本發明涉及微藻養殖技術領域，尤其涉及一種濃縮卵囊藻的培養方法。

背景技術：

微藻是一類在陸地、海洋分布廣泛，營養豐富、光合利用度高的自養植物，微藻營養成分非常豐富，富含蛋白質、氨基酸、多糖、維生素、不飽和脂肪酸和色素等多種高附加值的生物物質，具體可以概括為以下四類：蛋白質、糖類、酯類、核酸及各種礦物質。根據統計，微藻典型的營養組成是：蛋白質含量為40％～60％，總糖含量為10％～30％，總酯含量為10％～30％。不同種類的微藻營養組成相差很大。但大多數微藻的原生質成分密度都比水大，其中糖類的密度約為1500kg/m³，蛋白質約為1300kg/m³，核酸約為1700kg/m³，只有脂類物質的密度小于水的密度(最輕的約為860kg/m³)。

微藻作為對蝦養殖系統中重要的生物因子，已經成功應用于對蝦養殖中；尤其是波吉卵囊藻是湛江地區對蝦高位池養殖中后期蝦池中常見的優勢種，波吉卵囊藻(Oocystis borgei)隸屬于綠藻門，綠藻綱，綠球藻目，卵囊藻科，卵囊藻屬，由2、4、8、16個橢圓形或卵形的細胞組成以群體形式生活。

但多數蝦農沒有種藻及培藻技能，因此對有效的微藻制劑的需求不斷擴大，而現階段微藻制劑在市面上難以流通，其中主要因素是微藻的活體濃縮技術不夠完善?，F有的微藻濃縮技術主要包括沉降、氣浮、離心、過濾等。沉降和氣浮首先是使微藻絮凝，而目前在對微藻絮凝技術上多采用預氧化、化學絮凝、電場絮凝等，常見的預氧化處理包括臭氧化、預氯化、和高錳酸/高鐵酸預氧化等，通過改變細胞表面和微藻培養液的性質，使之更易絮凝；化學絮凝多采用金屬鹽和高分子聚合物等陽離子絮凝劑，通過吸附電中和、吸附架橋和網捕沉淀作用使微藻細胞絮凝沉降，其中以鐵系金屬鹽和鋁系金屬鹽為代表；電場絮凝，在外加電場的作用下，使藻細胞在載體表面形成大的絮凝塊。離心是目前應用最為廣泛的微藻濃縮方法，分離效果相對較高。過濾是常用固液分離法，也可應用于微藻的濃縮中。但是上述幾種方法存在損害微藻細胞、成本高昂的缺陷。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種不損害細胞并且成本低廉的濃縮卵囊藻的培養方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種濃縮卵囊藻的培養方法，將藻種接種至卵囊藻培養基中，在溫度為22～35℃，光照強度為600～1000lux的條件下進行培養；所述卵囊藻培養基包括湛水107-13培養液和植物激素；所述卵囊藻培養基的海水比重為1.008～1.016；

所述培養過程中，維持藻液中C：N比高于10:1；所述培養過程中，藻液的pH值維持在8.0～8.8之間。

優選的，采用向藻液中通入空氣和CO₂的混合氣體來維持藻液的C：N和pH值。

優選的，所述混合氣體的通入速度為0.6～0.8vvm。

優選的，所述植物激素包括6-芐氨基嘌呤和2.4-二氯苯氧乙酸。

優選的，所述6-芐氨基嘌呤在卵囊藻培養基中的濃度為0.3～0.5mg/L。

優選的，所述2.4-二氯苯氧乙酸在卵囊藻培養基中的濃度為1～6mg/L。

優選的，所述培養在藻液中卵囊藻總細胞濃度達到2.5～3.5×10⁵個/ml時停止。

優選的，所述培養的時間為9～11天。

優選的，所述湛水107-13培養液以海水為溶劑，每升海水中包括80mg的NaNO₃、8mg的K₂HPO₄、0.2mg的FeC₆H₅O₇、200μg的維生素B₁、0.5～1.5μg的維生素B₁₂和1g的NaHCO₃。

優選的，所述光照的光源包括室外光和熒光燈，所述光照時間為24h/d。本發明的有益效果：本發明提供的濃縮卵囊藻的培養方法通過調節卵囊藻培養的溫度和鹽度增加多糖包被內卵囊藻8、卵囊藻16細胞群體在總卵囊藻細胞群體的比例至45％以上，增加卵囊藻群體半徑；并且通過添加植物激素，促進卵囊藻氨基酸的合成，增加卵囊藻細胞群體的密度；另外通過調節藻液的pH，減少卵囊藻的靜電阻力，使卵囊藻更易絮凝。本發明提供的方法在確保卵囊藻細胞活性完好的條件下，增加卵囊藻細胞群體半徑和密度，使卵囊藻的沉降速度提升1.5倍以上，縮短沉降時間，節約卵囊藻規模化養殖的成本。

具體實施方式

本發明的目的在于通過優化卵囊藻的培養基和培養條件，增加多糖包被內卵囊藻8、卵囊藻16細胞群體在總卵囊藻細胞群體的比例，增加卵囊藻細胞群體半徑和密度，使卵囊藻的沉降速度提升，縮短沉降時間；使得卵囊藻細胞群體自然沉降即可實現濃縮。

本發明提供了一種濃縮卵囊藻的培養方法，將藻種接種至卵囊藻培養基中，在溫度為22～35℃，光照強度為600～1000lux的條件下進行培養；所述卵囊藻培養基包括湛水107-13培養液和植物激素；所述卵囊藻培養基的鹽度為1.008～1.016；所述培養過程中，維持藻液中C：N比高于10:1；所述培養過程中，藻液的pH值維持在8.0～8.8之間。

在本發明中，所述卵囊藻優選的為波吉卵囊藻，所述卵囊藻藻種的濃度優選的為(3～4)×10⁸個/L，更優選的為(3.2～3.8)×10⁸個/L。本發明對所述藻種的來源沒有特殊限定，采用健康無污染的波吉卵囊藻即可。

在本發明中，所述卵囊藻培養基包括湛水107-13營養液；本發明中所述湛水107-13培養液以海水為溶劑，每升海水中優選包括80mg的NaNO₃、8mg的K₂HPO₄、0.2mg的FeC₆H₅O₇、200μg的維生素B₁、0.5～1.5μg的維生素B₁₂和1g的NaHCO₃。在本發明中，所述海水優選為過濾、消毒后的海水，所述過濾優選采用膜過濾的方法，所述膜過濾使用的濾膜規格優選為2μm；所述海水的消毒優選的采用50％強氯精，所述消毒的時間優選的為12h。本發明在海水消毒后，優選的采用硫代硫酸鈉中和海水中殘留的氯，暴氣20～30h確保海水總殘留的氯全部消除。

本發明中，所述卵囊藻的培養基包括植物激素，所述植物激素優選包括細胞分裂素6-芐氨基嘌呤和生長素2.4-二氯苯氧乙酸。在本發明中，所述細胞分裂素6-芐氨基嘌呤作為細胞分裂素在培養基中的濃度優選為0.3～0.5mg/L；更優選為0.4mg/L；所述2.4-二氯苯氧乙酸作為生長素在培養基中的濃度優選為1～6mg/L，更優選為2～5mg/L，最優選的為3～4mg/L。本發明中所述植物激素能夠增加卵囊藻細胞的干重以及卵囊藻細胞中氨基酸含量；從而增加卵囊藻細胞群體的密度。

在本發明中，所述卵囊藻培養基的鹽度為1.008～1.016，優選為1.010～1.014，更優選的為0.011～0.013。

在本發明中，所述卵囊藻培養的溫度為22～35℃，優選的為25～30℃，更優選為26～28℃；所述卵囊藻培養過程中光照優選采用室外光和熒光燈相結合的方式作為光源，所述光照時間優選為24h/d，所述卵囊藻培養的光照強度為

600～1000lux，優選為700～900lux，更優選的為750～850lux。

本發明中，所述卵囊藻在培養過程維持藻液中C：N比高于10:1，藻液的pH值在8.0～8.8之間。在本發明中，所述藻液的C：N比優選的為(10～15):1。本發明優選采用向藻液中通入包括空氣和CO₂的混合氣體的方式維持藻液的碳氮比和pH值，所述混合氣體中空氣和CO₂的體積比優選的為(4～5):1。在本發明中，所述混合氣體的通入速度優選的為0.6～0.8vvm，更優選的為0.7vvm。本發明維持藻液中C：N比(10～15):1可以增加卵囊藻形成群體所需膠質多糖的合成量，同時增加卵囊藻8和卵囊藻16細胞在總卵囊藻細胞群體中的比例。本發明維持藻液的pH值在8.0～8.8之間，可以減少卵囊藻的靜電阻力，使卵囊藻更易絮凝。

在本發明中所述卵囊藻培養具體的培養時間根據取樣檢測結果確定。本發明在卵囊藻培養過程中，優選的對卵囊藻進行取樣檢測，先采用顯微鏡對卵囊藻細胞濃度計數，其次將卵囊藻藻液以2倍體積稀釋法進行稀釋為5組，先采用分光光度計于630nm處測得5組吸光度值，建立標準曲線回歸方程，確定藻液吸光度值和藻細胞濃度的關系。取培養藻液0.5mL，于630nm處測藻液的吸光度值，以標準曲線回歸方程計算藻細胞濃度，優選的藻液的細胞濃度達到2.5～3.5×10⁵個/ml時停止培養，更優選的為3.0×10⁵個/ml時停止培養。

在本發明中，所述卵囊藻培養的時間優選的為9～11天，本發明在卵囊藻細胞停止培養后，優選將得到的藻液自然沉降濃縮，得到濃縮卵囊藻；所述自然沉降濃縮的時間優選為2～4天，更優選的為3天。

本發明在所述自然沉降濃縮后，排出藻液中的上清液，收集藻泥，所述藻泥為細胞活性完好的濃縮卵囊藻。

本發明對所述濃縮卵囊藻的培養容器無特殊限定，優選的在本發明實施例中采用室內池塘或室內PVC桶。

下面結合實施例對本發明提供濃縮卵囊藻的培養方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護范圍的限定。

實施例1

室內大池濃縮卵囊藻的培養方法

對規格為1.5m×30m²室內池塘清潔消毒后，加入過濾海水至1.2m高，用有效氯為50％強氯精1.44kg對水進行消毒12h；再用720g硫代硫酸鈉中和，連續曝氣24小時，待水中余氯全部消失，加入NaNO₃2.8kg；K₂HPO₄280g；FeC₆H₅O₇(10％溶液)0.72L；維生素B₁7.2g；維生素B₁₂30mg；NaHCO₃36kg；細胞分裂素6-芐氨基嘌呤18g，生長素2.4-二氯苯氧乙酸40g和波吉卵囊藻藻種1000L(3×10⁸個/L)，采用室外光和熒光燈相結合的方式作為光源24h光照培養，控制光強為900lux，以0.7vvm的通氣速度通入空氣和純CO₂的混合氣體，懸浮微藻，控制水體中的pH值在8.0～8.8之間波動，23～27℃培養11d。取樣顯微鏡觀察藻液的細胞濃度達到3.0×10⁵個/ml時停止培養，藻液中卵囊藻8和卵囊藻16細胞群體占總卵囊藻細胞群體的比例62％，停至通氣2d，全部卵囊藻沉降于池底，最大沉降速度0.75m/d，排出上清液，收集藻泥。

實施例2

室內大池濃縮卵囊藻的培養方法

對規格為1.5m×44m²室內池塘清潔消毒后，加入過濾海水至1.2m高，用有效氯為50％強氯精2.1kg對水進行消毒12h；再用1.1kg硫代硫酸鈉中和，連續曝氣24小時，待水中余氯全部消失，加入NaNO₃4.1kg；K₂HPO₄410g；FeC₆H₅O₇(10％溶液)1.1L；維生素B₁10.1g；維生素B₁₂44mg；NaHCO₃52kg；細胞分裂素6-芐氨基嘌呤26g，生長素2.4-二氯苯氧乙酸58g和波吉卵囊藻藻種1400L(3×10⁸個/L)，采用室外光和熒光燈相結合的方式作為光源24h光照培養，控制光強為950lux，以0.8vvm的通氣速度通入空氣和純CO₂的混合氣體，懸浮微藻，控制水體中的pH值在8.0～8.8之間波動，28～24℃培養9d。取樣顯微鏡觀察藻液的細胞濃度達到3.2×10⁵個/ml時停止培養，藻液中卵囊藻8和卵囊藻16細胞群體占總卵囊藻細胞群體的比例60％，停至通氣2d，全部卵囊藻沉降于池底，最大沉降速度0.75m/d，排出上清液，收集藻泥。

實施例3

室內PVC桶培養卵囊藻濃縮方法

對規格為2m³的PVC桶清潔消毒后，加入過濾海水1.8m³，用有效氯為50％強氯精72g對水進行消毒12h；再用36g硫代硫酸鈉中和，不斷暴氣24小時，待水中余氯全部消失，加入NaNO₃144g；K₂HPO₄15g；FeC₆H₅O₇(1％溶液)0.36L；維生素B₁360mg；維生素B₁₂0.9mg；NaHCO₃1.8kg；細胞分裂素6-芐氨基嘌呤0.9g，生長素2.4-二氯苯氧乙酸2g和波吉卵囊藻藻種15L(4×10⁸個/L)，采用室外光和熒光燈相結合的方式作為光源24h光照培養，控制光強為950lux，以0.8vvm的通氣速度通入空氣和純CO₂的混合氣體，懸浮微藻，控制水體中的pH值在8.2～8.6之間波動，25～30℃培養10d。取樣顯微鏡觀察計藻液的細胞濃度達到2.9×10⁵個/ml時停止培養，藻液中卵囊藻8和卵囊藻16細胞群體占總卵囊藻細胞群體的比例56％，停至通氣35h，全部卵囊藻沉降于池底，最大沉降速度0.8m/d排出上清液，收集藻泥。

實施例4

室內PVC桶培養卵囊藻濃縮方法

對規格為2m³的PVC桶清潔消毒后，加入過濾海水1.8m³，用有效氯為50％強氯精72g對水進行消毒12h；再用36g硫代硫酸鈉中和，不斷暴氣24小時，待水中余氯全部消失，加入NaNO₃144g；K₂HPO₄15g；FeC₆H₅O₇(1％溶液)0.36L；維生素B₁360mg；維生素B₁₂0.9mg；NaHCO₃1.8kg；細胞分裂素6-芐氨基嘌呤0.9g，生長素2.4-二氯苯氧乙酸2g和波吉卵囊藻藻種15L(3.8×10⁸個/L)，采用室外光和熒光燈相結合的方式作為光源24h光照培養，控制光強為880lux，以0.6vvm的通氣速度通入空氣和純CO₂的混合氣體，懸浮微藻，控制水體中的pH值在8.4～8.5之間波動，28℃培養9d。取樣顯微鏡觀察藻液的細胞濃度達到3.5×10⁵個/ml時停止培養，藻液中卵囊藻8和卵囊藻16細胞群體占總卵囊藻細胞群體的比例48％，停至通氣32h，全部卵囊藻沉降于池底，最大沉降速度0.72m/d，排出上清液，收集藻泥。

由以上實施例可知，本發明提供的方法在確保卵囊藻細胞活性完好的條件下，增加卵囊藻細胞群體半徑和密度，卵囊藻的沉降速度從常規的0.45～0.48m/d增加到0.72～0.8m/d，增加1.5倍以上，縮短沉降時間，節約卵囊藻規?；B殖的成本。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。