本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及乙酰乳酸合成酶抑制劑抗性相關(guān)蛋白UVALS及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)代生物技術(shù)已引起農(nóng)業(yè)中若干領(lǐng)域的重大變革，其中最突出的是將外源基因?qū)胫参矬w中的表達(dá)，給作物育種帶來革命性的變化，使人們擺脫了利用傳統(tǒng)雜交技術(shù)培育新品種的局面，進(jìn)入自由構(gòu)建遺傳性狀的新時(shí)代。通過遺傳工程培育轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物品種是發(fā)展最快、研究最深、農(nóng)民接受程度最高的案例，其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是抗除草劑基因的獲得，從突變的抗除草劑植物和微生物體中分離抗性基因是最主要途徑。乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑通過抑制植物體內(nèi)的乙酰乳酸合成酶活性，從而阻止支鏈氨基酸的合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到破壞，阻礙細(xì)胞分裂期的DNA合成，從而使植物細(xì)胞的有絲分裂停止在Gl階段的S期(DNA合成期)和G2階段的M期，干擾了DNA的合成，細(xì)胞因此不能完成有絲分裂，進(jìn)而使植物停止生長，最終導(dǎo)致植物個(gè)體死亡。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供乙酰乳酸合成酶抑制劑抗性相關(guān)蛋白UVALS及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為UVALS蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(b)中的蛋白質(zhì)便于純化和檢測(cè)，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼UVALS蛋白的基因(UVALS基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。UVALS基因?yàn)槿缦?)或2)或3)的DNA分子：1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼與生物對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼與生物對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實(shí)驗(yàn)中65℃下雜交并洗膜。含有UVALS基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有UVALS基因的重組表達(dá)載體。所述表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于微彈轟擊的載體等。使用UVALS基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用UVALS基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在植物或微生物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以表型篩選轉(zhuǎn)化植物或微生物。所述重組表達(dá)載體具體可為如下重組質(zhì)粒：在pGBKT7載體的多克隆位點(diǎn)(例如BamHI和SalI酶切位點(diǎn)之間)插入U(xiǎn)VALS基因得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體具體可為如下重組質(zhì)粒：在Super1300載體的多克隆位點(diǎn)(例如XbaⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)之間)插入U(xiǎn)VALS基因得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)UVALS蛋白的應(yīng)用，為如下(c1)至(c4)中的至少一種：(c1)調(diào)控植物對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性；(c2)促進(jìn)植物對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性增加；(c3)調(diào)控微生物對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性；(c4)促進(jìn)微生物對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性增加。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。所述微生物可為酵母，具體可為酵母AH109R。本發(fā)明還保護(hù)UVALS基因在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；所述轉(zhuǎn)基因植物為對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性增加的植物。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將UVALS基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性高于所述目的植物。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。所述UVALS基因具體可通過以上任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)植物。攜帶有UVALS基因的重組表達(dá)載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物中。本發(fā)明還保護(hù)一種培育重組微生物的方法，是將UVALS基因?qū)肽康奈⑸镏?，得到重組微生物；所述重組微生物對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性高于所述目的微生物。所述UVALS基因具體可通過以上任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)微生物。所述微生物可為酵母，具體可為酵母AH109R。本發(fā)明還保護(hù)UVALS蛋白或UVALS基因或以上任一所述方法在植物育種中的應(yīng)用。所述育種的目的為培育對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性增高的植物。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。以上任一所述乙酰乳酸合成酶抑制劑具體可為氯嘧磺隆。本發(fā)明還保護(hù)UVALS蛋白作為乙酰乳酸合成酶的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑的抗性顯著高于現(xiàn)有蛋白的蛋白突變體，對(duì)于培育對(duì)于乙酰乳酸合成酶抑制劑具有高抗性的植物新品種或重組微生物具有很高的應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例中所用的氯嘧磺隆為98％氯嘧磺隆原藥，由大連瑞澤農(nóng)藥股份有限公司生產(chǎn)。實(shí)施例1、UVALS蛋白以及UVALS基因的發(fā)現(xiàn)一、最佳誘變時(shí)間的確定1、將黑曲霉TR-H轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3-5d。2、用無菌生理鹽水洗下斜面上的黑曲霉孢子，倒入已滅菌的裝有20～30顆直徑4～5mm的玻璃珠的三角瓶中，220rpm振蕩培養(yǎng)1h，使孢子分散充分，然后用4層無菌鏡頭紙過濾除去菌絲，制成濃度為105個(gè)/ml的孢子懸浮液。3、取5ml孢子懸浮液于直徑9cm的平皿中，放一無菌磁力攪拌子后置磁力攪拌器上，打開皿蓋，距紫外燈燈管(功率30W)垂直30cm處，分別在攪拌下照射30、60、90、120、150、180、210、240、270、300或600s，關(guān)閉紫外燈，用黑布將培養(yǎng)皿包好，立即放入冰箱中1-2h，防止光修復(fù)。4、分別取不同照射時(shí)間處理后的懸浮液，梯度稀釋后涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，30℃避光培養(yǎng)72h，記錄活菌數(shù)，計(jì)算各照射時(shí)間下的致死率。當(dāng)紫外線照射時(shí)間為60s時(shí)，致死率為71％，進(jìn)一步提高照射時(shí)間則致死率隨之上升，當(dāng)照射時(shí)間為600s時(shí)，致死率為97％。因此，紫外線誘變的最適劑量為采用30W紫外燈、照射60s。二、黑曲霉UVTR-H的獲得取步驟一的2制備的孢子懸浮液連續(xù)進(jìn)行六次誘變，每次誘變的方法均如下：將孢子懸浮液置于直徑9cm的平皿中，放一無菌磁力攪拌子后置磁力攪拌器上，打開皿蓋，距紫外燈燈管(功率30W)垂直30cm處，在攪拌下照射60s，關(guān)閉紫外燈，用黑布將培養(yǎng)皿包好，立即放入冰箱中1-2h，防止光修復(fù)。每次誘變后，篩選具有明顯菌落特征的單菌落(生長速度快、菌落顏色深、菌落周邊整齊)，在平板上劃線，30℃倒置培養(yǎng)3d后，菌體接入液體查氏培養(yǎng)基中，28℃、150rpm振蕩培養(yǎng)3d，用干凈紗布濾出菌絲體，測(cè)定乙酰乳酸合成酶的活性，選擇乙酰乳酸合成酶活性最高的單菌落進(jìn)行下次誘變。得到一株具有遺傳穩(wěn)定性的新菌株，在平行條件下該新菌株的乙酰乳酸合成酶活性顯著高于黑曲霉TR-H，將該新菌株其命名為黑曲霉UVTR-H。三、UVALS蛋白以及UVALS基因的發(fā)現(xiàn)1、提取黑曲霉TR-H的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2、以步驟1得到的cDNA為模板，采用AncDR和AncDF組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AncDF：5'-ATGATGCCTATGAGACCTTC-3'；AncDR：5'-TTAGAAACCGGGAACTTTC-3'。3、將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如序列表的序列2所示，編碼序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)。將序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)命名為UVALS蛋白。UVALS蛋白的理論分子量為75.6kDa，等電點(diǎn)為8.0。將編碼UVALS蛋白的基因命名為UVALS基因，其開放閱讀框如序列表的序列2所示。黑曲霉TR-H中的同源蛋白(ALS1蛋白)如序列表的序列3所示，其編碼基因(ALS1基因)如序列表的序列4所示。實(shí)施例2、UVALS蛋白的功能驗(yàn)證一、構(gòu)建重組質(zhì)粒1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。2、以步驟1合成的DNA分子為模板，采用AncDF1和AncDF1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。AncDF1：5'-GAGGATCCGTATGATGCCTATGAGACCTTC-3'；AncDF1：5'-TCGTCGACTTAGAAACCGGGAACTTTCC-3'。3、取步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。4、取pGBKT7載體(購自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為：630443)，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI進(jìn)行雙酶切，回收約7.3kb的載體骨架。5、將步驟3得到的酶切產(chǎn)物和步驟4得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pGBKT7-UVALS。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pGBKT7-UVALS進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將pGBKT7載體的BamHI和SalI酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子。序列表的序列5中第3-2075位核苷酸與序列表的序列2一致。6、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。7、以步驟6合成的DNA分子為模板，采用AncDF1和AncDF1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。8、取步驟7得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。9、將步驟8得到的酶切產(chǎn)物和步驟4得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pGBKT7-ALS1。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pGBKT7-ALS1進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將pGBKT7載體的BamHI和SalI酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子。序列表的序列6中第3-2075位核苷酸與序列表的序列4一致。二、制備重組酵母將重組質(zhì)粒pGBKT7-UVALS導(dǎo)入酵母AH109R(購自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為：630444)，得到重組酵母，將其命名為酵母pGB-UVALS。將重組質(zhì)粒pGBKT7-ALS1導(dǎo)入酵母AH109R，得到重組酵母，將其命名為酵母pGB-ALS1。將pGBKT7載體導(dǎo)入酵母AH109R，得到重組酵母，將其命名為酵母pGB。三、重組酵母的氯嘧磺隆抗性鑒定試驗(yàn)酵母分別為：酵母pGB-UVALS、酵母pGB-ALS1、酵母pGB或酵母AH109R。將試驗(yàn)酵母劃線接種至含不同濃度氯嘧磺隆的固體YPD培養(yǎng)基平板上，35℃靜置培養(yǎng)72小時(shí)，然后觀察菌株生長情況。氯嘧磺隆濃度分別設(shè)置為2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L、6000mg/L、7000mg/L、8000mg/L、9000mg/L、10g/L，每個(gè)濃度設(shè)置五個(gè)處理。設(shè)置三個(gè)不加入氯嘧磺隆的對(duì)照處理。對(duì)照處理中，各個(gè)試驗(yàn)菌株均生長良好。采用氯嘧磺隆濃度為2000mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母pGB微弱生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母AH109R微弱生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-UVALS正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-ALS1正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)。采用氯嘧磺隆濃度為3000mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母pGB完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母AH109R完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-UVALS正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-ALS1正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)。采用氯嘧磺隆濃度為4000mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母pGB完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母AH109R完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-UVALS正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-ALS1正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)。采用氯嘧磺隆濃度為5000mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母pGB完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母AH109R完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-UVALS正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-ALS1正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)。采用氯嘧磺隆濃度為6000mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母pGB完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母AH109R完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-UVALS正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-ALS1生長受到一定抑制(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)。采用氯嘧磺隆濃度為7000mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母pGB完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母AH109R完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-UVALS正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-ALS1微弱生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)。采用氯嘧磺隆濃度為8000mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母pGB完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母AH109R完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-UVALS正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-ALS1完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)。采用氯嘧磺隆濃度為9000mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母pGB完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母AH109R完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-UVALS正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-ALS1完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)。采用氯嘧磺隆濃度為10g/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母pGB完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母AH109R完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-UVALS正常生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)，酵母pGB-ALS1完全不能生長(五個(gè)處理表現(xiàn)一致)。結(jié)果表明，UVALS蛋白可以顯著提高酵母對(duì)氯嘧磺隆的抗性，且相對(duì)于ALS1蛋白對(duì)氯嘧磺隆的抗性提高了2倍以上。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。2、以步驟1得到的雙鏈DNA分子為模板，采用Primer1和Primer2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收約2000bp的DNA片段。Primer1：5'-GCTCTAGAATGATGCCTATGAGACCTTC-3'；Primer2：5'-TCGAGCTCTTAGAAACCGGGAACTTTCC-3'。3、用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ雙酶切步驟2得到的DNA片段，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ雙酶切Super1300載體，回收約10000bp左右的載體骨架。Super1300載體：購自上海北諾生物科技有限公司，貨號(hào)為addgene0595。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒甲。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒甲進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將Super1300載體XbaⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。6、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。7、以步驟6得到的雙鏈DNA分子為模板，采用Primer1和Primer2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收約2000bp的DNA片段。8、用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ雙酶切步驟7得到的DNA片段，回收酶切產(chǎn)物。9、將步驟8的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒乙。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒乙進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將Super1300載體XbaⅠ和SacⅠ之間的小片段取代為了序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。二、培育轉(zhuǎn)基因植物1、將重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。2、采用花芽浸泡法(CloughandBent,Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJournal1998,16:735-743.)，用步驟1得到的重組農(nóng)桿菌侵染哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，收獲T1代種子。T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基平板上篩選T1代植株并進(jìn)行T2代和T3代的分離比統(tǒng)計(jì)，在T3代得到轉(zhuǎn)基因擬南芥單拷貝純合株系，隨機(jī)取兩個(gè)株系，命名為株系1和株系2。三、培育轉(zhuǎn)基因植物1、將重組質(zhì)粒乙導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。2、采用花芽浸泡法(CloughandBent,Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJournal1998,16:735-743.)，用步驟1得到的重組農(nóng)桿菌侵染哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，收獲T1代種子。T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基平板上篩選T1代植株并進(jìn)行T2代和T3代的分離比統(tǒng)計(jì)，在T3代得到轉(zhuǎn)基因擬南芥單拷貝純合株系，隨機(jī)取兩個(gè)株系，命名為株系3和株系4。四、抗性檢測(cè)待測(cè)種子分別為：株系1的T3代種子、株系2的T3代種子、株系3的T3代種子、株系4的T3代種子、哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的種子。每1g氯嘧磺隆與5ml水混合，得到氯嘧磺隆溶液。1、將待測(cè)種子播種于MS固體培養(yǎng)基，萌發(fā)后繼續(xù)培養(yǎng)2周。2、完成步驟1的植物，噴施氯嘧磺隆溶液(噴施兩次，間隔3天)。3、完成步驟2后，繼續(xù)培養(yǎng)1周，統(tǒng)計(jì)存活率。培養(yǎng)條件：22℃、24小時(shí)光照(光強(qiáng)60μmol/m2/s)。每種待測(cè)種子進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)中每種待測(cè)種子取200粒種子。株系1的平均存活率為95％。株系2的平均存活率為98％。株系3的平均存活率為38％。株系4的平均存活率為42％。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的平均存活率為0％。結(jié)果表明，將UVALS基因或ALS1基因?qū)胫参铮梢燥@著提高植物對(duì)氯嘧磺隆的抗性，UVALS基因的效果顯著優(yōu)于ALS1基因。SEQUENCELISTING<110>東北農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>乙酰乳酸合成酶抑制劑抗性相關(guān)蛋白UVALS及其編碼基因與應(yīng)用<130>GNCYX162311<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>690<212>PRT<213>人工序列<400>1MetMetProMetArgProSerLysSerAlaMetArgAlaLeuHisTyr151015GlnArgTyrIleAlaSerGlyArgMetSerPheThrThrAlaSerVal202530AlaAlaThrAlaProHisArgPheSerAlaGlnLysArgPheGlnSer354045ThrAlaSerAlaProAlaGluAsnThrArgProIleProSerProAla505560PheAsnGlnGluProHisArgAsnGluValSerProLeuGlnAsnArg65707580GlnValProGluLeuAspAspSerPheValGlyLeuSerGlyGlyGlu859095IlePheHisGluMetMetLeuArgLeuGlyValLysHisValPheGly100105110TyrProGlyGlyAlaIleLeuProValPheAspAlaIleTyrAsnSer115120125LysHisPheAspPheValLeuProArgHisGluGlnGlyAlaGlyHis130135140MetAlaGluGlyTyrAlaArgAlaSerGlyLysProGlyValValLeu145150155160ValThrSerGlyProGlyAlaThrAsnValIleThrProMetGlnAsp165170175AlaLeuSerAspGlyThrProMetValValPheCysGlyGlnValPro180185190ThrSerLeuIleGlyThrAspSerPheGlnGluAlaAspValIleGly195200205IleSerArgAlaCysThrLysTrpAsnValMetValLysSerValAla210215220GluLeuProArgArgIleGlnGluAlaPheGluIleAlaThrSerGly225230235240ArgProGlyProValLeuValAspLeuProLysAspIleThrAlaGly245250255IleLeuArgLysProIleProMetAsnSerThrLeuProSerLeuPro260265270SerAlaAlaThrMetAlaAlaArgGluLeuSerMetGlnGlnLeuLys275280285GlyThrIleAsnArgValAlaArgLeuValAsnIleSerLysLysPro290295300IleLeuTyrValGlyGlnGlyLeuLeuAlaArgProAspGlyProGln305310315320IleLeuLysGluLeuAlaAspLysAlaCysIleProValThrThrThr325330335LeuGlnGlyLeuGlyGlyPheAspGluThrAspProLysAlaLeuHis340345350MetLeuGlyMetHisGlySerAlaTyrAlaAsnMetAlaMetGlnGlu355360365AlaAspLeuIleIleAlaIleGlyAlaArgPheAspAspArgValThr370375380GlyAsnIleSerLysPheAlaProGlnAlaLysLeuAlaAlaSerGlu385390395400AsnArgGlyGlyIleValHisPheGluIleMetProLysAsnIleAsn405410415LysValValGlnAlaAsnGluAlaValGluGlyAspCysAlaGluAsn420425430IleArgLeuLeuLeuProHisAlaGluAlaValAlaGluArgLysGlu435440445TrpPheAspGlnIleAsnAspTrpLysAlaArgPheProPheSerLeu450455460TyrGluArgGluThrAlaGluGlyProIleLysProGlnAlaValIle465470475480GluLysLeuSerAspLeuThrAlaHisMetLysAspArgThrAlaIle485490495ThrThrGlyValGlyGlnHisGlnMetTrpAlaAlaGlnHisPheArg500505510TrpArgHisProArgThrMetIleThrSerGlyGlyLeuGlyThrMet515520525GlyTyrGlyLeuProAlaAlaIleGlyAlaLysValAlaArgProAsp530535540AlaLeuValValAspIleAspGlyAspAlaSerPheAsnMetThrLeu545550555560ThrGluLeuThrThrAlaAlaGlnPheAsnIleGlyValLysValLeu565570575LeuLeuAsnAsnGluGluGlnGlyMetValThrGlnTrpGlnAsnLeu580585590PheTyrGluAspArgTyrSerHisThrHisGlnLysAsnProAspPhe595600605ValProMetAlaGlnAlaMetGlyValAlaAlaAspArgCysThrLys610615620ProSerGluValGluGluLysLeuLysTrpLeuIleGluGlnAspGly625630635640ProAlaLeuProGluValPheThrAspArgLysValProValLeuPro645650655MetValProAlaGlyCysAlaLeuHisGluPhePheValTyrAspGlu660665670AlaLysGluLysGluArgLysAlaLeuMetLysLysArgLysValPro675680685GlyPhe690<210>2<211>2073<212>DNA<213>人工序列<400>2atgatgcctatgagaccttcgaaaagcgccatgcgcgctctgcattaccagaggtacatt60gcctctggcagaatgagttttactactgcttccgtcgctgcgaccgcgccccaccgcttt120tcagctcagaagagattccagagcaccgcaagtgccccggctgaaaacacgagaccgatc180cccagccctgccttcaaccaggaacctcaccgcaatgaggtctcgccactgcaaaatcgc240caggtccccgaactggacgactcttttgtcggactcagtggaggagagatctttcatgag300atgatgctgcgtcttggcgtcaagcatgtcttcggttaccctggaggtgccattcttccc360gttttcgatgccatctacaactccaaacacttcgacttcgtcctcccgagacatgaacag420ggcgccggacacatggccgaaggctacgcccgtgcctctggaaagcccggtgtcgtcctc480gtcacctccggccctggagccaccaacgttatcacccccatgcaggatgccctttcggac540ggtactcccatggtcgtcttctgcggtcaggtgcccaccagcctgatcggtaccgactct600ttccaggaagccgatgttatcggtatctcccgtgcttgcaccaagtggaacgtcatggtc660aagtccgtcgctgaactcccccgtcgcatccaggaggctttcgaaatcgccaccagcggc720cgccccggacctgtcctcgtcgatctgcccaaggatatcaccgccggtatcctccgtaaa780cccatcccgatgaacagcaccctgccctccctccccagcgctgcgaccatggctgcccgt840gaactgagcatgcagcagctcaagggtaccatcaaccgtgtggctcgccttgtgaacatc900tccaagaagcccatcctgtatgtgggtcagggtctccttgctcgccccgatggcccccag960atcttgaaggagctggccgacaaggcttgcattccggtcaccacgaccctccagggtctg1020ggtggatttgacgagacggaccccaaggccctgcacatgctgggcatgcacggatctgcc1080tatgccaacatggccatgcaggaggctgatctcatcatcgctatcggtgctcgcttcgat1140gaccgtgtgaccggtaacatctccaagttcgcccctcaggccaagcttgctgcctcggag1200aaccgtggtggtatcgtccacttcgaaatcatgcccaagaacatcaacaaggttgtccag1260gccaacgaggctgttgagggtgactg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gcgcaagg2040ctctgatgaagaagcggaaagttcccggtttctaa2075當(dāng)前第1頁1 2 3