補(bǔ)足含有5％胎牛血清的1640培養(yǎng)基至5mL，置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天收集200μL細(xì)胞懸液，-80℃儲(chǔ)存，持續(xù)到第7天。剩余細(xì)胞懸液反復(fù)凍融3次，4℃3750轉(zhuǎn)離心10分鐘，上清轉(zhuǎn)移至新的15mL離心管，用于實(shí)施例4中電鏡觀察病毒形態(tài)。由于MDV屬DNA病毒，DnaseI除去病毒混合液中未包裝入病毒顆粒的DNA后，病毒液用TaKaRaminiBESTViralRNA/DNA病毒基因組提取試劑盒進(jìn)行提取，50μL無(wú)酶水洗脫，具體操作參見(jiàn)試劑說(shuō)明書(shū)。熒光定量PCR檢測(cè)病毒的濃度，qPCR引物如下：正向引物：5’-CAGGAGGAAACAGCACAAGA-3’，反向引物：5’-GTTTCGATACCGTAACGGATGC-3’熒光定量PCR反應(yīng)體系的配制：2SuperRealGreenPreMixPlus10μL模板1μL正向引物(10μm)0.6μL反向引物(10μm)0.6μL50ROXReferenceDye0.4μLRNase-free7.4μL將實(shí)施例1中連接PCR產(chǎn)物的T載體為模板，EcoRV進(jìn)行單酶切，回收的線性質(zhì)粒測(cè)定濃度，計(jì)算出回收產(chǎn)物中每微升線性質(zhì)粒的拷貝數(shù)，計(jì)算公式如下，拷貝數(shù)＝(DNA質(zhì)量×6.022×1023)/(模板DNA的長(zhǎng)度×1×109×660)，公式中DNA質(zhì)量為qPCR中標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，模板DNA長(zhǎng)度為標(biāo)準(zhǔn)品的長(zhǎng)度。以倍率為10依次進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)x取其中5個(gè)點(diǎn)作為病毒絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)病毒液中病毒的總拷貝數(shù)。反應(yīng)程序如下：病毒濃度根據(jù)下列公式求得：病毒濃度(個(gè)/毫升)＝拷貝數(shù)×50μL/(200μL×10-3mL)，公式中50μL為提取病毒基因組時(shí)的洗脫體積，200μL指的是提取基因組的病毒懸液體積。結(jié)果見(jiàn)圖1，C6/36中加入AalDV-6后，從第1天的1.34×109個(gè)/毫升開(kāi)始，病毒濃度呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，第5天達(dá)到最高的9.32×109個(gè)/毫升，與第1天相比病毒濃度升高了5.96倍，說(shuō)明AalDV-6感染C6/36細(xì)胞后，能夠在C6/36細(xì)胞內(nèi)增殖，5天后，細(xì)胞開(kāi)始老化，病毒濃度開(kāi)始下降。實(shí)施例3白紋伊蚊濃核病毒-6在白紋伊蚊體內(nèi)和孳生水體中的增殖情況材料與方法：本實(shí)驗(yàn)所用的TaKaRaminiBESTViralRNA/DNAExtractionKit，SuperRealPreMixPlus購(gòu)自北京天根生物科技有限公司。取剛蛻皮的約1000只白紋伊蚊一齡幼蟲(chóng)以每200只分成一組，共五組，分別加入至2ml1010個(gè)/mL濃度的AalDV-6病毒中，用于感染后第1，3，6，9，12天白紋伊蚊幼蟲(chóng)體內(nèi)和孳生水體中病毒濃度的檢測(cè)。24小時(shí)后，加入除氯的水至200mL正常飼養(yǎng)。同時(shí)于取出其中一組，收集200微升水體用于孳生水體中病毒濃度的檢測(cè)。所有幼蟲(chóng)則用1mLPBS緩沖液研磨，3750轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，將上清通過(guò)0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌，取出50μL提取病毒基因組，用于檢測(cè)幼蟲(chóng)體內(nèi)病毒的濃度，其余病毒儲(chǔ)存于-80℃。感染1，3，6，9，12天后的樣品采集參照上述方法。結(jié)果如圖2所示，從圖2中可以看出，白紋伊蚊1齡幼蟲(chóng)感染AalDV-6后，病毒感染第一天就開(kāi)始侵入幼蟲(chóng)體內(nèi)，并且在幼蟲(chóng)體內(nèi)增殖，從第1天的1.86×1010個(gè)/毫升開(kāi)始，至第9天達(dá)到最高的1.65×1012個(gè)/毫升，病毒濃度升高了88.71倍，死亡的幼蟲(chóng)，尸體在水體中崩解或被其它幼蟲(chóng)蠶食，導(dǎo)致幼蟲(chóng)體內(nèi)的病毒釋放入水，水體中病毒濃度增高，從第1天的2.51×108個(gè)/毫升升高至第9天的3.65×1010個(gè)/毫升，病毒濃度升高了145.42倍，相比實(shí)施例2中白紋伊蚊C6/36細(xì)胞系生產(chǎn)病毒，白紋伊蚊一齡幼蟲(chóng)生產(chǎn)有著明顯的優(yōu)勢(shì)。無(wú)論在幼蟲(chóng)體內(nèi)還是孳生水體內(nèi)，病毒都有著更高的產(chǎn)量，其中幼蟲(chóng)體內(nèi)可以富集到更高的病毒可以達(dá)到1012個(gè)/毫升的級(jí)別。實(shí)施例4白紋伊蚊濃核病毒形態(tài)鑒定材料與方法：取實(shí)施例3中回收的病毒液，4℃35000轉(zhuǎn)/分鐘離心75分鐘沉淀病毒顆粒。沉淀的病毒用1M蔗糖緩沖液于4℃39000轉(zhuǎn)/分鐘離心120分鐘進(jìn)一步純化。加入氯化銫(0.3克/毫升)于8℃60000轉(zhuǎn)/分鐘離心過(guò)夜以密度梯度分離病毒，用來(lái)提取DNA和電鏡檢測(cè)。將純化的病毒顆粒用2％PTA負(fù)染色，PhilipsCM12電子顯微鏡下拍攝放大37000。結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖3中可以看出，分離提純后，電鏡下可觀察到大量直徑為22～25nm的二十面體病毒粒子，該病毒粒子表面光滑；少數(shù)的粒子中央可被負(fù)染色劑染色，說(shuō)明它的核酸已流出，為空的病毒衣殼。實(shí)施例5白紋伊蚊濃核病毒-5基因組序列測(cè)定材料與方法：病毒基因組提取試劑盒TaKaRaminiBESTViralRNA/DNAExtractionKit購(gòu)自Takara公司，T4DNAligase，PCRpurificationkit，klenow酶均購(gòu)自Thermofisher公司，TransStbl3化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；DNA測(cè)序交由上海英濰捷基生物科技有限公司。TaKaRaminiBESTViralRNA/DNAExtractionKit提取AalDV-6的基因組DNA。提取的AalDV-6DNA中加入10單位的klenow酶，常溫孵育15分鐘使DNA平末端化。將平末端化的DNA用PCRpurificationkit純化。含有卡那抗性的克隆載體pKMV質(zhì)粒則用EcoRV限制性?xún)?nèi)切酶酶切，將線性質(zhì)粒切膠回收。平末端化的AalDV-6DNA與線性質(zhì)粒pKMV用T4DNAligase酶連接，轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)Trans-Stbl3，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，引物采用M13F/M13R，引物序列如下：正向引物M13-F205'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'反向引物M13-Rev5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'挑選陽(yáng)性克隆，提交上海英濰捷基生物科技有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序，采用雙向測(cè)通。結(jié)果：菌落PCR鑒定后，得到陽(yáng)性克隆，使用M13-F20和M13-Rev進(jìn)行雙向測(cè)通。測(cè)序結(jié)果用DNAstar的Seqman工具進(jìn)行拼接得到AalDV-6的全序列如下(見(jiàn)序列表1)：對(duì)該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可知其基因組結(jié)構(gòu)與其他埃及伊蚊和白紋伊蚊細(xì)胞系或蚊類(lèi)種群中分離得到的相似，具有90％以上的同源性，表明此病毒是一株新的存在于蚊體內(nèi)的濃核病毒。編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，以及一種結(jié)構(gòu)蛋白VP，病毒基因組兩側(cè)為末端重復(fù)序列(Invertedterminalrepeatsequence，ITR)，其中AalDV-6基因組全長(zhǎng)3981nt(見(jiàn)圖4)。該菌株命名為白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6(AedesalbopictusdensovirusAalDV-6)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2016年11月29日，保藏編號(hào)為CCTCCNO.V201652，保藏地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)。實(shí)施例6白紋伊蚊濃核病毒-6殺蟲(chóng)劑毒力測(cè)試材料與方法：含白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6粒子按照實(shí)施例3中的方法，由AalDV-6以108個(gè)/毫升濃度感染白紋伊蚊一齡幼蟲(chóng)，7天后分離提取白紋伊蚊幼蟲(chóng)體內(nèi)的病毒而制備，根據(jù)qPCR絕對(duì)定量的方法可以精確測(cè)定AalDV-6的濃度。400只新孵化的一期幼蟲(chóng)，分為2組，分別為AalDV-6感染組與空白對(duì)照組。病毒處理組在除氯的自來(lái)水中加入含有病毒懸液使得AalDV-6病毒的為1010個(gè)/毫升，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，在沒(méi)有食物的情況下保持24h。加入龜糧飼養(yǎng)，并監(jiān)測(cè)幼蟲(chóng)數(shù)量直到化蛹，將蛹放入蚊籠中。每天記錄幼蟲(chóng)，蛹和成蟲(chóng)數(shù)量，實(shí)驗(yàn)在感染后28天結(jié)束。概率單位法計(jì)算白紋伊蚊半數(shù)致死時(shí)間LT50。結(jié)果見(jiàn)圖5，從圖5中可以看出，白紋伊蚊暴露于1010個(gè)/毫升的濃核病毒AalDV-6，第7天開(kāi)始進(jìn)入死亡高峰，觀察到28天，白紋伊蚊的死亡率達(dá)到96.5％。由SPSS22.0進(jìn)行概率單位法計(jì)算得到濃核病毒AalDV-6的半數(shù)致死時(shí)間為11.54天，95％置信區(qū)間為10.848～12.217。通過(guò)本發(fā)明在前面的詳細(xì)描述，對(duì)于那些本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的修改和變化將是顯而易見(jiàn)的，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本發(fā)明的方法和儀器可以進(jìn)行眾多修飾。這些修改和變化都通過(guò)權(quán)利要求書(shū)被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。<110>陳曉光顧金保<120>白紋伊蚊濃核病毒及其應(yīng)用<210>1<211>3981<212>DNA<221>白紋伊蚊濃核病毒AalDV-6的全序列<400>1tataagtccatattccatataagaaatattatttcgtgatacggatactgtaagatacag1tttctattagaaacgatgtattacatctgtatcttacagtatccgtatcacgaaataata61tttcttatatggaatatggacttatatcaaagttctatatggatcactggaggtggaaaa121taagagagaaacataaggtggaaaataacttattatccacatacaaatacatccttaatt181tccactaccacatggtccacccctatataaggagtacaaaaggagggccaaatcgagtga241tgaattcagtctgcgttgaacattcaccgtgtgaacacggaaatctattttgtgagtgca301tatattgttgggagcatgacggtcagtgcagggggagaaaattggatttgggagcatcaa361ctggaatcgaaagaagattggccaacgataaccaacaaccagggctctcagatttatatt421gcaccgagacaatacatcttgcaactgcaataccagaaaggagaaccatcgatcgagaaa481attacgtcaaagatttcgctggtcaaaccgttggtgacctctacccacaattacaaggca541gcaccggagcctctgaaccaattgatttcgcatttccaactgttggctcaggaagctggg601aaatacttgtacgtgaatctcacaaacatttcgagccaaattatacggaagaagcttatc661aatcacatattagaagtgtacgaagaagattattccccgaagaaactatggataataacg721ggtcacaggcaagcacgaccgaaatgctacgagacgctgtccaaagatgcggttttgaag781gccctcctaacagcccaagcgaaaataacagagatggaattgatggaacgtgtatatcaa841ccgtggacatacaaagcaattgtattgttaacgcacattgcccaaaacaaggaccaagca901gtcaaaccaataagagaaagaaatcaaccgatacaacagaatcaagcggatccaaaaaaa961ataaaagcagcaataatcaacaaaatatacaagaacaaagcagttccagcatcaccgacg1021cactcgatctcgtcgacggagagttggatggatcaactggatcgaatcgagaaacagcat1081actacacattcgtcctccacaaaaacaacgttaaagaggactggagatacatcgccacaa1141ccagggccaagcaagcgccgagtttcatcacattcgatcacggagaccacatccatatcc1201tcttctcctcgtccaatacaggaggaaacagcacaagagtcagaaccagaatcaccaagt1261ttcttagtgcaacaagcgcaggaagtgcagaagcgactatcactttttccaaagttaaat1321ttctcaggaactacattctctattgcatccgttacggtatcgaaacagtcaatatctatg1381gaaataaaatccaacaacaattaaccgaagcaatggatacatttaaaatattatttgaaa1441atagagacccaaatgacgtaatattagaagccggatgcaaattatatcatgaagaaaaaa1501aggataataaacaaaaaagatgcggacaacggaagcaacaaaatctaacggacattatat1561tggaaaaaattaaagaaaagaaaattacaacggcacaacaatgggaaaatcaaattgaac1621cggaattcaaaatacaattaatgaaagagtttggattaaatgtggacagttatgtaacaa1681gaatagtacgcatcgaaagaacacgtatacaacaattgataaaagcaaaaacgcttacgg1741aaataatgcttgaaatattaaatgatgactatattaaacacttcacaccaggagaagaca1801acagcaaaacaacaaaatgtattgaatggatagaatatctattcaaagaaaataacatca1861atataatccacttcttggcatggaatgaaattataaaaacaaaaagatataaaaaaataa1921acggaatggtactagaaggtatcacaaacgcaggaaaatcactaatattagacaacttat1981tggccatggttaaaccagaagaaataccacgagaacgagacaacagtggattccaccttg2041accaagtaccaggagcaggatcgatcctatttgaagaaccaatgatcacaccagtaaacg2101tcggaacatggaaattattattagaaggaaaaaccataaaaacggatgtaaaaaacaaag2161acaaggaaccgatagaacgcacaccaacgtggatcacaacagcaactccaataacaaaca2221acattgatatgaatgaaacatcacaaatactacaaagaataaaattatatatattcaaaa2281aaagtatccaacacagagacgacaaatatactataaatgcgcaaattcaaaataaattaa2341tcagtcgtcctccaactctcattgagccaatacatatggccatagtgtttataaaaaatt2401tcacaaaaatatataatctaatcgcagaagaagacaaggcacacacagtaaacgaaaagg2461caatacaaataagcaacgaagtgaaagaagaagcagaatcatggcagacagcactacaat2521ggaccatgatggagaacaacgaggaacaaaacgaaaacgagacgcaggagctggaggatc2581aggtgctggaattggcaaaggagcaagcaactacgtaaaagaaggatatggaccaaatat2641gaccgaaatggtaccaagaaacatattgaataaaggaaatcacacagtctatcatgtggt2701aaaacaacaaaaatatctagacttcaattacgtaacaaatcaaaacccatacataattcc2761atatcaaacagcaggattctgggcatcaatgtgggaccaaacagacatcggatccaataa2821cagcattaatataatgaaagcattaaacaacgtatcactaggagtaacatggatcaaagg2881agaaatcacattcgaagtatattcagtaacaagacaacgcttgctaacaggaacaacaaa2941ccaaactacatgggactttgaaacaagtcaaaacatgttcatcgcagatgcagacagaga3001accagaaaacttcaacttagcaacagcagcagcaactggaccacttgcacaacaaacaac3061acaaacattactattcaatgcaaacaatgacagatatacaaaatatgaattaccacaaag3121aaaccaatatacaagggaaattaacttccaacaattaacaaacaactatatgtggaaacc3181attggacatcagcgctgcagcaaactttagaagattgatcccaatggcagaaggagtata3241tacaacatcaaatgcaacaagtaaaatgacagaattaacaaatcaaactacagcatacgc3301cacatcaggcaaaacaacacaagcaacactattcagaaatagaacatcataccctagaat3361gcatatggcacaaccacaagttccagatgaaaccggatacatgaaattcagataccaagt3421acgaatgagcacaaaactacatctcgaattccatctctacccagattacggcacatcaac3481aaacatagaatatatgcagagacaagtactggaattaccagaagtaacagcaacaggagg3541agtggtaacatgtatgccgtatgaaatcaaaacttaaatattaaattcaacttgtatcaa3601ctataacacatatataatcaataaagcattcaaaaaacatataagtcaaattaatatata3661tcacaataaaaatccaccttaaaacataagcttaatttccacctccgtattccacctcag3721aatattggcttaaaatccacctccaatgatacagttaggaagctaatattagtccgggat3781ccccgtgtggccgataggcgaggatcgaaagcccaaattttgatgacgtcacctcacaca3841cataccaaaagctttagtttctaatagaaacagcgtattacgcttaaagcttttggtatg3901tgtgtgaggtgacgtcatcaa3961。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3