本發(fā)明涉及一種熒光探針，特別涉及一種用于活細(xì)胞中RNA成像的雙光子熒光探針。

背景技術(shù)：

在細(xì)胞內(nèi)的各種生命物質(zhì)中，核糖核酸(RNA)是重要的生物大分子，其在催化生物反應(yīng)、基因表達(dá)調(diào)控等生物學(xué)過程中扮演著極其重要的角色。RNA主要存在于細(xì)胞核的核仁區(qū)和細(xì)胞質(zhì)中，其定位、活動、多寡、形態(tài)等包含著重要的生命科學(xué)信息，這些信息與醫(yī)學(xué)診斷和治療息息相關(guān)。因此，核仁和細(xì)胞質(zhì)中的RNA成像對生物化學(xué)、生物醫(yī)藥、生命科學(xué)等具有十分重要的意義。目前的熒光成像技術(shù)，尤其是雙光子熒光成像技術(shù)，在實(shí)時監(jiān)測活細(xì)胞中生物分子的形態(tài)、多寡等方面得到了廣泛應(yīng)用。雙光子熒光成像技術(shù)具有高檢測靈敏度、大的穿透深度、圖像高保真、低的光毒性和光漂白性等優(yōu)勢，獲得了生物、生命、醫(yī)學(xué)等學(xué)科研究者們的青睞。為適應(yīng)當(dāng)前形勢，各種能夠成像活細(xì)胞內(nèi)不同靶標(biāo)的雙光子熒光探針已成為研究熱點(diǎn)。

與眾多的商業(yè)化探針(如DNA探針)相比，RNA探針非常少。目前只有分子探針公司(Molecular Probes Co.)提供一個可用RNA成像的探針“SYTO RNA-Select”，但該探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)式仍未對外公布。專利CN103265947A、CN103275699A分別提供了一種用于活細(xì)胞成像的RNA熒光探針，但該探針未能實(shí)現(xiàn)雙光子熒光成像。因此，在活細(xì)胞RNA熒光成像檢測方面，依然缺乏優(yōu)良的雙光子熒光探針，這一現(xiàn)狀亟待解決。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述不足，而提供一種雙光子RNA熒光探針，該探針具有膜通透性好、細(xì)胞毒性小、顯色強(qiáng)的特點(diǎn)。

本發(fā)明的另一目的是提供該雙光子RNA熒光探針在標(biāo)記或顯示RNA在活細(xì)胞中分布的應(yīng)用。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種雙光子RNA熒光探針，結(jié)構(gòu)通式如(I)所示：

其中：R為烷基、羥烷基或醚基；X為溴或碘。

上述雙光子RNA熒光探針中：所述的R優(yōu)選C_1-12的烷基、C_1-12的羥烷基或乙醚基；進(jìn)一步優(yōu)選甲基、乙基、丁基、十二烷基、羥乙基或乙醚基。

所述的雙光子RNA熒光探針最優(yōu)選2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(簡稱為IE)。

上述雙光子RNA熒光探針的制備方法：

先鹵代反應(yīng)在2-甲基苯并噻唑氮上引入R基，并獲得苯并噻唑鹽，然后利用苯并噻唑鹽與3-甲酰基吲哚通過knoevenagel反應(yīng)得到最終產(chǎn)物。

所述的雙光子RNA熒光探針(IE)的制備反應(yīng)式如圖1所示。

上述雙光子RNA熒光探針在標(biāo)記或顯示RNA在活細(xì)胞中分布的應(yīng)用。

所述的細(xì)胞為HeLa細(xì)胞。

將本發(fā)明雙光子RNA熒光探針應(yīng)用在HeLa細(xì)胞的染色，標(biāo)記后的雙光子熒光圖像顯示，在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)有明顯的熒光分布，明確提示所述探針能夠在活細(xì)胞中專一性成像細(xì)胞質(zhì)和核仁中的RNA，并在經(jīng)核糖核酸酶(RNase)消化實(shí)驗后的細(xì)胞進(jìn)行對比實(shí)驗后得到進(jìn)一步證實(shí)。在HeLa細(xì)胞上用MTT法對所述探針的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，測試HeLa細(xì)胞在所述探針孵育2、4、8、12、24小時后的細(xì)胞存活率，在染色12小時之內(nèi)，HeLa細(xì)胞的存活率還在90％以上，這表明本發(fā)明所述雙光子熒光探針細(xì)胞毒性小，具有較好的膜通透性，能成像活細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)的RNA。

本發(fā)明雙光子RNA熒光探針是一類新型的RNA選擇性識別的雙光子熒光探針，該探針具有膜通透性好、細(xì)胞毒性小、顯色強(qiáng)的特點(diǎn)，可開發(fā)為RNA相關(guān)的生理、病理學(xué)研究用生物檢測試劑。

附圖說明

圖1為2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽的制備反應(yīng)式；

圖2為2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)的RNA雙光子熒光滴定圖；a為雙光子熒光光譜；b為最大熒光強(qiáng)度隨RNA與探針濃度比的變化圖；

圖3為2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)對活性Hela細(xì)胞進(jìn)行染色在800納米激光輻照下得到的雙光子熒光照片；a為雙光子熒光照片；b為明場激光掃描的微分干涉顯微照片；c為ab兩圖的合并圖(共定位圖)；

圖4為HeLa細(xì)胞經(jīng)核糖核酸酶(RNase)處理前后，用2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)染色的細(xì)胞照片對比圖；a)為核糖核酸酶(RNase)處理前，用2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)染色HeLa細(xì)胞照片；b)為核糖核酸酶(RNase)處理前，明場激光掃描的微分干涉顯微照片；c)為核糖核酸酶(RNase)處理后，用2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)染色HeLa細(xì)胞照片；d)為核糖核酸酶(RNase)處理后，明場激光掃描的微分干涉顯微照片；

圖5為2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)在HeLa細(xì)胞上的毒性(MTT)實(shí)驗中細(xì)胞存活率隨孵育時間的變化圖；孵育時間：2、4、8、12、24小時，孵育濃度5μM。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)的合成

將2-甲基苯并噻唑(0.05mol，7.46g)與2-碘乙醇(0.05mol，7.81g)溶解在甲苯(50ml)中，攪拌4小時，隨后回流反應(yīng)30分鐘，冷卻至室溫，過濾，乙醚洗滌，得到N-乙醇-2-甲基苯并噻唑碘鹽。將N-乙醇-2-甲基苯并噻唑碘鹽(0.01mol，0.32g)與3-甲酰基吲哚(0.01mol，0.145g)溶于甲醇(20ml)中，滴加幾滴哌啶，回流反應(yīng)4h，無水乙醇洗滌，得到褐色粉末，產(chǎn)率77％。

¹H NMR(400MHZ):12.478(s,1H),8.448(t,J＝7.66,2H),8.342(d,J＝7.96,1H),8.205(d,J＝4.96,1H),8.16(t,J＝9.72,1H),7.798(t,J＝7.76,1H),7.713(q,J＝9.29,1H),7.604(t,J＝5.4,2H),7.357(d,J＝4.36,2H),5.261(t,J＝5.68,1H),4.959(t,J＝4.34,2H),3.965(q,J＝4.88,2H).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):173.40,144.44,142.06,138.38,137.87,129.23,127.81,127.27,,125.17,124.37,124.31,122.89,121.31,116.72,114.68,113.62,107.11。

實(shí)施例2：2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-甲基苯并噻唑碘鹽的合成

將(10mmol，1.49g)2-甲基苯并噻唑與(20mmol，2.84g)碘甲烷溶解在50ml甲苯中，攪拌4小時，隨后回流反應(yīng)30分鐘，冷卻至室溫，過濾，乙醚洗滌，得到N-甲基-2-甲基苯并噻唑碘鹽。將(1mmol，0.291g)N-甲基-2-甲基苯并噻唑碘鹽與0.145g(1mmol)3-甲酰基吲哚溶于20ml甲醇中，滴加3滴哌啶，回流反應(yīng)6h，無水乙醇洗滌，得到褐色粉末，產(chǎn)率70％。

IMT-M:1H NMR(400MHZ):12.497(s,1H),8.466(t,J＝10.6,2H),8.335(d,J＝8,1H),8.275(t,J＝4.42,1H),8.149(d,J＝8.36,1H),7.815(t,J＝7.72,1H),7.712(t,J＝7.64,1H),7.595(t,J＝4.5,1H),7.525(d,J＝15.76,1H),7.525(d,J＝15.76,1H),7.370-7.324(m,2H),4.277(s,3H).13C NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):172.45,144.73,142.41,138.37,138.04,129.31,127.09,125.20,124.40,124.30,122.90,121.48,116.40,114.70,113.62,106.22。

實(shí)施例3：2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-乙基乙基醚苯并噻唑溴鹽的合成

將(10mmol，1.49g)2-甲基苯并噻唑與(20mmol，6.75g)2-溴乙基乙基醚溶解在50ml甲苯中，攪拌6小時，隨后回流反應(yīng)30分鐘，冷卻至室溫，過濾，乙醚洗滌，得到N-乙基乙基醚-2-甲基苯并噻唑溴鹽。將(1mmol，0.617g)N-乙基乙基醚-2-甲基苯并噻唑溴鹽與(1mmol，0.145g)3-甲酰基吲哚溶于20ml甲醇中，并滴加3滴哌啶，回流反應(yīng)7h，無水乙醇洗滌，得到褐色粉末，產(chǎn)率65％。

效果測試

(一)2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)的RNA雙光子熒光滴定：

固定2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)在Tris-HCl緩沖溶液(pH＝7.2，Tris和KCl 100mmol/L)中的濃度，逐漸加入RNA，在800納米激光輻照光下得到2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)的雙光子熒光滴定譜圖，如圖2所示。結(jié)果表明，隨著RNA的不斷加入，本發(fā)明所述探針的雙光子熒光強(qiáng)度先是急劇增大，而后增大幅度放緩。這表明本發(fā)明的探針對RNA具有明顯的熒光響應(yīng)。

(二)HeLa細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa細(xì)胞株貼壁培養(yǎng)于內(nèi)含10％(v/v)胎牛血清和少量青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO₂(v/v)的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長到對數(shù)期，接片培養(yǎng)：將蓋玻片于鉻酸洗液中浸泡30分鐘，清水、超純水洗凈，烘干，滅菌后放入一次性35mm無菌培養(yǎng)皿中；將100mL培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基小心地倒出，細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4)洗2遍，用l mL 0.25％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶液消化2～3分鐘，倒掉胰蛋白酶液，加入少量新鮮培養(yǎng)基吹打均勻成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計數(shù)后，留下合適密度的細(xì)胞，將培養(yǎng)基加至所需體積吹打均勻，而后將細(xì)胞接種至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞爬片生長。24～48h后，生長至細(xì)胞密度達(dá)50％～70％，待染色。

(三)2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)對HeLa細(xì)胞的染色觀察：

將2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)配成1mM DMSO母液，染色時用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4)稀釋至5μM。將接種好的細(xì)胞在5μM的探針分子溶液中，37℃條件下孵育30min，用PBS洗去未結(jié)合的多余染液，細(xì)胞生長面朝下蓋在載玻片上；然后把樣品置于載物臺上熒光成像。結(jié)果見圖3，雙光子熒光圖像顯示在細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)有明顯的熒光分布，表明本發(fā)明的探針能夠在活細(xì)胞中專一性的成像細(xì)胞質(zhì)和核仁中的RNA。

(四)2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)探針對HeLa細(xì)胞、RNase消化處理后的HeLa細(xì)胞的染色觀察：

固定細(xì)胞制備：將培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞浸泡于4％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液30分鐘，或者用-20℃甲醇固定15分鐘，而后用0.5％Triton X-100室溫通透2分鐘，得到待染色固定細(xì)胞。

取兩組上述固定細(xì)胞，用濃度為5μM的2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)探針溶液在CO₂培養(yǎng)箱中孵化染色30分鐘。用PBS對兩組細(xì)胞沖洗2遍，向其中一組加入25mg/mL DNase-Free RNase(GE)(核糖核酸酶)，然后兩組細(xì)胞在37℃、5％CO₂條件下孵育2小時。隨后，用PBS沖洗2次，在寬場顯微鏡下觀察、記錄兩組細(xì)胞中熒光分布及亮度變化等。

結(jié)果見圖4，未經(jīng)RNase消化處理的HeLa細(xì)胞的熒光主要集中在細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)域；而經(jīng)RNase消化處理后的HeLa細(xì)胞的熒光集中到了細(xì)胞核區(qū)域，其細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)域基本沒有熒光。由于RNase僅能水解掉細(xì)胞中的RNA，因此，該實(shí)施例可以證實(shí)本發(fā)明的探針能夠選擇性成像細(xì)胞中的RNA。

(五)MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗

收集對數(shù)期HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。5％CO₂，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)后開始分別在0、12、16、20、22h的時間加入5μM的2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)熒光探針。到貼壁24h時每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。然后，再向每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

結(jié)果見圖5，HeLa細(xì)胞在5μM 2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羥乙基)苯并噻唑碘鹽(IE)孵育2、4、8、12、24小時后的細(xì)胞存活率，在染色12小時之內(nèi)，HeLa細(xì)胞的存活率還在90％以上，這表明本發(fā)明所述雙光子熒光探針能成像活細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)的RNA。

以上是結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的詳細(xì)介紹，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。