本發明涉及一種熒光探針，尤其涉及一種能夠以兩種熒光顏色清楚區分和同時成像細胞膜脂筏和非脂筏微區的單一熒光探針及其在標記活細胞細胞膜上的脂筏和非脂筏微區中的應用。

背景技術：

細胞膜的亞微結構近年來引起了人們廣泛的關注。鞘磷脂等含有飽和脂肪酸側鏈的磷脂和膽固醇一起可以形成致密排列的脂筏微區，而含有不飽和側鏈的磷脂可以形成疏松排布的非脂筏微區。研究表明，脂筏微區與蛋白質團簇形成，信號轉導，細胞凋亡以及病毒侵入過程密切相關。另一方面，非脂筏微區，由于其疏松的排布結構，在保持膽固醇平衡和細胞融合過程中起著重要的作用。兩種微區含量的失衡會直接導致諸多疾病，例如非脂筏微區的增多會增加動脈硬化等疾病的風險。因此，實時原位的觀測兩種微區在生理學和病理學研究中具有重要的價值。

熒光成像方法是對生物體系靶標進行原位觀測的最優方法。搭配以合適的熒光探針，熒光成像方法可以完成對活細胞內靶標的實時原位觀測，且操作簡便。然而，目前能夠同時雙色成像細胞膜中脂筏和非脂筏微區的熒光探針緊缺，且目前的探針具有明顯缺點。Laurdan及其衍生物是目前最常用來研究脂筏和非脂筏微區的熒光探針。它能夠染色低極性的脂筏微區并呈現藍色熒光(440nm)，同時染色高極性的非脂筏微區并呈現綠色熒光(490nm)。然而laurdan具有明顯的缺點：首先兩種熒光波長差異較小，僅為50nm，這使其很難在細胞膜上清晰的區分兩種微區；其次是它會很快內在化進入細胞，這也嚴重限制了它在成像研究中的應用。因此，開發能夠以較大熒光波長差異區分兩種微區，能夠清楚區分和同時成像的細胞膜上脂筏和非脂筏微區的熒光探針需求迫切且勢在必行。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種可以實時原位以兩種熒光顏色清楚區分和同時成像細胞膜脂筏微區和非脂筏微區的單一熒光探針及其在標記活細胞細胞膜上的脂筏和非脂筏微區中的應用。

本發明所述可以實時原位以兩種熒光顏色清楚區分和同時成像細胞膜脂筏微區和非脂筏微區的單一熒光探針，其特征在于：所述熒光探針是式(I)所述結構的化合物：

其中，上述R¹表示2-乙氧乙基、氨烷基、羥烷基或烷基；R²或R³表示烷基。

上述用于雙色成像細胞膜脂筏和非脂筏的熒光探針中：所述R¹優選表示2-乙氧乙基、氨烷基、羥烷基或C_1-12烷基。所述R²和R³表示C_10-20烷基。

上述用于雙色成像細胞膜脂筏和非脂筏的熒光探針中：所述R¹最優選2-乙氧乙基，R²和R³最優選C₁₂烷基，最優選的熒光探針是2,7-二(N-(1’-十二烷基)吡啶碘鹽乙烯基)-N-乙氧乙基-咔唑(2,7-9E-BHVC12)。

上述熒光探針即式(I)所述結構化合物的制備方法概述如下：

首先是對二溴聯苯硝基化生成4,4-二溴-2-硝基聯苯；然后4,4-二溴-2-硝基聯苯扣環得到2,7-二溴咔唑；2,7-二溴咔唑與碘代的氨基烷、羥基烷或烷烴在強堿催化下反應得到N-取代的2,7-二溴咔唑；接下來，N-取代的2,7-二溴咔唑與四乙烯基吡啶通過Heck反應可生成2,7-二吡啶乙烯基-N-取代咔唑；最后其與碘代烷烴加成反應即可得到終產物。

具體的，上述2,7-二(N-(1’-十二烷基)吡啶碘鹽乙烯基)-N-乙氧乙基-咔唑(2,7-9E-BHVC12)的制備反應式如下：

2,7-9E-BHVC12的合成路線

本發明所述熒光探針在實時原位以紅綠兩種熒光顏色標記活細胞細胞膜上的脂筏和非脂筏微區中的應用。

其中：所述活細胞為宮頸癌細胞(HeLa)、宮頸鱗癌細胞(SiHa)或前列腺癌細胞(pc-3)細胞。

實驗結果證實，本發明所述雙色熒光探針在致密的脂筏微區誘導下能夠在其表面形成聚集體，并發出深紅色熒光(650nm)，同時該探針能夠嵌入疏松的非脂筏微區形成單體狀態，并發出綠色熒光(540nm)。

本發明對所述熒光探針在細胞上的選擇性經過了嚴格的證明。首先通過與商業化的脂筏染料進行復染實驗，高的復染率(85％)證實了深紅色熒光來自于細胞膜上的脂筏微區。另外，用MβCD處理細胞，消除細胞膜上脂筏微區后，細胞染色結果為綠光微區明顯增多，紅光微區明顯減少，再次證明了本發明所述探針能夠以紅光標記脂筏微區，同時以綠光標記非脂筏微區。

本發明的有益結果是：與目前常用的商業化同類染料laurdan相比，本發明所述熒光探針具有明顯的優勢。首先在脂筏微區和非脂筏微區探針的熒光發射波長差異較大(110nm)，是laurdan的兩倍以上，這使得本發明所述探針能夠清楚地區分兩種微區。另外相比于laurdan容易內在化的染色結果，本發明所述探針內在化問題較小，使其在實用中操作更加方便，且得到的結果更加可靠。另外探針的毒性低，生物相容性好。由于成像細胞膜亞微結構的重要意義，以及目前探針欠缺的形勢，本發明所述探針應具有廣闊的商業化前景。

附圖說明

圖1：用4μM的2,7-9E-BHVC12染色HeLa，SiHa以及pc-3細胞(a-c)，得到的實彩成像圖片，以及兩種微區原位的熒光光譜(d-f)。其中d-f中以紅色和綠色標記的熒光光譜是在a-c圖片中紅色和綠色箭頭所指圓形區域內采集得到的。激發波長為488nm，紅色微區為脂筏微區，綠色微區為非脂筏微區。

圖2：用4μM的2,7-9E-BHVC12以及1mg/mL的商業化脂筏探針CT-B591共同染色HeLa(a-c),SiHa(d-f)和pc-3(g-i)得到的熒光成像圖片。其中a,d,g的激發波長為488nm，熒光收集波長為650-700nm；b,e,h的激發波長為561nm，熒光收集波長為600-650nm；c,f,i為前兩者的疊加圖片。共定位率為85％。

圖3：用4μM的2,7-9E-BHVC12染色HeLa，SiHa以及pc-3細胞，得到的實彩成像圖片。其中a-c為未處理普通細胞的染色結果，d-f為用5mM的MβCD處理細胞1小時，消除脂筏微區后的染色結果。顯然，消去脂筏微區后細胞綠光區域明顯增多。

圖4：用4μM的2,7-9E-BHVC12染色HeLa細胞2小時、12小時和24小時后細胞的存活率。染色24小時后細胞存活率仍高達95％，說明探針的毒性很低。

具體實施方式

實施例1

4,4-二溴-2-硝基聯苯(1)的合成

將10g對二溴聯苯溶解到120mL冰醋酸中，然后將溶液攪拌并加熱到100℃。加入40mL發煙硝酸，體系反應30分鐘。反應完成后，將溶液冷卻至室溫，，過濾可得粗產物。用乙醇重結晶可得純凈產物，產率91％。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃),δ(ppm):8.03(d,J＝1.8Hz,1H),7.76(dd,J₁＝8.1Hz,J₂＝1.8Hz,1H),7.54–7.59(m,2H),7.31(s,1H),7.14–7.18(m,2H)。

2,7-二溴咔唑(2)的合成

將7.8g化合物1溶解到30mL亞磷酸三乙酯中并攪拌均勻。在氮氣的保護下將上述體系加熱到150℃，反應24小時。減壓蒸餾整掉多余的溶劑后，剩余物用柱色譜分離提純。最終得到一種白色固體為純凈產物，產率為48％。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):10.64(s,1H),8.09(d,J＝8.4Hz,2H),7.75(d,J＝1.8Hz,2H),7.37(dd,J₁＝8.4Hz,J₂＝1.8Hz,2H)。

2,7-二溴-N-乙氧乙基咔唑(3)的合成

把3g氫氧化鉀固體加入到250mL燒瓶中，然后加入30mL的DMF并攪拌均勻。上述體系攪拌10分鐘后，將2g化合物2加入其中，然后攪拌體系30分鐘。隨后，加入1.38mL的2-溴乙基乙醚，室溫下反應18小時。反應完成后，將上述體系倒入400mL水中，并用400mL的二氯甲烷萃取。有機層用4g無水硫酸鎂干燥后蒸去溶劑，得到白色產物，產率81％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)8.12(d,J＝11.2,2H),7.91(s,2H),7.36(dd,J₁＝11.2,J₂＝2,2H),4.57(t,J＝6.80,2H),3.70(t,J＝7.00,2H),3.53(q,J＝8.80,2H),0.95(t,J＝9.40,3H)。

2,7-二吡啶乙烯基-N-乙氧乙基咔唑(4)的合成

將1g化合物3、0.0283g醋酸鈀和0.115g三(鄰甲苯基)膦加入到三口燒瓶中。然后加入20mL的DMF并將體系攪拌5分鐘。攪拌條件下，加入5mL的三乙胺和1.08mL的4-乙烯基吡啶，在氮氣保護下室溫攪拌上述體系30分鐘。然后再氮氣保護下將上述體系加熱至95℃反應48小時以完成反應。反應完畢后，將反應體系冷卻至室溫，并倒入400mL水中。隨后，用400mL二氯甲烷分兩次萃取產物，萃取液合并后用水洗滌三次，加入4g無水硫酸鎂干燥。干燥完畢后，蒸去溶劑，用柱色譜法提純產物，最終得到黃色粉末為純凈產物，產率為51％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)8.57(d,J＝8.00,4H),8.17(d,J＝10.8,2H),7.94(s,2H),7.78(s,2H),7.72(s,2H),7.58(dd,J₁＝20.4,J₂＝9.6,4H),7.43(s,2H),7.37(s,2H),4.64(t,J＝7.00,2H),3.82(t,J＝7.20,2H),3.43(q,J＝9.20,2H),3.34(s,2H),1.00(t,J＝9.20,3H)。

2,7-二(N-(1’-十二烷基)吡啶碘鹽乙烯基)-N-乙氧乙基-咔唑(2,7-9E-BHVC12)的合成

將0.2g化合物4加入三口瓶中，倒入20mL乙醇，攪拌均勻。然后加入0.55mL的碘十二烷，室溫下將上述體系攪拌10分鐘，然后加熱至80℃使乙醇回流。持續加熱回流36小時以完成上述反應，然后將反應體系冷卻至室溫。有紅色粉末狀固體析出，過濾后用冷的乙醇洗滌3次可得粗產物。將粗產物在乙醇中重結晶得純凈產物，為紅色粉末狀固體，產率為63％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)8.98(d,J＝6.6,4H),8.28(q,J＝11.23,8H),8.08(s,2H),7.69(dd,J₁＝12.06,J₂＝8.34,4H),4.68(s,2H),4.51(t,J＝7.14,4H),3.85(t,J＝8.48,2H),3.42(q,J＝6.95,2H),1.93(s,4H),1.30(s,8H),1.24(s,28H),0.98(t,J＝6.96,3H),0.85(t,J＝6.68,6H).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm)＝152.90,144.12,141.95,141.54,133.44,123.58,123.53,122.76,121.18,119.53,109.96,67.96,65.69,59.63,31.18,30.39,28.89,28.78,28.66,28.57,28.27,25.33,21.97,14.88,13.83.HRMS(m/z):[M]²⁺calcd.for C₅₄H₇₇N₃,391.8028；found,391.7864。

實施例2

SiHa、HeLa和pc-3細胞的培養

所有的細胞株都是在37℃，5％CO₂的飽和濕度孵箱中培養。SiHa和HeLa細胞株貼壁培養于內含10％胎牛血清H-DMEM培養液中(含1％雙抗)。而pc-3細胞株貼壁培養于內含10％胎牛血清1640培養液中。待細胞生長到對數期，接片培養：①將蓋玻片于無水乙醇中浸泡30min，酒精燈烘干后放入一次性35mm培養皿中；②將100mL細胞瓶中的細胞用PBS洗三遍，用1mL0.25％胰酶消化3-5min，小心地倒出培養基，加入少量新鮮培養基吹打均勻，細胞計數后，留下合適密度的細胞，將培養基加至所需體積(控制細胞終濃度為1×10⁴)，接種至內含蓋玻片的培養皿中，放入CO₂培養箱中培養，使細胞爬片生長。

實施例3

2,7-9E-BHVC12染色SiHa、HeLa和pc-3細胞以及實彩成像

首先將探針2,7-9E-BHVC12配制成5mM濃度的DMSO母液，染色實驗時，取出上述母液4μL加入1mL的PBS緩沖液中，搖晃均勻做染色液。將接種好的細胞爬片用PBS洗三遍，然后放入染色液中染色，在CO₂培養箱中染色20min。吸出染色液，并用PBS沖洗染色后的細胞爬片三遍，細胞生長面朝下蓋在載玻片上，在激光掃描共聚焦熒光顯微鏡進行成像觀察。實彩熒光圖片是通過蔡司共聚焦顯微鏡LSM780的Lambda光譜成像模塊獲得的。該模塊用488nm激光做光源激發，并以8.7nm為間隔分多個通道收集490-690范圍內的熒光，最終給每個通道按波長賦予相對應的色彩并疊加得到實彩成像圖片。得到的實彩成像圖片中，紅色部分為脂筏微區，綠色部分為非脂筏微區。

結果見圖1。

圖1：用4μM的2,7-9E-BHVC12染色HeLa，SiHa以及pc-3細胞(a-c)，得到的實彩成像圖片，以及兩種微區原位的熒光光譜(d-f)。其中d-f中以紅色和綠色標記的熒光光譜是在a-c圖片中紅色和綠色箭頭所指圓形區域內采集得到的。激發波長為488nm，紅色微區為脂筏微區，綠色微區為非脂筏微區。

實施例4

2,7-9E-BHVC12與商業化脂筏探針CT-B591的共定位分析實驗

首先將探針2,7-9E-BHVC12配制成5mM濃度的DMSO母液，染色實驗時，取出上述母液4μL加入1mL的PBS緩沖液中，搖晃均勻做染色液。將接種好的細胞爬片用PBS洗三遍，然后放入染色液中染色，在CO₂培養箱中染色20min。然后加入1mg/mL的CT-B591探針染色5min，吸出染色液，并用PBS沖洗染色后的細胞爬片三遍，細胞生長面朝下蓋在載玻片上，在激光掃描共聚焦熒光顯微鏡進行成像觀察。2,7-9E-BHVC12的熒光是用488nm激光做光源激發，熒光采集波段為650-700nm；CT-B591的熒光是用561nm的激光做光源激發，熒光采集波段為600-650nm。共定位成像結果表明，定位率達85％，說明了2,7-9E-BHVC12的紅色熒光來自脂筏微區。

結果見圖2。

圖2：用4μM的2,7-9E-BHVC12以及1mg/mL的商業化脂筏探針CT-B591共同染色HeLa(a-c),SiHa(d-f)和pc-3(g-i)得到的熒光成像圖片。其中a,d,g的激發波長為488nm，熒光收集波長為650-700nm；b,e,h的激發波長為561nm，熒光收集波長為600-650nm；c,f,i為前兩者的疊加圖片。共定位率為85％。

實施例5

2,7-9E-BHVC12染色MβCD處理的細胞結果及其對照實驗

首先將探針2,7-9E-BHVC12配制成5mM濃度的DMSO母液，染色實驗時，取出上述母液4μL加入1mL的PBS緩沖液中，搖晃均勻做染色液。將接種好的細胞爬片用PBS洗三遍，然后加入5mM的MβCD在CO₂培養箱中處理60min。用PBS洗滌細胞爬片3遍以除去MβCD，然后將爬片放入染色液中染色，在CO₂培養箱中染色20min。吸出染色液，并用PBS沖洗染色后的細胞爬片三遍，細胞生長面朝下蓋在載玻片上，在激光掃描共聚焦熒光顯微鏡進行成像觀察。對照組沒有經過MβCD處理，其它染色條件相同。

結果見圖3。

圖3：用4μM的2,7-9E-BHVC12染色HeLa，SiHa以及pc-3細胞，得到的實彩成像圖片。其中a-c為未處理普通細胞的染色結果，d-f為用5mM的MβCD處理細胞1小時，消除脂筏微區后的染色結果。顯然，消除脂筏微區后細胞綠光區域明顯增多。

實施例6

2,7-9E-BHVC12的毒性測試

將細胞密度為8000個/mL的HeLa細胞接種到96孔板的部分孔內，剩余孔則用無細胞的培養基填充，并在不同的條件下在CO₂培養箱中孵育細胞。實驗組為用含4μM的2,7-9E-BHVC12的培養基孵育2小時、12小時和24小時后的細胞樣品，對照組為不加染料的含細胞樣品，空白組為無細胞的培養基樣品。待孵育完成后，用新鮮的培養基換掉細胞培養液，并在每個培養孔中加入10μL的CCK-8，再孵育細胞40分鐘。使用酶標儀測試每個孔在450nm處的吸光度，細胞存活率可通過下述公式計算得到：

其中，A_sample為實驗組吸光度，A_c為對照組吸光度，A_b為空白組的吸光度。染色24小時后細胞存活率仍高達95％，說明探針的毒性很低。

結果見圖4。

圖4：用4μM的2,7-9E-BHVC12染色HeLa細胞2小時、12小時和24小時后細胞的存活率。