本發明涉及一種從環境樣品中提取純化總細菌的方法，屬于環境科學與生物技術領域。

背景技術：

隨著科技的進步，pcr技術逐漸被應用到環境微生物中特定細菌的檢測中，如土壤、未經處理的生活廢棄物、醫院廢棄物、工廠廢棄物、垃圾和人畜糞便以及大氣中的漂浮物和氣溶膠等環境中的微生物檢測。

隨著規模化、集約化養殖場數量的增加，畜禽的糞便和污水排放量劇增，環境污染問題越來越突出，一些致病性微生物如豬副豬嗜血桿菌、沙門桿菌等混跡其間，將對人畜健康造成極大的危害，也會給養殖業的健康發展帶來無法估量的經濟損失。因此，需要對養殖場環境病原微生物進行實時監測，以防止動物疫病的爆發與蔓延。

迄今，對病原菌的檢測和鑒定大多采用傳統的方法，即對病料進行病原培養分離，配合血清型鑒定來診斷畜禽疾病。該方法雖然比較準確，但耗時費力，鑒定時間長(一般需要2～4天)，易受細菌生理條件和抗生素使用限制，常導致培養假陰性，很難滿足臨床要求。

pcr技術以其敏感性強，特異性好，檢測時間短等特點被廣泛應用于許多病原菌的快速鑒定。但對于環境中的病原菌而言，環境中存在大量干擾物質影響pcr檢測，如腐殖質等。所以傳統的解決辦法就是采用去除腐殖質試劑對樣品進行洗滌，去除腐殖質，然后用裂解試劑裂解環境中的細菌，析出dna復合物，用蛋白酶去除dnp中的蛋白質，析出dna，再經純化，洗滌作為dna檢測的樣品試劑。此類方法存在繁瑣的dna的提取純化過程，且常常會導致提取失敗。目前市場上有針對具體病原菌dna提取的試劑盒，但步驟繁多，且價格昂貴，難以推廣進行日常使用。

菌落pcr因為不用提取細菌dna而直接進行檢測而廣受追捧，但如何提取純化能直接用于pcr檢測的環境樣品中的病原菌，仍然是一個很難解決的問題。

因此，在生產實踐中，亟需快速檢測鑒定技術來幫助廣大基層獸醫工作者來快速診斷檢測，為盡早防治病原菌的侵襲提供寶貴的時間。

技術實現要素：

本發明提供了一種從環境樣品中提取純化總細菌的方法，它包括如下操作步驟：

(1)取環境樣品，加入水或緩沖液，混勻；

(2)加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，待溶劑分層，移取上層備用；

(3)將移取的上層進行離心，棄上清，保留沉淀；

(4)將沉淀洗滌至基本無色，用無菌水或緩沖液重懸菌液即可。

本方法可用于多種環境中的總細菌的提取純化，如土壤、未經處理的生活廢棄物、醫院廢棄物、工廠廢棄物、垃圾和人畜糞便以及大氣中的漂浮物和氣溶膠等環境中微生物的提取純化。本發明一個具體實施方式中，用于提取純化(包括檢測)的環境樣品為養殖環境中的糞樣、墊草、墊土(即土壤)。

優選地，加入環境樣品中和重懸沉淀(總細菌)的水為無菌水(如ddh2o)或無菌生理鹽水，緩沖液為pbs緩沖液或tris-hcl緩沖液。

進一步優選地，加入環境樣品中和重懸沉淀(總細菌)的為pbs緩沖液，其效果略優于水和其他緩沖液。

優選地，環境樣品和pbs緩沖液的質量體積比為1g：3ml。

所述“溶劑分層”，是指步驟(2)引入的有機溶劑與步驟(1)中引入的水或緩沖液，由于兩者不能完全互溶而分為兩層(也可以稱為兩相)，本發明中取上層(主要是水相)。但有機溶劑與水或緩沖液可能會有一定互溶比例，因此，不排除各相溶劑中均含有一定量的有機溶劑和水。本發明中溶劑分層，可以采取多種方式，如靜置、離心等。

優選地，步驟(2)中，苯酚-氯仿-異戊醇混合液中，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1～100:24:1

進一步優選地，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。

優選地，步驟(2)中，加入的苯酚-氯仿-異戊醇混合液與pbs緩沖液的體積比為5:3。

優選地，步驟(4)中，洗滌液為tenpp緩沖液，tenpp緩沖液組成為：50mmol/ltris，20mmol/ledta，100mmol/lnacl，1％pvpp，ph10.0。

通常洗滌3～5次沉淀即可洗至基本無色，重懸菌液可用無菌水或各種常用的緩沖液，如pbs緩沖液，tris緩沖液等。

優選地，上述需離心的各步驟中，離心轉速為12000rpm，離心時間為2～5min。

若環境中的總細菌較少，或為了提高本發明方法的檢測靈敏度，可在步驟(2)移取上層后向下層樣品(主要是有機相)中再加入pbs緩沖液，混勻，離心，移取上清備用；此步驟可再重復1～2次；合并前面移取的上層，然后進行步驟(3)及后面的操作。

本發明還提供了苯酚-氯仿-異戊醇混合液和tenpp緩沖液用于從環境樣品中提取純化總細菌的用途，其中，苯酚-氯仿-異戊醇混合液中，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1～100:24:1；tenpp緩沖液組成為：50mmol/ltris，20mmol/ledta，100mmol/lnacl，1％pvpp，ph10.0。

優選地，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25：24：1。

本發明進一步提供了一種檢測環境樣品中革蘭氏陰性菌的方法，它包括如下步驟：

(1)采用上述任一本發明方法提取純化總細菌，重懸菌液備用；

(2)將重懸的菌液直接上機進行菌落pcr擴增目標細菌的任一段特定的dna序列；

(3)檢測擴增產物，與陽性對照比較，判斷提取純化的總細菌中是否含有目標革蘭氏陰性菌。

此即為菌落pcr檢測方法。

本發明進一步提供了環境樣品中布氏桿菌的檢測方法，即采用上述革蘭氏陰性菌的檢測方法，用于擴增的上游引物序列如seqno.1所示，下游引物序列如seqno.2所示：

seqno.1：5'-ggttgttaaaggagaacagc-3’，

seqno.2：5'-gacgatagcgtttcaacttg-3’。

本發明進一步提供了環境樣品中沙門氏菌的檢測方法，即采用上述革蘭氏陰性菌的檢測方法，用于擴增的上游引物序列如seqno.5所示，下游引物序列如seqno.6所示。

seqno.3：5’-gattctggtactaatggtgatgatc-3’，

seqno.4：5’-gccaggctatcgccaataac-3’。

本發明方法利用特定配比的有機溶劑、水或緩沖液將細菌從環境樣品中提取出來，再通過洗滌進一步純化，可用于快速高效地提取純化環境樣品中的總細菌，繼而用于pcr檢測。環境中的總細菌既包括革蘭氏陰性菌，又包括革蘭氏陽性菌，二者的主要區別在于細胞壁。革蘭氏陽性菌不能通過熱裂解來直接進行菌落pcr檢測，還需要用蛋白酶對細胞壁進行破壁，析出細菌dna，再進行pcr檢測，類似于傳統pcr檢測方法。本發明提取純化的總細菌中，雖含有革蘭氏陽性菌，但如果在后續pcr實驗過程中，不引入其他的裂解步驟，革蘭氏陽性菌的存在對革蘭氏陰性菌的菌落pcr檢測方法并無影響。所以，本發明方法特別適合用于環境樣品中的革蘭氏陰性菌的pcr檢測。

附圖說明

圖1苯酚-氯仿-異戊醇濃度篩選實驗結果圖

圖2糞樣中布氏桿菌菌落pcr檢測圖

圖3墊草中副豬嗜血桿菌菌落pcr檢測圖

圖4墊土中沙門氏菌菌落pcr檢測圖

圖5墊土中大腸桿菌菌落pcr檢測圖

具體實施方式

下面以具體實施例的方式對本發明進一步進行說明，但不應理解為對本發明的限制。

材料與試劑

(1)所用菌株

致病性豬副豬嗜血桿菌，西南民族大學張斌副教授贈送；沙門氏菌cvcc504，購自中國獸醫藥品監察所；布氏桿菌，蘭州獸醫所研制的布氏桿菌(a群)弱毒苗，腸毒性大腸桿菌cvcc196購至中國獸醫藥品監察所。

(2)主要試劑

2×pcrmix、marker、苯酚、氯仿、異戊醇、pbs緩沖液，pvpp等，均購自tiangen公司；糞便dna提取試劑盒，土壤dna提取試劑盒，細菌總dna提取試劑盒(用于墊草中細菌dna提取)，以上試劑盒購自omega公司，其他試劑均為分析純。

(3)引物：

表1引物序列表

均由英駿生物技術有限公司合成。

實施例1苯酚-氯仿-異戊醇混合液配比的篩選

1材料：

待檢細菌：布氏桿菌；載體：土壤。

2實驗方法：

實驗組共有7組，苯酚-氯仿-異戊醇配比(體積比)分別為：第1組0:24:1；第2組25:96:4；第3組50:72:3；第4組25:24:1；第5組：75:48:2；第6組為100:24:1；第7組為100:0:0。各組菌采用相同的細菌起始濃度，3×10⁶cfu/g。

將待檢細菌加入土壤中，然后用本發明方法從混有細菌的土壤中將細菌提取純化出來，進行菌落pcr檢測。以空白樣品為陰性對照(第9組)，同時采用相應dna提取試劑盒為陽性對照(第8組)。

具體過程為：稱取0.1g土壤于1mlep管中，加入300μlpbs緩沖液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l)，渦旋混勻，加入苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)500ml，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層于另一干凈滅菌ep管中；再加入300μlpbs緩沖液，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層于上次的ep管中，重復pbs緩沖液操作一次，合并前述三次上層(主要為水相)。將合并的菌液(上層)12000rpm離心5min，棄上清。將沉淀用500μltenpp緩沖液(20mmol/ledta，50mmol/ltris,1％pvpp，100mmol/lnacl，ph10.0)洗滌3～5次至上清基本無色。用50μlddh2o重懸菌液。取此菌液1μl進行后續pcr檢測。

pcr反應體系及條件：

反應體系(25μl)：2×pcrmix12.5μl，模板1μl，上、下游引物各1μl，用ddh2o補足至25μl。反應條件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30個循環；72℃10min。

凝膠電泳檢測：

pcr產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3實驗結果

如圖1所示(lane1-7分別為酚-氯仿-異戊醇提取第1～7組，lanem為marker,lane8為陽性對照，lane9為陰性對照)，第4、5、6、7組和陽性對照組都能檢出布氏桿菌的條帶，第7組為單純苯酚組，苯酚具有一定的親水性，不能很好地將水相與有機相分離，萃取操作時，分界不明顯，會造成二次操作，特別麻煩，所以苯酚-氯仿-異戊醇三者的配比為25:24:1～100:24:1較為合適。

實施例2pcr擴增及凝膠電泳法檢測養殖場環境樣品中提取純化的病原菌

1.材料：

1.1所用菌株：致病性豬副豬嗜血桿菌，沙門氏菌cvcc504，布氏桿菌，大腸桿菌cvcc196。

1.2環境載體：糞樣，墊草，墊土。

1.2引物，見表1：

2、方法：

2.1pcr反應體系及條件

反應體系(25μl):2×pcrmix12.5μl，模板1μl，上、下游引物各1μl，用ddh2o補足至25μl。反應條件:94℃5min；94℃30s，55℃30s(布氏桿菌采用60℃30s)，72℃1min，共30個循環；72℃10min。

2.2凝膠電泳檢測

pcr產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.4本發明方法提取純化病原菌用于pcr檢測的有效性和敏感性試驗

將布氏桿菌、副豬嗜血桿菌、沙門氏菌cvcc504、大腸桿菌cvcc196新鮮菌液分別計數后進行10倍系列稀釋，取1×10⁰，1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7稀釋度各10μl加入0.1g環境樣品中(布氏桿菌加入糞樣中，副豬嗜血桿菌加入墊草中，沙門氏菌和大腸桿菌加入墊土中)用本發明實施例1的方法提取純化各細菌，并檢測pcr敏感性。以空白樣品為陰性對照，同時采用相應dna提取試劑盒為陽性對照，對比本發明方法的有效性和敏感性。

2.5重復性實驗

采用2.4相同的方法，將病原菌濃度為3×10⁶cfu/g的布氏桿菌梯度稀釋后加入5個相同的樣品進行相同操作檢測，以檢驗本發明方法的重復性。

2.結果

2.1方法的有效性和敏感性

如圖2、圖3、圖4、圖5所示，本方法均能從環境樣品中提取出這些細菌，完成菌落pcr檢測。

圖2、圖3、圖4、圖5中lanem均為marker，marker條帶從上到下為2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。

圖2為糞樣中布氏桿菌菌落pcr檢測圖，lane1-4為采用本發明方法進行pcr的檢測結果，lane5-8為采用標準dna提取試劑盒提取dna后進行pcr的檢測結果。其中，lane4和lane8的糞樣布氏桿菌濃度為3×10⁷cfu/g；lane3和lane7為3×10⁶cfu/g；lane2和lane6為3×10⁵cfu/g；lane1和lane5為3×10⁴cfu/g。

圖2結果表明，本發明方法能從環境樣品中提取檢測到布氏桿菌的濃度下限為3×10⁵cfu/g，和市售dna提取試劑盒檢測結果相當。

圖3為墊草中副豬嗜血桿菌pcr檢測圖，lane1-5為采用本發明方法進行pcr的檢測結果，lane6-10為采用標準dna提取試劑盒提取dna后進行pcr的檢測結果。其中，lane1和lane6的墊草中副豬嗜血桿菌濃度為1×10⁶cfu/g，lane1-5為依次10倍濃度稀釋，lane5和lane10為100cfu/g。

圖3結果表明，本發明方法能從環境樣品中提取檢測到副豬嗜血桿菌的濃度下限為1×10⁴cfu/g，和市售dna提取試劑盒檢測結果相當。

圖4為墊土中沙門氏菌菌落pcr檢測圖，lane1-8為采用本發明方法進行pcr的檢測結果，lane9-16為采用標準dna提取試劑盒提取dna后進行pcr的檢測結果。.其中，lane1，lane9為未加入墊草的標準菌液，lane8和lane16的墊草中沙門氏菌濃度為3×10⁷cfu/g，lane8-2和lane16-10為依次10倍濃度稀釋，lane2和lane10為30cfu/g。

圖4結果表明，本發明方法能從環境樣品種提取檢測到沙門氏菌的濃度下限為3×10⁵cfu/g，和市售dna提取試劑盒檢測結果相當。

圖5為墊土中大腸桿菌菌落pcr檢測圖，lane1-8為采用本發明方法進行的pcr檢測結果。lane9-16為采用標準dna提取試劑盒提取dna后進行pcr檢測結果。其中，lane1，lane9為標準菌液，lane2-8和lane10-16的對應菌液濃度相同。lane8和lane16的墊土中大腸桿菌濃度為3×10⁷cfu/g，lane8-2和lane10-16均為10倍濃度稀釋，lane2和lane10濃度為30cfu/g。

圖5結果表明，本發明方法能從環境樣品種提取檢測到大腸桿菌的濃度下限為3×10⁵cfu/g，和市售dna提取試劑盒檢測結果相當。

2.2方法的重復性

5個樣品的檢測結果完全相同，表明本方法具有良好的重復性。

實施例3一種從環境樣品中提取純化總細菌的方法

稱取0.1g土壤于1mlep管中，加入400μlpbs緩沖液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l)，渦旋混勻，加入苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)500ml，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層(主要為水相)于另一干凈滅菌ep管中；再加入300μlpbs緩沖液，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層于上次的ep管中，將兩次移取的上層合并。將合并的菌液(上層)12000rpm離心5min，棄上清。將沉淀用600μltenpp緩沖液(20mmol/ledta，50mmol/ltris,1％pvpp，100mmol/lnacl，ph10.0)洗滌至上清基本無色。用50μlddh2o重懸菌液，即完成對土壤樣品中總細菌的提取純化。

上述表明，本發明方法簡化了pcr檢測的前處理步驟，省去了繁瑣的dna提取步驟，直接用本方法處理得到的稀釋菌液或菌落為模板進行pcr擴增，重復性好，靈敏高，特異性好，檢測時間短，節省人力物力，大大降低了檢測成本。

sequencelisting

<110>四川省畜牧科學研究院

<120>一種從環境樣品中提取純化總細菌的方法

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<213>檢測布氏桿菌的上游引物

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