本發明屬于多肽純化技術領域，具體地，本發明涉及一種六勝肽的純化方法。

背景技術：

六勝肽又稱六元勝肽，具有肉毒素的全部功能，且無毒性。六勝肽是一種含有六個氨基酸的活性多肽，氨基酸序列為Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2，它能抑制神經傳導，避免肌肉過度收縮，從而防止細紋形成。作為皮膚除皺成分，廣泛應用于各種高級美容化妝品中。瑞士傳奇集團護膚實驗室于2010年研發的MAGIC CARE魔法護理六勝肽平皺緊致原液是六勝肽美容產品的尖端代表。另外，國內外少有六勝肽分離純化方法的相關文獻，還沒有文獻具體研究六勝肽相關大規模的分離純化方法。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題在于克服現有六勝肽純化方法存在的缺點，提供一種成本低、純度高，適合產業化的六勝肽純化方法。

本發明提供的六勝肽的純化方法包括：

(1)溶解：將待純化的六勝肽粗品溶解在醋酸-醋酸鈉溶液中，過濾得到濾液；

(2)粗純：將步驟(1)得到的濾液上樣至強陽離子交換柱，用粗純流動相進行梯度洗脫，收集洗脫液；

(3)脫鹽：將步驟(2)收集的洗脫液上樣至反相聚合物柱，用脫鹽流動相進行梯度洗脫，收集六勝肽溶液，減壓濃縮與冷凍干燥得到六勝肽。

前述的純化方法，步驟(1)中，待純化的六勝肽粗品與醋酸-醋酸鈉溶液的比率是(0.5g-100g):(20ml-1000ml)，優選地，待純化的六勝肽粗品與醋酸-醋酸鈉溶液的比率是(0.5g-10g):(20ml-100ml)。

前述的純化方法，所述醋酸-醋酸鈉溶液是濃度為0.01-0.1mol/L、pH值為3.9-4.1的醋酸-醋酸鈉溶液。

前述的純化方法，所述粗純流動相由初始緩沖液流動相和洗脫緩沖液流動相組成，其中，所述初始緩沖液流動相是醋酸-醋酸鈉溶液，所述洗脫緩沖液流動相是加入氯化鈉的初始緩沖液流動相；優選地，所述初始緩沖液流動相是濃度為0.01-0.1mol/L、pH值為3.9-4.1的醋酸-醋酸鈉溶液，所述洗脫緩沖液流動相是加入0.5-1.5mol/L氯化鈉的初始緩沖液流動相。

前述的純化方法，所述脫鹽流動相由流動相A和流動相B組成，其中，所述流動相A是超純水，所述流動相B是色譜純甲醇。

前述的純化方法，步驟(2)中，所述粗純流動相梯度是初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相由100:0到(80-60):(20-40)。

前述的純化方法，步驟(3)中，所述脫鹽流動相梯度是流動相A:流動相B由(100-95):(0-5)到(90-80):(10-20)。

前述的純化方法，所述粗純流動相由初始緩沖液流動相和洗脫緩沖液流動相組成，其中，所述初始緩沖液流動相是醋酸-醋酸鈉溶液，所述洗脫緩沖液流動相是高濃度、高pH值的醋酸-醋酸鈉緩沖液；優選地，所述初始緩沖液流動相是濃度為0.01-0.1mol/L、pH值為3.9-4.1的醋酸-醋酸鈉溶液，所述洗脫緩沖液流動相由A相和B相組成，A相是濃度為0.01-0.1mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，B相是濃度為0.5-1.5mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液。

前述的純化方法，所述脫鹽流動相由流動相A和流動相B組成，其中，所述流動相A是超純水，所述流動相B是色譜純甲醇。

前述的純化方法，步驟(2)中，所述粗純流動相梯度是初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相由100:0到(80-60):(20-40)。

前述的純化方法，步驟(3)中，所述脫鹽流動相梯度是流動相A:流動相B由(100-95):(0-5)到(90-80):(5-10)。

采用本發明的技術方案，至少具有如下有益效果：

1.本發明方法將強陽離子交換柱與反相聚合物柱結合使用，先使用強陽離子交換柱對六勝肽進行粗純，除去了大部分雜質，再使用反相聚合物柱進行脫鹽，得到進一步純化的六勝肽，極大地提高了純化效率。

2.本發明方法節省了整個純化過程中流動相的成本，且純化工藝較為環保。

3.本發明方法兩種柱子交替使用，有效地彌補了單一柱子難以完全分離粗肽中不同結構、不同化學性質的雜質，得到的六勝肽純度高(大于95％)，且收率高。

附圖說明

圖1是根據本發明第一種具體實施方式的方法純化得到的六勝肽的質譜圖。

圖2是根據本發明第一種具體實施方式的方法純化得到的六勝肽的高效液相色譜圖。

圖3是根據本發明第二種具體實施方式的方法純化得到的六勝肽的質譜圖。

圖4是根據本發明第二種具體實施方式的方法純化得到的六勝肽的高效液相色譜圖。

具體實施方式

為充分了解本發明之目的、特征及功效，借由下述具體的實施方式，對本發明做詳細說明，但本發明并不僅僅限于此。

目前，就六勝肽純化方法而言，普通存在成本高昂但效果不理想的問題，針對該問題，本發明提供了一種利用離子交換高效液相色譜分離純化六勝肽的方法，該方法依次包括如下步驟：

(1)溶解：將待純化的六勝肽粗品溶解在醋酸-醋酸鈉溶液中，過濾得到濾液；

(2)粗純：將步驟(1)得到的濾液上樣至強陽離子交換柱，用粗純流動相進行梯度洗脫，收集洗脫液；

(3)脫鹽：將步驟(2)收集的洗脫液上樣至反相聚合物柱，用脫鹽流動相進行梯度洗脫，收集六勝肽溶液，減壓濃縮與冷凍干燥得到六勝肽。

在步驟(1)中，待純化的六勝肽粗品是采用固相合成法制得，在將待純化的六勝肽粗品溶解于醋酸-醋酸鈉溶液時，優選地，按照待純化的六勝肽粗品與醋酸-醋酸鈉溶液的比率是(0.5g-100g):(20ml-1000ml)進行溶解，更優選地，按照待純化的六勝肽粗品與醋酸-醋酸鈉溶液的比率是(0.5g-10g):(20ml-100ml)進行溶解。將待純化的六勝肽粗品溶解于醋酸-醋酸鈉溶液后，優選采用1mol/L氫氧化鈉調節pH值至3.9-4.1，進行超聲處理，隨后用濾膜(例如0.45μm的濾膜)過濾，并收集濾液別用。

在步驟(2)中，色譜柱采用強陽離子交換柱，所謂強陽離子交換柱是指在高純度的惰性硅膠表面鍵合一種新型的聚合磺酸基陽離子交換配位體，這種獨特的鍵合結構是一種穩定的聚合包膜結構，比普通的聚合物離子交換柱柱效更高，且具有更好的機械強度和重現性。在本發明中，采用的強陽離子交換柱是填料為瓊脂糖微球的強陽離子交換柱，其中瓊脂糖微球可以是SP高流速瓊脂糖微球(SP Bio-sepFF)，其粒徑為50-160μm，可通過常規市購獲得，例如西安交大保賽生物技術股份有限公司生產的SP高流速瓊脂糖微球就可用于本發明中。

在步驟(3)中，色譜柱采用反相聚合物柱，所謂反相聚合物柱是指固定相的極性比流動性的極性弱的一類聚合物柱。在本發明中，采用的反相聚合物柱是填料為苯乙烯二乙烯苯型填料的反相聚合物柱，例如填料為SBC MCI GEI F型反相色譜填料、粒徑為30-50μm，可通過常規市購獲得，例如成都科譜生物有限公司生產的SBC MCI GEI F型反相色譜填料可用于本發明中。

步驟(2)中使用的粗純流動相由初始緩沖液流動相和洗脫緩沖液流動相組成，步驟(3)中使用的脫鹽流動相由流動相A和流動相B組成。

在本發明的第一種具體實施方式中，步驟(2)中使用的初始緩沖液流動相是醋酸-醋酸鈉溶液，洗脫緩沖液流動相是加入氯化鈉的初始緩沖液流動相；優選地，初始緩沖液流動相是濃度為0.01-0.1mol/L、pH值為3.9-4.1的醋酸-醋酸鈉溶液，洗脫緩沖液流動相是加入0.5-1.5mol/L氯化鈉的初始緩沖液流動相。步驟(3)中使用的流動相A是超純水，流動相B是色譜純甲醇。

在步驟(2)中，將步驟(1)收集的濾液上樣至強陽離子交換柱之前，先將強陽離子交換柱用初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH值為3.9-4.1，電導率恒定不變。將濾液上樣至強陽離子交換柱之后，按照初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相由100:0到(80-60):(20-40)的梯度進行梯度洗脫。例如，可以將洗脫過程分為不同的階段，例如，0-60分鐘為第一階段、60-90分鐘為第二階段、90-150分鐘為第三階段，或者0-80分鐘為第一階段、80-120分鐘為第二階段、120-240分鐘為第三階段，或者0-110分鐘為第一階段、110-170分鐘為第二階段、170-340分鐘為第三階段，或者0-120分鐘為第一階段、120-180分鐘為第二階段、180-340分鐘為第三階段，洗脫過程的梯度可以是第一階段中初始緩沖液流動相100％，第二階段中初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相由(100-70)：(0-30)到(70-65)：(30-35)，第三階段初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相是(70-65)：(30-35)恒流。梯度洗脫，收集洗脫液。

在步驟(3)中，將步驟(2)收集的洗脫液上樣至反相聚合物柱之前，先將反相聚合物柱用流動相A進行平衡。將洗脫液上樣至反相聚合物柱之后，按照流動相A:流動相B由(100-95):(0-5)到(90-80):(10-20)的梯度進行梯度洗脫。例如，可以將洗脫過程分為不同的階段，例如，0-45分鐘為第一階段、45-100分鐘為第二階段，或者0-50分鐘為第一階段、50-100分鐘為第二階段，或者0-80分鐘為第一階段、80-160分鐘為第二階段，或者0-100分鐘為第一階段、100-200分鐘為第二階段，洗脫過程的梯度可以是第一階段流動相A：流動相B由(100-95):(0-5)到(90-80):(10-20)，第二階段流動相A:流動相B是(90-80):(10-20)恒流。梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度95％以上六勝肽合格品固體粉末，其質譜圖如圖1所示，高效液相色譜圖如圖2所示。

在本發明的第二種具體實施方式中，步驟(2)中使用的初始緩沖液流動相是醋酸-醋酸鈉溶液，所述洗脫緩沖液流動相是高濃度、高pH值的醋酸-醋酸鈉緩沖液；優選地，所述初始緩沖液流動相是濃度為0.01-0.1mol/L、pH值為3.9-4.1的醋酸-醋酸鈉溶液，所述洗脫緩沖液流動相由A相和B相組成，A相是濃度為0.01-0.1mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，B相是濃度為0.5-1.5mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液。步驟(3)中使用的流動相A是超純水，流動相B是色譜純甲醇。

在步驟(2)中，將步驟(1)收集的濾液上樣至強陽離子交換柱之前，先將強陽離子交換柱用初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH值為3.9-4.1，電導率恒定不變。將濾液上樣至強陽離子交換柱之后，按照初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相由100:0到(80-60):(20-40)的梯度進行梯度洗脫。例如，可以將洗脫過程分為不同的階段，例如，0-60分鐘為第一階段、60-90分鐘為第二階段、90-150分鐘為第三階段，或者0-80分鐘為第一階段、80-120分鐘為第二階段、120-240分鐘為第三階段，或者0-110分鐘為第一階段、110-170分鐘為第二階段、170-340分鐘為第三階段，或者0-120分鐘為第一階段、120-180分鐘為第二階段、180-340分鐘為第三階段，洗脫過程的梯度可以是第一階段中初始緩沖液流動相100％，第二階段中初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相由(100-70)：(0-30)到(70-65)：(30-35)，第三階段初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相是(70-65)：(30-35)恒流。梯度洗脫，收集洗脫液。

在步驟(3)中，將步驟(2)收集的洗脫液上樣至反相聚合物柱之前，先將反相聚合物柱用流動相A進行平衡。將洗脫液上樣至反相聚合物柱之后，按照流動相A:流動相B由(100-95):(0-5)到(90-80):(10-20)的梯度進行梯度洗脫。例如，可以將洗脫過程分為不同的階段，例如，0-45分鐘為第一階段、45-100分鐘為第二階段，或者0-50分鐘為第一階段、50-100分鐘為第二階段，或者0-80分鐘為第一階段、80-160分鐘為第二階段，或者0-100分鐘為第一階段、100-200分鐘為第二階段，洗脫過程的梯度可以是第一階段流動相A:流動相B由(100-98):(0-2)到(95-90):(5-10)，第二階段流動相A:流動相B是(95-90):(5-10)恒流。梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度95％以上六勝肽合格品固體粉末，其質譜圖如圖3所示，高效液相色譜圖如圖4所示。

下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明并不限于這些實施例。除非另有說明，實施例中使用的原料和儀器均是商購獲得的，是本領域常規使用的儀器和原料，只要其能滿足實驗需要即可。

實施例1

1.溶樣

稱取0.5g固相合成所得六勝肽，用20ml、pH＝4、0.01mol/L醋酸-醋酸鈉水溶液溶解(濃度約為25mg/mL)，用1mol/L氫氧化鈉調pH＝3.9-4.1，超聲處理，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液備用。

2.粗純

純化條件：色譜柱：填料為SP高流速瓊脂糖微球Bio-sepFF，粒徑50-160μm的強陽離子交換柱，柱子填裝體積為50mL。初始緩沖液流動相為：0.01mol/L pH＝3.9-4.1醋酸-醋酸鈉水溶液，洗脫緩沖液流動相為加入1mol/L氯化鈉的初始緩沖液流動相。流速5mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到60分鐘初始緩沖液流動相100％，60到90分鐘初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相由100:0到70:30，90到150分鐘為初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相為70:30恒流。

純化過程：將陽離子交換柱用100％初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH＝3.9-4.1，電導率恒定不變上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液待用。

3.脫鹽

純化條件：色譜柱：填料為SBC MCI GEI F型30-50μm反相色譜填料F型30-50μm，柱子填裝體積為50mL。流動相A為：超純水，流動相B為：色譜純甲醇。流速7mL/min。檢測波長:215nm。梯度：0到50分鐘流動相A:流動相B由100:0到90:10，50到100分鐘為流動相A:流動相B為90:10恒流。

純化過程：將聚合物柱用100％流動相A超純水平衡好后上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度97.4％鹽酸型六勝肽合格品固體粉末。

實施例2

1.溶樣

稱取1.0g固相合成所得六勝肽，用50ml、pH＝4、0.01mol/L醋酸/醋酸鈉水溶液溶解(濃度約為20mg/mL)，用1mol/L氫氧化鈉調pH＝3.9-4.1，超聲處理，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液備用。

2.粗純

純化條件：色譜柱：填料為SP高流速瓊脂糖微球Bio-sepFF，粒徑50-160μm的強陽離子交換柱，柱子填裝體積為150mL。初始緩沖液流動相為：0.01mol/L pH＝3.9-4.1醋酸-醋酸鈉水溶液，洗脫緩沖液流動相為加入1mol/L氯化鈉的初始緩沖液流動相。流速10mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到80分鐘初始緩沖液流動相100％，80到120分鐘初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相由100:0到70:30，120到240分鐘為初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相為70:30恒流。

純化過程：將陽離子交換柱用100％初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH＝3.9-4.1，電導率恒定不變上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液待用。

3.脫鹽

純化條件：色譜柱：填料為SBC MCI GEI F型30-50μm反相色譜填料F型30-50μm，柱子填裝體積為150mL。流動相A為：超純水，流動相B為：色譜純甲醇。流速20mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到80分鐘流動相A:流動相B由100:0到90:10，80到160分鐘為流動相A:流動相B為90:10恒流。

純化過程：將聚合物柱用100％流動相A超純水平衡好后上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度97％鹽酸型六勝肽合格品固體粉末。

實施例3

1.溶樣

稱取30.0g固相合成所得六勝肽，用300ml、pH＝4、0.01mol/L醋酸-醋酸鈉水溶液溶解(濃度約為100mg/mL)，用1mol/L氫氧化鈉調pH＝3.9-4.1，超聲處理，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液備用。

2.粗純

純化條件：色譜柱：填料為SP高流速瓊脂糖微球Bio-sepFF，粒徑50-160μm的強陽離子交換柱，柱子填裝體積為2500mL。初始緩沖液流動相為：0.01M pH＝3.9-4.1醋酸-醋酸鈉水溶液，洗脫緩沖液流動相為加入1mol/L氯化鈉的初始緩沖液流動相。流速25mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到110分鐘初始緩沖液流動相100％，110到170分鐘初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相由75:25到70:30，170到340分鐘為初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相為70:30恒流。

純化過程：將陽離子交換柱用100％初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH＝3.9-4.1，電導率恒定不變上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液待用。

3.脫鹽

純化條件：色譜柱：填料為SBC MCI GEI F型30-50μm反相色譜填料F型30-50μm，柱子填裝體積為300mL。流動相A為：超純水，流動相B為：色譜純甲醇。流速30mL/min。檢測波長:215nm。梯度：0到45分鐘流動相A：流動相B由100:0到90:10，45到100分鐘為流動相A：流動相B為90:10恒流。

純化過程：將聚合物柱用100％流動相A超純水平衡好后上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度96.2％鹽酸型六勝肽合格品固體粉末。

實施例4

1.溶樣

稱取60.0g固相合成所得六勝肽，用600ml、pH＝4、0.01mol/L醋酸-醋酸鈉水溶液溶解(濃度約為100mg/mL)，用1mol/L氫氧化鈉調pH＝3.9-4.1，超聲處理，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液備用。

2.粗純

純化條件：色譜柱：填料為SP高流速瓊脂糖微球Bio-sepFF，粒徑50-160μm的強陽離子交換柱，柱子填裝體積為2500mL。初始緩沖液流動相為：0.01mol/L pH＝3.9-4.1醋酸-醋酸鈉水溶液，洗脫緩沖液流動相為加入1mol/L氯化鈉的初始緩沖液流動相。流速25mL/min。檢測波長:215nm。梯度：0到110分鐘初始緩沖液流動相100％，110到170分鐘初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相由70:30到65:35，170到340分鐘為初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相為65:35恒流。

純化過程：將陽離子交換柱用100％初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH＝3.9-4.1，電導率恒定不變上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液待用。

3.脫鹽

純化條件：色譜柱：填料為SBC MCI GEI F型30-50μm反相色譜填料F型30-50μm，柱子填裝體積為3000mL。流動相A為：超純水，流動相B為：色譜純甲醇。流速50mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到100分鐘流動相A：流動相B由100:0到90:15，100到200分鐘為流動相A:流動相B為90:15恒流。

純化過程：將聚合物柱用100％流動相A超純水平衡好后上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度96％鹽酸型六勝肽合格品固體粉末。

實施例5

1.溶樣

稱取100.0g固相合成所得六勝肽，用1000ml、pH＝4、0.01mol/L醋酸-醋酸鈉水溶液溶解(濃度約為100mg/mL)，用1mol/L氫氧化鈉調pH＝3.9-4.1，超聲處理，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液備用。

2.粗純

純化條件：色譜柱：填料為SP高流速瓊脂糖微球Bio-sepFF，粒徑50-160μm的強陽離子交換柱，柱子填裝體積為2500mL。初始緩沖液流動相為：0.01mol/L pH＝3.9-4.1醋酸-醋酸鈉水溶液，洗脫緩沖液流動相為加入1mol/L氯化鈉的初始緩沖液流動相。流速25mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到120分鐘初始緩沖液流動相100％，120到180分鐘初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相由70:30到65:35，180到340分鐘為初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相為65:35恒流。

純化過程：將陽離子交換柱用100％初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH＝3.9-4.1，電導率恒定不變上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液待用。

3.脫鹽

純化條件：色譜柱：填料為SBC MCI GEI F型30-50μm反相色譜填料F型30-50μm，柱子填裝體積為3000mL。流動相A為：超純水，流動相B為：色譜純甲醇。流速50mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到100分鐘流動相A：流動相B由100:0到90:15，100到200分鐘為流動相A：流動相B為90:15恒流。

純化過程:將聚合物柱用100％流動相A超純水平衡好后上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度96％鹽酸型六勝肽合格品固體粉末。

實施例6

1.溶樣

稱取0.5g固相合成所得六勝肽，用20ml、pH＝4、0.01mol/L醋酸-醋酸鈉水溶液溶解(濃度約為25mg/mL)，用1mol/L氫氧化鈉調pH＝3.9-4.1，超聲處理，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液備用。

2.粗純

純化條件：色譜柱：填料為SP高流速瓊脂糖微球Bio-sepFF，粒徑50-160μm的強陽離子交換柱，柱子填裝體積為50mL。初始緩沖液流動相為：0.01mol/L pH＝3.9-4.1醋酸-醋酸鈉水溶液，洗脫緩沖液流動相為A相：濃度為0.01mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，B相：濃度為1mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，流速5mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到60分鐘初始緩沖液流動相100％，60到90分鐘初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相由100:0到70:30，90到150分鐘為初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相為70:30恒流。

純化過程：將陽離子交換柱用100％初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH＝3.9-4.1，電導率恒定不變上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液待用。

3.脫鹽

純化條件：色譜柱：填料為SBC MCI GEI F型30-50μm反相色譜填料F型30-50μm，柱子填裝體積為50mL。流動相A為：超純水，流動相B為：色譜純甲醇。流速7mL/min。檢測波長:215nm。梯度：0到50分鐘流動相A:流動相B由100:0到90:10，50到100分鐘為流動相A:流動相B為90:10恒流。

純化過程：將聚合物柱用100％流動相A超純水平衡好后上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度97％醋酸型六勝肽合格品固體粉末。

實施例7

1.溶樣

稱取1.0g固相合成所得六勝肽，用50ml、pH＝4、0.01mol/L醋酸/醋酸鈉水溶液溶解(濃度約為20mg/mL)，用1mol/L氫氧化鈉調pH＝3.9-4.1，超聲處理，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液備用。

2.粗純

純化條件：色譜柱：填料為SP高流速瓊脂糖微球Bio-sepFF，粒徑50-160μm的強陽離子交換柱，柱子填裝體積為150mL。初始緩沖液流動相為：0.01mol/L pH＝3.9-4.1醋酸-醋酸鈉水溶液，洗脫流動相是A相：濃度為0.01mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，B相：濃度為1.0mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，流速10mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到80分鐘初始緩沖液流動相100％，80到120分鐘初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相由100:0到70:30，120到240分鐘為初始緩沖液流動相:洗脫緩沖液流動相為70:30恒流。

純化過程：將陽離子交換柱用100％初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH＝3.9-4.1，電導率恒定不變上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液待用。

3.脫鹽

純化條件：色譜柱：填料為SBC MCI GEI F型30-50μm反相色譜填料F型30-50μm，柱子填裝體積為150mL。流動相A為：超純水，流動相B為：色譜純甲醇。流速20mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到80分鐘流動相A:流動相B由100:0到90:10，80到160分鐘為流動相A:流動相B為90:10恒流。

純化過程：將聚合物柱用100％流動相A超純水平衡好后上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度96.5％醋酸型六勝肽合格品固體粉末。

實施例8

1.溶樣

稱取30.0g固相合成所得六勝肽，用300ml、pH＝4、0.01mol/L醋酸-醋酸鈉水溶液溶解(濃度約為100mg/mL)，用1mol/L氫氧化鈉調pH＝3.9-4.1，超聲處理，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液備用。

2.粗純

純化條件：色譜柱：填料為SP高流速瓊脂糖微球Bio-sepFF，粒徑50-160μm的強陽離子交換柱，柱子填裝體積為2500mL。初始緩沖液流動相為：0.01M pH＝3.9-4.1醋酸-醋酸鈉水溶液，洗脫流動相是A相：濃度為0.01mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，B相：濃度為1.0mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，流速25mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到110分鐘初始緩沖液流動相100％，110到170分鐘初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相由75:25到70:30,170到340分鐘為初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相為70:30恒流。

純化過程：將陽離子交換柱用100％初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH＝3.9-4.1，電導率恒定不變上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液待用。

3.脫鹽

純化條件：色譜柱：填料為SBC MCI GEI F型30-50μm反相色譜填料F型30-50μm，柱子填裝體積為300mL。流動相A為：超純水，流動相B為：色譜純甲醇。流速30mL/min。檢測波長:215nm。梯度：0到45分鐘流動相A：流動相B由100:0到90:10，45到100分鐘為流動相A：流動相B為90:10恒流。

純化過程：將聚合物柱用100％流動相A超純水平衡好后上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度96.3％醋酸型六勝肽合格品固體粉末。

實施例9

1.溶樣

稱取60.0g固相合成所得六勝肽，用600ml、pH＝4、0.01mol/L醋酸-醋酸鈉水溶液溶解(濃度約為100mg/mL)，用1mol/L氫氧化鈉調pH＝3.9-4.1，超聲處理，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液備用。

2.粗純

純化條件：色譜柱：填料為SP高流速瓊脂糖微球Bio-sepFF，粒徑50-160μm的強陽離子交換柱，柱子填裝體積為2500mL。初始緩沖液流動相為：0.01mol/L pH＝3.9-4.1醋酸-醋酸鈉水溶液，洗脫流動相是A相：濃度為0.01mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，B相：濃度為1.0mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，流速25mL/min。檢測波長:215nm。梯度：0到110分鐘初始緩沖液流動相100％，110到170分鐘初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相由70:30到65:35，170到340分鐘為初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相為65:35恒流。

純化過程：將陽離子交換柱用100％初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH＝3.9-4.1，電導率恒定不變上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液待用。

3.脫鹽

純化條件：色譜柱：填料為SBC MCI GEI F型30-50μm反相色譜填料F型30-50μm，柱子填裝體積為3000mL。流動相A為：超純水，流動相B為：色譜純甲醇。流速50mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到100分鐘流動相A：流動相B由100:0到90:15，100到200分鐘為流動相A:流動相B為90:15恒流。

純化過程：將聚合物柱用100％流動相A超純水平衡好后上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度96％醋酸型六勝肽合格品固體粉末。

實施例10

1.溶樣：稱取100.0g固相合成所得六勝肽，用1000ml、pH＝4、0.01mol/L醋酸-醋酸鈉水溶液溶解(濃度約為100mg/mL)，用1mol/L氫氧化鈉調pH＝3.9-4.1，超聲處理，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液備用。

2.粗純

純化條件：色譜柱：填料為SP高流速瓊脂糖微球Bio-sepFF，粒徑50-160μm的強陽離子交換柱，柱子填裝體積為2500mL。初始緩沖液流動相為：0.01mol/L pH＝3.9-4.1醋酸-醋酸鈉水溶液，洗脫流動相是A相：濃度為0.1mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，B相：濃度為1.0mol/L、pH值為5.5-6.2的醋酸-醋酸鈉溶液，流速25mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到120分鐘初始緩沖液流動相100％，120到180分鐘初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相由70:30到65:35，180到340分鐘為初始緩沖液流動相：洗脫緩沖液流動相為65:35恒流。

純化過程：將陽離子交換柱用100％初始緩沖液流動相平衡至檢測器流出液pH＝3.9-4.1，電導率恒定不變上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液待用。

3.脫鹽

純化條件：色譜柱：填料為SBC MCI GEI F型30-50μm反相色譜填料F型30-50μm，柱子填裝體積為3000mL。流動相A為：超純水，流動相B為：色譜純甲醇。流速50mL/min。檢測波長：215nm。梯度：0到100分鐘流動相A：流動相B由100:0到90:15，100到200分鐘為流動相A：流動相B為90:15恒流。

純化過程:將聚合物柱用100％流動相A超純水平衡好后上樣。線性梯度洗脫，收集目的峰值的肽溶液，將脫鹽后的目的肽溶液在低于40℃減壓濃縮，濃縮至約50mg-100mg/mL后凍干，即得到純度95.8％醋酸型六勝肽合格品固體粉末。

本發明在上文中已以優選實施例公開，但是本領域的技術人員應理解的是，這些實施例僅用于描繪本發明，而不應理解為限制本發明的范圍。應注意的是，凡是與這些實施例等效的變化與置換，均應設為涵蓋于本發明的權利要求范圍內。因此，本發明的保護范圍應當以權利要求書中所界定的范圍為準。