本發明涉及醫藥技術領域，具體地，涉及一種噻吩并[3,2-d]嘧啶類egfr/erbb2雙靶點抑制劑及其制備方法。本發明提供的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物對egfr和erbb2蛋白酪氨酸激酶均具有明顯的抑制作用，可作為抗腫瘤藥物或先導化合物。

背景技術：

癌癥是嚴重威脅人類生命健康的最主要疾病之一，攻克癌癥一直是舉世矚目的研究課題。半個多世紀以來，癌癥化療取得了長足的發展，其中細胞毒性類藥物對一些類型的腫瘤表現出良好療效，而且在當前和今后相當長的一段時期內傳統細胞毒性藥物仍將是癌癥化療藥物的主體。然而，細胞毒性藥物存在著毒副作用大、選擇性差、易產生耐藥性等主要缺陷致使其對大多數類型腫瘤的療效尚難令人滿意。因此，臨床上迫切需要尋找高效、低毒、特異性好的抗腫瘤藥物。

隨著腫瘤生物學及相關學科的飛速發展，人們逐漸認識到細胞癌變的本質是細胞信號轉導通路的失調導致細胞無限增生，隨之帶來抗腫瘤藥物研發理念的重大轉變，正從傳統細胞毒性類藥物向針對腫瘤發生發展過程中眾多環節的新藥方向發展，特別是靶向藥物能針對正常細胞與腫瘤細胞之間的差異，達到選擇性強、高效低毒的治療效果，從而克服傳統細胞毒性藥物的選擇性差、毒副作用強、易產生耐藥性等缺點，使惡性腫瘤進入“靶向治療”新時代。近年來，以蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinases,ptks)為靶點進行藥物研發已成為國際抗腫瘤藥物研究的熱點，其中，表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)家族是一類主要的蛋白酪氨酸激酶，包括egfr(erbb1)、erbb2、erbb3、erbb4等四個成員，其胞內區有atp結合位點，egfr類抑制劑可以競爭性與atp結合位點相結合，從而抑制egfr的磷酸化過程，阻斷下游信號的傳導，進而抑制腫瘤細胞的生長、分化和轉移。egfr作為抗腫瘤靶點的生化過程正在被逐步闡明，其晶體結構和活性部位也已經比較清楚，以此為靶點的吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)和拉帕替尼(lapatinib)等芳胺基喹唑啉類藥物已經應用于臨床，egfr類抑制劑的研究方興未艾。

腫瘤發生的原因和機制非常復雜，往往涉及多種蛋白結構和功能的變化，試圖通過單靶點藥物阻斷某個受體來阻斷腫瘤細胞信號轉導并不全面，療效往往也不夠樂觀，有可能引起耐藥性。因此，研發多靶點抗腫瘤藥物是解決“靶向治療”諸多問題的一條有效途徑。多靶點藥物能同時作用于某一疾病相關病原體的多個分子靶點，與現在臨床上常用的細胞毒性藥物相比，多靶點藥物具有高效、低毒、特異性高且不易產生耐藥性等優點。隨著腫瘤發生機制的逐步揭示，“多靶向”將為腫瘤治療開辟一片新的天地。

技術實現要素：

本發明提供一種噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物及其制備方法和用途，所述化合物對egfr和/或erbb2蛋白酪氨酸激酶具有抑制活性。

本發明的技術方案如下：

一種通式(1)所示的化合物及其藥學上可接受的鹽：

其中，

r¹選自c1-6烷基、芳基、c1-6烷基芳基；

r²相同或不同，選自h、鹵素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、鹵代c1-6烷基、鹵代c1-6烷氧基、c2-6烯基、c2-6炔基、硝基、氨基，或者兩個相鄰的r²與所連接的碳一起形成3-8元環，

n為0到5的整數。

根據本發明，所述烷基指具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，優選烷基的實例為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基。

根據本發明，所述烯基指具有2-6個碳原子的直鏈或支鏈烯基，優選烯基的實例為乙烯基、丙烯基或異丙烯基。

根據本發明，所述炔基指具有2-6個碳原子的直鏈或支鏈炔基，優選炔基的實例為乙炔基、丙炔基、丁炔基。

根據本發明，所述烷氧基指具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，優選甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基。

根據本發明，所述鹵素為氟、氯、溴、碘，優選為氟、氯、溴。

根據本發明，所述芳基指具有6-20個(優選6-14個)碳原子的單環或多環芳族基團，代表性的芳基選自：苯基、萘基、蒽基等。

根據本發明，所述兩個相鄰的r²與所連接的碳一起形成的環可以為碳環或者雜環，所述雜環的雜原子可為n、o、s。

根據本發明的優選技術方案，r¹選自c1-3烷基、芳基、c1-3烷基芳基；r²選自h、鹵素、c1-3烷基、c1-3烷氧基、鹵代c1-3烷基、鹵代c1-3烷氧基、c2-3烯基、c2-3炔基，兩個相鄰的r²與所連接的碳一起形成3-6元環；n為1，2，3。

根據本發明更優選的技術方案，r¹為苯基；r²為h、f、cl、br、甲氧基、三氟甲基、乙炔基，或者兩個相鄰的r²與所連接的碳一起形成二氧雜環戊烷。

優選的，所述通式(1)化合物選自如下具體化合物：

根據本發明，通式(1)化合物可以與藥學上可接受的酸形成藥學上可接受的鹽。其中術語“藥學上可接受的鹽”包括但不限于與無機酸形成的鹽，如鹽酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、亞磺酸鹽、硝酸鹽、及其類似鹽；也包括與有機酸形成的鹽，如乳酸鹽、草酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、水楊酸鹽、醋酸鹽，及其類似鹽。

本發明還提供一種制備通式(1)化合物及其藥學上可接受的鹽的制備方法，包括：

其中，r¹、r²、n如上所述，r³為c1-6烷氧基；

1)將式(4)化合物與式(6)化合物進行反應，得到式(5)化合物；

2)將步驟1)中得到的式(5)化合物在堿性條件下進行反應，得到式(1)化合物；

3)任選地，將步驟(2)得到的化合物進一步與藥學上可接受的酸形成藥學上可接受的鹽。

根據本發明，對于步驟1)，所述反應在酸性條件下進行，例如冰醋酸。所述反應溫度優選為50-150℃，更優選60-120℃。優選的，加熱方式可以為普通加熱或微波加熱。

根據本發明，對于步驟2)，所述堿可以為無機堿，例如氫氧化鋰、氫氧化鈉等，所述反應在溶劑下進行，例如在醇類溶劑(如乙醇)中。所述反應溫度優選為50-150℃，更優選60-120℃。

根據本發明，所述式(4)化合物可以通過如下方法制備，所述方法包括：

其中，r¹如上所述，r³為c1-6烷氧基。

本發明還提供一種藥物組合物，其包括上述通式(1)所述的化合物或其藥學上可接受的鹽。

根據本發明，所述藥物組合物還包括至少一種藥學上可接受的、惰性的、無毒的賦形劑或載體或稀釋劑；優選的進一步包含一種或多種選自填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、矯味劑、防腐劑和包衣材料的藥學可接受的輔助材料。

根據本發明，所述藥物組合物可制成制劑形式，例如固體口服制劑、液體口服制劑或注射劑等。

根據本發明，所述的制劑可為片劑、分散片、腸溶片、咀嚼片、口崩片、膠囊、顆粒劑、口服溶液劑、注射用水針、注射用凍干粉針、大輸液或小輸液。

本發明還提供一種上述通式(1)化合物或其藥學上可接受的鹽在制備用于抑制egfr和/或erbb2蛋白酪氨酸激酶藥物中的應用。

本發明還提供了一種上述通式(1)化合物或其藥學上可接受的鹽在制備用于抗腫瘤或癌癥藥物中的應用。

本發明所述的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物合成路線短、制備方法簡單、原料來源方便、易于實現工業化。這些化合物對egfr和/或erbb2蛋白酪氨酸激酶均具有明顯的抑制作用，與商品化雙靶點抗腫瘤藥物bibw2992的活性相當。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外，應理解，在閱讀了本發明所記載的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本發明所限定的范圍。以下實施例中，¹hnmr和¹³cnmr采用brukeravance400型超導核磁共振儀進行測試。

本發明化合物的合成路線如下：

實施例1式(1-1)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物的制備

1)在150ml圓底燒瓶中將11.31g(0.10mol)氰基乙酸乙酯和5.61g(0.10mol)koh溶解在50ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，0～5℃下攪拌3h，緩慢滴加13.52g(0.10mol)異硫氰酸苯酯，1h內加完，冰水浴下繼續攪拌3h。然后，緩慢滴加7.55g(0.10mol)氯乙腈的dmf溶液，1h加完，室溫下攪拌過夜。反應完畢，將反應液倒入100g碎冰中，析出大量黃色固體，抽濾、少量甲醇洗滌、干燥得棕色固體即為式(2’)所示化合物(產率為65％)，

2)于150ml圓底燒瓶中將2.87g(0.01mol)式(2’)所示化合物和1.98g(0.03mol)乙醇鈉溶解在50ml無水乙醇中，回流反應3h。冷卻至室溫，將反應液加入到100ml蒸餾水中，靜置析出大量黃色固體，抽濾、干燥，無水乙醇重結晶得黃色晶體為式(3’)所示化合物(產率為60％)，

3)在100ml圓底燒瓶中加入2.87g(0.01mol)式(3’)所示化合物和1.19g(0.01mol)n,n-二甲基甲酰胺二甲縮醛(dmf-dma)和15ml無水乙腈，回流反應2h。減壓濃縮，無水乙腈重結晶得無色晶體為式(4’)所示化合物(產率為82％)，

4)取3.42g(0.01mol)式(4’)所示化合物和0.93g(0.01mol)苯胺溶解在50ml冰醋酸中，回流反應3h(替換的反應條件：微波加熱，功率100w，溫度125℃，反應30min)。反應完畢，冷卻至室溫，將反應液加入100ml蒸餾水中，析出大量固體。抽濾、水洗、干燥，dmf重結晶得無色晶體為式(5-1)所示化合物(產率為85％)，

5)在150ml圓底燒瓶中加入3.90g(0.01mol)式(5-1)所示化合物、2.39g(0.10mol)氫氧化鋰和50ml的70％乙醇，90℃下反應4h。冷卻至室溫，將反應液加入到100ml蒸餾水中，用10％稀鹽酸調節ph呈中性，析出大量固體，柱色譜分離(硅膠，展開劑：v石油醚:v乙酸乙酯＝2:1)得白色固體即為式(1-1)所示化合物(產率為73％)，

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:11.22(s,1h,nh),10.81(s,1h,nh),8.71(s,1h,pyrimidylh),7.44-7.15(m,10h,ar-h),6.75(s,1h,thienylh)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:160.92,154.21,149.76,147.88,140.76,137.48,130.18,129.25,126.29,124.87,124.56,119.70,102.95,93.77。

實施例2式(1-2)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物的制備

制備方法基本與實施例1所述的方法相同，不同的是，步驟4)中用3-氟苯胺代替苯胺，從而制得式(1-2)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物(最后一步的產率為71％)，

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:11.26(s,1h,nh),10.88(s,1h,nh),8.77(s,1h,pyrimidylh),7.46-7.18(m,9h,ar-h),6.75(s,1h,thienylh)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:163.52,161.17,153.79,150.17,148.05,140.71,139.77,130.81,130.24,124.71,119.84,119.62,112.29,110.91,103.79,93.77。

實施例3式(1-3)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物的制備

制備方法基本與實施例1所述的方法相同，不同的是，步驟4)中用3-氯苯胺代替苯胺，從而制得式(1-3)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物(最后一步的產率為75％)，

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.92(s,1h,nh),9.42(s,1h,nh),8.49(s,1h,pyrimidylh),8.02-7.03(m,9h,ar-h),6.64(s,1h,thienylh)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:162.35,155.31,154.48,153.35,142.10,141.90,133.22,130.53,130.04,122.72,122.48,120.65,119.63,118.28,105.91,101.03。

實施例4式(1-4)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物的制備

制備方法基本與實施例1所述的方法相同，不同的是，步驟4)中用3-氯-4-氟苯胺代替苯胺，從而制得式(1-4)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物(最后一步的產率為72％)，

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.92(s,1h,nh),9.41(s,1h,nh),8.47(s,1h,pyrimidylh),8.12-7.03(m,8h,ar-h),6.64(s,1h,thienylh)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:162.27,155.27,154.43,153.34,152.04,142.11,137.57,130.01,122.83,122.69,121.75,1119.30,118.25,117.10,105.62,101.04。

實施例5式(1-5)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物的制備

制備方法基本與實施例1所述的方法相同，不同的是，步驟4)中用3-溴苯胺代替苯胺，從而制得式(1-5)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物(最后一步的產率為74％)，

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.92(s,1h,nh),9.40(s,1h,nh),8.49(s,1h,pyrimidylh),8.14-7.03(m,9h,ar-h),6.64(s,1h,thienylh)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:162.35,155.31,154.49,153.33,142.10,142.04,130.84,130.04,125.38,123.47,122.72,121.74,120.03,118.27,105.90,101.02。

實施例6式(1-6)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物的制備

制備方法基本與實施例1所述的方法相同，不同的是，步驟4)中用3-甲氧基苯胺代替苯胺，從而制得式(1-6)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物(最后一步的產率為72％)，

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:11.21(s,1h,nh),10.78(s,1h,nh),8.73(s,1h,pyrimidylh),7.45-6.85(m,9h,ar-h),6.74(s,1h,thienylh),3.78(s,3h,och3)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:161.06,159.90,154.22,149.70,147.79,140.73,138.59,130.22,130.07,124.65,119.78,116.96,111.75,110.66,102.99,93.63,55.71。

實施例7式(1-7)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物的制備

制備方法基本與實施例1所述的方法相同，不同的是，步驟4)中用3,4-亞甲二氧基苯胺代替苯胺，從而制得式(1-7)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物(最后一步的產率為68％)，

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.93(s,1h,nh),9.20(s,1h,nh),8.37(s,1h,pyrimidylh),7.36-6.91(m,8h,ar-h),6.61(s,1h,thienylh),6.03(s,2h,och2o)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:161.87,154.89,154.52,154.22,147.37,143.89,142.26,133.81,129.97,122.43,118.01,116.27,108.24,105.46,104.86,101.51,100.88。

實施例8式(1-8)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物的制備

制備方法基本與實施例1所述的方法相同，不同的是，步驟4)中用3-三氟甲基苯胺代替苯胺，從而制得式(1-8)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物(最后一步的產率為69％)，

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.94(s,1h,nh),9.56(s,1h,nh),8.50(s,1h,pyrimidylh),8.23-7.04(m,9h,ar-h),6.65(s,1h,thienylh)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:162.40,155.41,154.46,153.33,142.09,141.25,130.06,130.04,129.83(q,²jf-c＝31hz,c-cf3),126.10(q,¹jf-c＝270hz,cf3),124.63,122.75,118.97,118.31,117.17,105.97,101.02。

實施例9式(1-9)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物的制備

制備方法基本與實施例1所述的方法相同，不同的是，步驟4)中用3-乙炔基苯胺代替苯胺，從而制得式(1-9)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶類化合物(最后一步的產率為70％)，

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.90(s,1h,nh),9.35(s,1h,nh),8.47(s,1h,pyrimidylh),7.97-7.02(m,9h,ar-h),6.63(s,1h,thienylh),4.20(s,1h,≡ch)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:162.27,155.18,154.53,153.51,142.13,140.49,130.03,129.37,126.27,124.34,122.67,122.19,118.22,105.75,101.06,84.12,80.94。

實施例10：體外激酶抑制活性篩選

實驗方法：

(1)實驗目的

實驗采用化學發光法(chemicalluminescenceassay)測試本發明化合物樣品對egfr和erbb2兩種激酶的抑制率，所測試化合物采用系列梯度稀釋濃度測試ic50值，實驗采用erlotinib及bibw2992作為陽性對照藥。

(2)實驗材料

實驗試劑均為市面上購置，見表1。

表1實驗試劑

(3)實驗儀器及耗材

96孔酶標板：corning公司，平底型；酶標儀：biotek公司，synergy2microplatereader型；振蕩器：江蘇新康醫療器械有限公司，xk96-3型；低速離心機：上海安亭科學儀器廠，tgl-16b型；恒溫箱：天津通利信達儀器廠，fcd-3000型。

(4)實驗步驟

①用dmso將樣品溶解為10mm的母液。egfr激酶檢測時，將樣品用dmso稀釋為1mm，然后用10％的dmso水溶液稀釋為10μm，接著用10％的dmso水溶液對樣品進行5倍梯度稀釋，共10個濃度；erbb2激酶檢測時，將樣品用dmso稀釋為1mm，然后用10％的dmso水溶液稀釋為100μm，接著用10％的dmso水溶液對樣品進行5倍梯度稀釋，共10個濃度；

②配制1×的激酶測定緩沖液(kinaseassaybuffer：40mm的tris,ph7.4,10mm的mgcl2,0.1mg/ml的bsa,1mm的dtt)；

③在96孔酶標板中加入5μl的poly(glu,tyr)(終濃度為0.2mg/ml)到每孔中，之后每孔再加入5μl的atp溶液(終濃度為10μm)；

④接著每孔加入30μl的激酶測定緩沖液(kinaseassaybuffer)到孔中，再把5μl待篩選的樣品溶液加入到每孔中，微板震蕩器上進行混勻3min；

⑤然后每孔加入5μl的激酶，再混勻3min；

⑥在30℃避光反應30min；

⑦最后每孔加入50μl的激酶-glo測定緩沖液(kinase-gloassaybuffer)，反應5min；

⑧把96孔酶標板放入化學發光檢測酶標儀中檢測，數值代入以下公式：

％活性＝{(lut-lu)/(lut-luc)}×100％

其中，lu：為各濃度樣品孔的化學發光值；

lut：為不含激酶的本底孔的化學發光值；

luc：為不含樣品的溶劑對照孔的化學發光值；

⑨用prismgraphpad軟件計算ic50值。

化合物對egfr和erbb2兩種激酶的抑制ic50見表2。實驗結果表明，本發明的化合物對egfr和erbb2激酶具有明顯的抑制活性，尤其是化合物(1-9)的活性略優于商品化的egfr抑制劑erlotinib，與商品化的egfr/erbb2雙靶點抗腫瘤藥物bibw2992相當，因此可用于治療含有上述靶點的腫瘤。

表2

以上，對本發明的實施方式進行了說明。但是，本發明不限定于上述實施方式。凡在本發明的思想和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。