本發明屬于中藥現代化技術領域，涉及一種中藥化學對照品的制備方法，具體而言，本發明涉及一種從中藥材女貞子中快速分離特女貞苷對照品的方法。

背景技術：

女貞子又名冬青子，為木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實，是我國傳統的扶正固體藥物。《神農本草經》列之為上品，謂其“味苦平，主補中，安五臟，養精神，除百病”。具有滋補肝腎、明目烏發之功效，用于肝腎陰虛、頭昏目眩、耳鳴、腰膝疲軟、須發早白等癥。現代藥理學研究表明，女貞子具有提高機體免疫功能、增加白細胞、降血脂降血糖、抗菌消炎、降低眼壓、抗氧化作用、保肝護腎和抗癌，對心血管疾病也有較好的療效。臨床上常用語治療骨質疏松、結腸癌、肺癌等疾病。

特女貞苷(Specnuezhenide)，分子式為C₃₁H₄₂O₁₇，結構式如下：

女貞子的主要活性成分有三萜類、環烯醚萜類、苯乙醇類和黃酮類等成分，而特女貞苷是女貞子中含量最高環烯醚萜苷類化合物，因此2010版《中國藥典》選擇特女貞苷作為女貞子的鑒別和含量測定用對照品，用以控制女貞子的藥材質量。所以特女貞苷對照品的需求量越來越大，而目前國內關于特女貞苷分離純化的文獻報道較少，即使有少量專利文獻報道了特女貞苷的分離純化，方法，所得的特女貞苷純度也并不高，比如申請號為201110337108.6的專利申請公開了“一種特女貞苷的制備方法”和申請號為200910093290.8的專利申請公開了“一種女貞子專屬性成分特女貞苷的分離純化工藝”，兩篇專利中所得的特女貞苷的純度僅在98％以上。如申請號為201010186867.2的專利申請公開了“一種特女貞苷的制備方法”，該方法采用甲醇或乙醇作為重結晶所用的溶劑，所得的特女貞苷的純度為98.1％。

因此制備高純度的特女貞苷對照品方法顯得非常必要，通過本發明所涉及的制備方法得到的特女貞苷對照品純度高于全部現有技術方案所得的特女貞苷的純度，本制備方法具有廣泛的應用價值。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種從女貞子藥材中分離特女貞苷對照品的制備方法。該方法簡便易行、消耗溶劑少、得率高，適于工業化生產。

本發明的第一方面提供了一種特女貞苷對照品的制備方法，所述的方法包括以下步驟：

(i)提供特女貞苷醇提物；

(ii)所述的特女貞苷醇提物與溶劑混合，得到第一混合物，并利用中壓制備柱對所述的第一混合物進行過柱分離，從而獲得特女貞苷粗品；

(iii)利用純水對所述的特女貞苷粗品進行重結晶；和

(iv)分離并干燥步驟(iii)中所得的結晶物，即獲得特女貞苷對照品。

在另一優選例中，所述的純水的電導率≤18.2μs/cm。

在另一優選例中，所述步驟(ii)中的中壓制備柱的柱壓下限選自下組：0MPa、0.1MPa、0.2MPa、0.3MPa、0.4MPa、或0.5MPa。

在另一優選例中，所述步驟(ii)中的中壓制備柱的柱壓上限選自下組：2MPa、2.1MPa、2.2MPa、2.3MPa、2.4MPa、或2.5MPa。

在另一優選例中，所述步驟(ii)中的中壓制備柱設有柱壓0-2MPa,較佳地為0.5-2MPa。

此處，當中壓制備柱的柱壓為0MPa時，是指中壓制備柱處于標準大氣壓狀態。

在另一優選例中，所述步驟(ii)中的中壓制備柱的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠。

在另一優選例中，所述步驟(ii)中的中壓制備柱的填料粒徑為40-60μm。

在另一優選例中，所述步驟(ii)的中壓制備柱中使用的洗脫劑為體積比20-50％(v/v)的甲醇溶液。

在另一優選例中，所述步驟(ii)的中壓制備柱中洗脫劑流速為50-70ml/min。

在另一優選例中，步驟(ii)中選擇甲醇為溶劑與所述的特女貞苷醇提物混合，用以溶解所述的特女貞苷醇提物。

在另一優選例中，所述的特女貞苷粗品純度≥95.0％

在另一優選例中，所述的特女貞苷醇提物由包括以下步驟的方法制備得到：

(i-1)混合女貞子藥材和乙醇溶液，在50-80℃下進行醇提，固液分離后濃縮液體部分，從而獲得第一濃縮液；

(i-2)使用大孔樹脂吸附所述的第一濃縮液，然后分別用2-3倍量柱體積的水和1-3倍量柱體積的15-25％乙醇溶液洗脫雜質，再用1-3倍量柱體積的35-50％(v/v)乙醇溶液洗脫目標物質，收集洗脫液，濃縮以獲得第二濃縮液；和

(i-3)使用硅膠柱層析分離所述的第二濃縮液采用乙酸乙酯:甲醇:水洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮以獲得步驟(i)中所述的特女貞苷醇提物。

在另一優選例中，所述的乙酸乙酯:甲醇:水洗脫劑中各組分的體積比為20:1:0-10:1:0.1。

在另一優選例中，所述的乙醇溶液與女貞子藥材以體積質量比(L/kg)為10-20倍量混合。

在另一優選例中，所述步驟(i-1)中的乙醇溶液的體積百分比濃度為45-55％(v/v)。

在另一優選例中，所述的大孔樹脂的原料包括苯乙烯型非極性共聚體。

在另一優選例中，所述的大孔樹脂的粒徑為0.3-1.25mm。

在另一優選例中，所述的大孔樹脂的孔隙率≥90％。

本發明的第二方面提供了一種特女貞苷對照品，所述的特女貞苷對照品由如本發明第一方面所述的方法制備所得。

在另一優選例中，所述的特女貞苷對照品純度≥99.0％，較佳地，純度≥99.3％，更佳地，純度≥99.4％。

在另一優選例中，所述的特女貞苷對照品含有≤0.077％的新女貞苷。

在另一優選例中，所述的特女貞苷對照品含有≤0.55％的女貞苷雜質。

應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1為實施例1所得特女貞苷對照品的HPLC檢測圖譜。

具體實施方式

本發明人經過廣泛而深入地研究，首次研發出一種高純度特女貞苷對照品的制備方法。本制備方法采用中壓制備柱分離純化特女貞苷醇提物，在一定的壓強下，分離效率大大提高。通過純水重結晶特女貞苷，進一步提高特女貞苷的純度。在此基礎上，完成了本發明。

本發明一種優選的技術方案如下：

A.原料提取：將女貞子藥材粉碎，按照體積質量比L/Kg加入10倍量的乙醇溶液，所使用的乙醇溶液的體積百分比濃度為45-55％；將女貞子藥材和乙醇溶液在60℃下熱提取至少2次，每次大約2小時，冷卻至室溫，抽濾，合并濾液，濃縮至無醇味；

B.大孔樹脂富集：將步驟A的濃縮液用大孔樹脂靜態吸附過夜，所使用的大孔樹脂為D101型。然后分別用2-3倍量柱體積的水和1-3倍量柱體積的20％乙醇溶液洗脫雜質，再用1-3倍量柱體積的40％乙醇溶液洗脫目標物質，收集洗脫液，濃縮至原體積的1/10；

C.硅膠柱層析：將步驟B的濃縮液用100-200目硅膠拌樣，烘干后碾碎，取200-300目硅膠，乙酸乙酯濕法裝柱。上樣后，采用乙酸乙酯：甲醇：水洗脫劑，并按20:1:0-10:1:0.1的體積比由高到低梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，濃縮得特女貞苷半成品；

D.中壓制備：將步驟C的特女貞苷粗品用甲醇溶解上中壓制備柱，用35％甲醇洗脫，濃縮得到純度為95％左右的特女貞苷粗品。中壓制備柱設有柱壓0-2MPa,較佳地為0.5-2MPa，此處，當中壓制備柱的柱壓為0MPa時，是指中壓制備柱處于標準大氣壓狀態；

產品回收：將步驟D得到95％左右的特女貞苷粗品加純水超聲溶解，轉移至4℃冰箱中冷藏結晶，等晶體析出后，抽濾固體，再重新用純水加熱溶解后重結晶，重復操作2次，冷凍干燥后得純度為99.3％以上特女貞苷對照品。

本發明的主要優點

1、工藝步驟少，耗時短，得率高，操作簡便，易于工業化生產；

2、溶劑消耗少，工藝過程中的溶劑均可回收再利用；

3、綠色環保，所有有機試劑均回收，無排放，無環境污染。

4、具有較高的學術價值。目前國內關于特女貞苷分離純化的文獻報道較少，用純水重結晶用于特女貞苷對照品的分離純化屬首次。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。

實施例1

A.原料提取：將女貞子藥材1kg粉碎成粗粉，加入10L體積分數為50％的乙醇溶液，在60℃下熱提取2次，每次2小時，冷卻至室溫，抽濾，合并濾液，濃縮至無醇味，共1000ml；

B.大孔樹脂富集：稱取3KgD101大孔吸附樹脂裝柱，將步驟A的濃縮液用大孔樹脂靜態吸附過夜16個小時，然后分別用3L的水和2L柱體積的20％乙醇溶液洗脫雜質，再用3L的40％乙醇溶液洗脫目標物質，收集洗脫液，濃縮至100ml；

C.硅膠柱層析：將步驟B的100ml濃縮液用100-200目硅膠150g拌樣，烘干后碾碎，取200-300目硅膠2kg，用乙酸乙酯濕法裝柱。上樣后，采用乙酸乙酯：甲醇：水洗脫劑，并按20:1:0-10:1:0.1的體積比由高到低梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，濃縮得特女貞苷半成品60g；

D.中壓制備：將步驟C的特女貞苷粗品60g用20ml的甲醇溶解上中壓制備柱，用35％甲醇洗脫，濃縮得到純度為95％左右的特女貞苷粗品50g；

E.產品回收：將步驟D得到95％左右的特女貞苷粗品50g加40ml純水超聲溶解，轉移至4℃冰箱中冷藏6小時，等晶體析出后，抽濾固體，再重新用純水加熱溶解后重結晶，重復操作2次，冷凍干燥后得特女貞苷對照品43g。

圖1為所得特女貞苷對照品的HPLC檢測圖譜。經HPLC分析，所得特女貞苷對照品的純度為99.3％。

實施例2

A.原料提取：將女貞子藥材5kg粉碎成粗粉，加入50L體積分數為55％的乙醇溶液，在60℃下熱提取2次，每次2小時，冷卻至室溫，抽濾，合并濾液，濃縮至無醇味，共5000ml；

B.大孔樹脂富集：稱取18KgD101大孔吸附樹脂裝柱，將步驟A的濃縮液用大孔樹脂靜態吸附過夜18個小時，然后分別用15L的水和10L柱體積的20％乙醇溶液洗脫雜質，再用15L的40％乙醇溶液洗脫目標物質，收集洗脫液，濃縮至500ml；

C.硅膠柱層析：將步驟B的500ml濃縮液用100-200目硅膠600g拌樣，烘干后碾碎，取200-300目硅膠10kg，用乙酸乙酯濕法裝柱。上樣后，采用乙酸乙酯：甲醇：水洗脫劑，并按20:1:0-10:1:0.1的體積比由高到低梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，濃縮得特女貞苷半成品310g；

D.中壓制備：將步驟C的特女貞苷粗品310g用100ml的甲醇溶解上中壓制備柱，用35％甲醇洗脫，濃縮得到純度為95％左右的特女貞苷粗品270g；

E.產品回收：將步驟D得到95％左右的特女貞苷粗品270g加200ml純水超聲溶解，轉移至4℃冰箱中冷藏8小時，等晶體析出后，抽濾固體，再重新用純水加熱溶解后重結晶，重復操作2次，冷凍干燥后得冷凍干燥后得特女貞苷對照品220g。

所得特女貞苷對照品經HPLC分析，純度為99.4％。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。