本發(fā)明涉及羥基類固醇脫氫酶，具體涉及一種新的7α-羥基類固醇脫氫酶基因S1-a-1。

背景技術(shù)：

羰基的不對稱還原一直是化學(xué)反應(yīng)研究的熱點之一。雖然目前化學(xué)方法已經(jīng)取得了一定的成果，但是化學(xué)方法往往存在催化劑種類和數(shù)目有限、立體選擇性不高、輔助試劑昂貴且不易回收等缺點。而酶促反應(yīng)不僅具有高效性、化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性，還具有高度的立體選擇性。羥基類固醇脫氫酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介導(dǎo)的酶促反應(yīng)具有相對嚴格的立體選擇性和“不”嚴格的底物特異性。例如，早在二十世紀八十年代初科學(xué)家就已經(jīng)開始嘗試利用微生物產(chǎn)生的7α-、7β-HSDH聯(lián)合差向異構(gòu)轉(zhuǎn)化鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)合成熊去氧膽酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)。而游離酶還可以催化結(jié)合態(tài)膽汁酸——牛磺鵝去氧膽酸(Taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)轉(zhuǎn)化為牛磺熊去氧膽酸(Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)。

HSDH的底物不僅僅局限在甾體類化合物，文獻報道HSDH還可以催化烷基取代單環(huán)酮類、二環(huán)酮類等物質(zhì)的羰基不對稱還原。HSDH所具有的優(yōu)秀催化品質(zhì)決定了其在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域具有較大應(yīng)用潛力。近年來，科研人員逐漸認識到了7α-、7β-HSDH在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域所具有的巨大應(yīng)用潛力。目前，GenBank中登記的功能已經(jīng)確認的7α-HSDH共有5個，它們分別來自于Bacteroides fragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridium absonum和Escherichia coli；來自Clostridium absonum和Collinsella aerofaciens的7β-HSDH基因也已經(jīng)成功被克隆。

酶的活性和熱穩(wěn)定性是決定能否投入工業(yè)生產(chǎn)的重要參數(shù)，現(xiàn)有的羥基類固醇脫氫酶的活性和穩(wěn)定性還不能同時滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，因此，需要進一步尋找和開發(fā)新的適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的羥基類固醇脫氫酶。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種新的7α-羥基類固醇脫氫酶基因，該基因編碼的7α-羥基類固醇脫氫酶對CDCA的催化活性約為撒丁島梭菌7α-HSDH的5倍，對TCDCA的催化活性約為撒丁島梭菌7α-HSDH的2.5倍多，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價值。

本發(fā)明請求保護的技術(shù)方案如下：

一種7α-羥基類固醇脫氫酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

編碼所述7α-羥基類固醇脫氫酶的基因。

所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一種表達盒，其特征在于，包含任一所述基因。

一種載體，其特征在于，包含任一所述基因或所述表達盒。

一種重組細胞，其特征在于，包含任一所述基因或所述表達盒或所述載體。

制備所述7α-羥基類固醇脫氫酶的方法，其特征在于，在能夠成功誘導(dǎo)蛋白表達的條件下培養(yǎng)所述重組細胞并分離得到7α-羥基類固醇脫氫酶。

一種催化劑，其特征在于，其有效成分包含所述7α-羥基類固醇脫氫酶。

所述催化劑，還包括與所述7α-羥基類固醇脫氫酶同時使用時能夠提高酶催化效率或增加酶穩(wěn)定性的其它試劑。

一種實現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)的羰基不對稱還原的方法，其特征在于，使用所述7α-羥基類固醇脫氫酶或所述催化劑與反應(yīng)底物在15-37℃、pH 6.0-11.0條件下進行催化反應(yīng)。

本發(fā)明利用宏基因組測序技術(shù)從四川黑熊保護及孵育基地的一頭健康黑熊的糞便樣品中分離出一種新的7α-羥基類固醇脫氫酶基因，命名為7α-HSDHS1-a-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。該基因編碼一種新的7α-羥基類固醇脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，能夠催化鵝去氧膽酸(CDCA)、牛磺鵝去氧膽酸(TCDCA)的7位羥基的差向異構(gòu)，使其生成熊去氧膽酸(UDCA)、牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)的中間體7-酮石膽酸(7K-LCA)、牛磺7-酮石膽酸(T7K-LCA)。本發(fā)明的7α-HSDHS1-a-1酶蛋白，與撒丁島梭菌Clostridium absonum中的7α-羥基類固醇脫氫酶相比，具有更好的比活活性，對CDCA的催化活性約為撒丁島梭菌7α-HSDH的5倍，對TCDCA的催化活性約為撒丁島梭菌7α-HSDH的2.5倍多，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價值。

本發(fā)明提供的載體，可以是克隆載體，包含7α-HSDHS1-a-1基因和質(zhì)粒復(fù)制所需的其它元件；也可以是表達載體，包含7α-HSDHS1-a-1基因以及能夠使蛋白成功表達的其它元件。

本發(fā)明提供的重組細胞，可以是包含克隆載體的重組細胞，例如E.coli DH5α；也可以是包含表達載體的細胞，在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)細胞，例如，加入適量的IPTG，16℃誘導(dǎo)7α-HSDHS1-a-1酶蛋白的表達。

本發(fā)明提供的催化劑，其有效成分包括本發(fā)明的7α-HSDHS1-a-1酶蛋白。所述催化劑也可以與其它合適的催化劑同時使用，從而提高酶催化效率或者在同一反應(yīng)體系中先后進行兩種催化反應(yīng)。

本發(fā)明的7α-HSDHS1-a-1酶蛋白，在15-37℃、pH 6.0-11.0的反應(yīng)條件下能夠催化TCDCAC₇α-羥基的羰基不對稱還原反應(yīng)。

附圖說明

圖1.本發(fā)明分離的7α-HSDH基因與撒丁島梭菌7α-HSDH基因的序列比對結(jié)果；

其中，1為現(xiàn)有的撒丁島梭菌7α-HSDH基因的核苷酸序列，2為本發(fā)明分離的7α-HSDH基因的核苷酸序列。

圖2.本發(fā)明分離的7α-HSDHS1-a-1基因的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3.本發(fā)明7α-HSDHS1-a-1酶蛋白的SDS-PAGE電泳圖。

圖4.撒丁島梭菌7α-HSDH酶蛋白的SDS-PAGE電泳圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進一步描述本發(fā)明，需要聲明的是，下述實施例僅作為解釋和說明，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

生物材料：

E.coli DH5α，E.coli BL21細胞為本實驗室保存，可商購獲得。

實驗試劑：

糞便DNA基因組提取試劑盒，購買自德國Qiagen公司，貨號：51604；

瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購買自O(shè)mega，貨號：D2500-01；

PCR一步定向克隆試劑盒，購買自左岸蛋白科技有限公司，貨號：NR001；

載體pGEX-6p-1，購于上海生工公司；

質(zhì)粒提取試劑盒OMEGA Plasmid Mini Kit I，購買自O(shè)MEGA公司，貨號：D6943；

Lysis buffer(裂解緩沖液)，配制而得，10mM pH7.3的PBS含有PMSF 0.1mM、亮肽素Leupeptin 0.5mg/mL；

Glutathione Sepharose 4B，購買自GE Healthcare，貨號：10223836；

PreScission Protease，購買自GenScript公司，貨號：Z02799-100；

BCA試劑盒，購買自Beyotime公司，貨號：P0006；

TCDCA，購買自百靈威科技公司，貨號：330776。

DNA提取所使用的黑熊糞便樣品，本實驗室有凍存。

以下實施例中未特別說明的生物化學(xué)試劑，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法配制而得或商購獲得，規(guī)格為實驗室純級即可。

實施例1.新7α-HSDH基因的分離

1.基因的發(fā)現(xiàn)

使用滅菌處理的藥匙，采取了四川黑熊保護及孵育基地的一頭健康黑熊的糞便樣品，并用干冰保存運回實驗室。使用Qiagen糞便DNA基因組提取試劑盒，按照試劑盒說明書提取了該頭黑熊糞便的總DNA，交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行宏基因組測序。然后用現(xiàn)有的撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶(7α-HSDH)編碼基因序列(Genebank號No.AET80685)與宏基因組測序數(shù)據(jù)進行對比，發(fā)現(xiàn)了一種新的7α-HSDH基因，命名為7α-HSDHS1-a-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。序列比對結(jié)果表明，這種新的7α-HSDH基因與現(xiàn)有的撒丁島梭菌7α-HSDH基因序列的一致性為72.34％(圖1)。

2.基因的分離

(1)引物設(shè)計：對測序獲得的7α-HSDHS1-a-1基因序列設(shè)計并合成引物，得到的引物核苷酸序列如下：

S1-a-1-f：ATGAAAAAGTTAGAAGATAAAGTAG；

S1-a-1-r：CTATCTACTTCTCTCCATCATTG。

(2)PCR擴增：以黑熊糞便的總DNA為模板，采用步驟(1)獲得的引物，按照下列PCR體系和程序進行擴增。

PCR體系：

5xFastPfu緩沖液……………………2μL

2.5mM dNTPs………………………2μL

S1-a-1-f(5μM)………………………2μL

S1-a-1-r(5μM)………………………2μL

模板DNA………………………20ng

FastPfu聚合酶…………………1μL

補ddH₂O至…………………………20μL

PCR程序：

a.94℃預(yù)變性3min，5個循環(huán)；

b.94℃變性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，27個循環(huán)；

c.72℃延伸10min。

(3)瓊脂糖凝膠電泳：使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，出現(xiàn)大小約為800bp的條帶。

(4)切膠回收：在紫外燈下切取目的條帶，使用Omega瓊脂糖凝膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書中的操作步驟回收目的基因片段。

實施例2.7α-HSDHS1-a-1基因的表達

1.載體構(gòu)建

使用從左岸蛋白科技有限公司購買的PCR一步定向克隆試劑盒，按照試劑盒說明書中的操作步驟，將7α-HSDHS1-a-1基因的全長序列連接至載體pGEX-6p-1上。

2.轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞

1)感受態(tài)細胞E.coli DH5α放置冰上融化。

2)將步驟1所得的連接體系加入融化的E.coli DH5α感受態(tài)中，冰上30min。

3)42℃熱處理90s。

4)冰上靜置2min。

5)加入LB培養(yǎng)基600μL，搖床溫度37℃，搖床搖速150rpm，時間45min。

6)吸取200μL菌液，涂布于氨芐青霉素(Amp⁺)抗性LB平板培養(yǎng)基上。

7)37℃過夜培養(yǎng)。

3.陽性克隆鑒定

(1)挑選白色單菌落，接種于LB/Amp⁺的液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃培養(yǎng)8小時，8000rpm離心5min獲取菌體。

(2)使用OMEGA Plasmid Mini Kit I質(zhì)粒提取試劑盒，按照說明書中的操作步驟提取質(zhì)粒。

(3)使用克隆引物S1-a-1-f和S1-a-1-r，按照實施例1中的PCR體系和程序進行PCR驗證，確定基因片段成功插入pGEX-6p-1載體中。

(4)將鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生工公司測序，將測序結(jié)果比對正確的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/7α-HSDHS1-a-1作為表達載體。

4.7α-HSDHS1-a-1基因的表達

(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21細胞

a.-80℃中取出E.coliBL21感受態(tài)細胞冰上放置。

b.加入2μL表達載體pGEX-6p-1/7α-HSDHS1-a-1，冰上放置30min。

c.42℃熱處理90s。

d.冰上放置2min。

e.復(fù)蘇，加入600μL LB培養(yǎng)基，于37℃，150rpm搖床培養(yǎng)45min。

f.吸取200μL菌液，涂布于Amp⁺LB平板培養(yǎng)基上。

g.37℃培養(yǎng)過夜。

(2)蛋白表達與純化

a.將菌種接種入無菌LB液體培養(yǎng)基中，氨芐青霉素終濃度為50μg/mL，37℃，180rpm搖床培養(yǎng)。

b.待菌液OD600≈0.8時，加入終濃度為0.2mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，16℃誘導(dǎo)過夜(12h)。8000rpm，5min收集菌體。

c.按1L培養(yǎng)體系加30mL Lysis buffer的比例重懸菌體，超聲破菌至澄清。12000rpm離心20min。取上清。

d.將上清與Glutathione Sepharose 4B結(jié)合，填料使用的比例為每升培養(yǎng)體系使用5mL填料，4℃結(jié)合2h。輕輕垂直顛倒混懸。

e.結(jié)合完畢后，500rpm，5min沉淀填料。填料用4℃預(yù)冷PBS沖洗3-5個柱體積，去除雜蛋白。

f.加入PreScission Protease酶切緩沖液，加入PreScission Protease酶。

g.4℃酶切過夜。酶切完畢后，將上清從層析柱中放出。

h.將所得樣品進行SDS-PAGE，鑒定其分子量大小及純度，使用BCA

試劑盒按照試劑盒說明書的操作步驟測定純化蛋白的濃度。

結(jié)果如圖3所示，獲得的7α-HSDHS1-a-1酶蛋白純度很高，呈單一條帶。以相同的方法對撒丁島梭菌7α-HSDH進行蛋白表達，結(jié)果如圖4所示，也獲得了單一條帶的撒丁島梭菌7α-HSDH。

實施例3.7α-HSDHS1-a-1基因的功能鑒定

酶活測定：

在室溫條件下，向比色皿中加入158uL 50mM Tris-HCl(PH＝8.0)溶液，20uL 50mM的NADP⁺溶液，再向其中加入2uL實施例2步驟4獲得的7α-HSDHS1-a-1酶蛋白溶液，最后加入20uL 50mM的CDCA或TCDCA的DMSO溶液，充分吹打混勻。混勻后立即置于分光光度計中調(diào)零。開始計時，每分鐘讀取一次340nm處光吸收的變化值。

與此同時，按照上述相同的方法測定撒丁島梭菌7α-HSDH的酶活。

結(jié)果表明，本發(fā)明分離得到的7α-HSDHS1-a-1基因的產(chǎn)物為7α-羥基類固醇脫氫酶，能夠催化鵝去氧膽酸(CDCA)、牛磺鵝去氧膽酸(TCDCA)的7位羥基的差向異構(gòu)，使其生成熊去氧膽酸(UDCA)、牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)的中間體7-酮石膽酸(7K-LCA)、牛磺7-酮石膽酸(T7K-LCA)。本發(fā)明7α-HSDHS1-a-1酶蛋白以及撒丁島梭菌7α-HSDH酶蛋白對CDCA、TCDCA的比活力如表1所示。

表1.本發(fā)明7α-HSDHS1-a-1與撒丁島梭菌7α-HSDH的比活力比較

比活力(U/mg)定義：在上述反應(yīng)條件下，每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)。

從表1數(shù)據(jù)可以看出，與撒丁島梭菌7α-HSDH相比，本發(fā)明的7α-HSDHS1-a-1具有更高的酶活，對CDCA的比活力是撒丁島梭菌7α-HSDH的將近5倍，對TCDCA的比活力是撒丁島梭菌7α-HSDH的2.5倍多。

SEQUENCE LISTING

<110> 重慶大學(xué)

<120> 新的7α-羥基類固醇脫氫酶基因S1-a-1

<130> P1631748-CQD-CQ-TXH

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 本發(fā)明7α-羥基類固醇脫氫酶S1-a-1的氨基酸序列

<400> 1

Met Lys Lys Leu Glu Asp Lys Val Ala Ile Ile Thr Ala Ala Thr Lys

1 5 10 15

Gly Ile Gly Leu Ala Ser Ala Glu Val Leu Ala Glu Asn Gly Ala Leu

20 25 30

Val Tyr Ile Ala Ala Arg Ser Glu Glu Leu Ala Lys Glu Val Ile Ser

35 40 45

Asn Ile Glu Ser Asn Gly Gly Arg Ala Lys Phe Val Tyr Phe Asn Ala

50 55 60

Arg Glu Pro Gln Thr Tyr Thr Thr Met Val Glu Thr Val Ala Gln Asn

65 70 75 80

Glu Gly Arg Leu Asp Ile Leu Val Asn Asn Tyr Gly Glu Thr Asn Val

85 90 95

Lys Leu Asp Arg Asp Leu Val Asn Gly Asp Thr Glu Glu Phe Phe Arg

100 105 110

Ile Val Gln Asp Asn Leu Gln Ser Val Tyr Leu Pro Ser Lys Ala Ala

115 120 125

Ile Pro Arg Met Ala Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Ile Ser

130 135 140

Thr Ile Gly Ser Val Val Pro Asp Leu Gly Arg Ile Ala Tyr Cys Val

145 150 155 160

Ser Lys Ala Ala Ile Asn Ser Leu Thr Gln Asn Ile Ala Leu Gln Tyr

165 170 175

Ala Arg Gln Gly Val Arg Cys Asn Ala Val Leu Pro Gly Leu Ile Gly

180 185 190

Thr Lys Ala Ala Met Glu Asn Met Thr Asp Glu Phe Arg Asp Ser Phe

195 200 205

Leu Arg His Val Pro Ile Asn Arg Val Gly Lys Pro Glu Asp Ile Ala

210 215 220

Lys Ala Val Leu Tyr Tyr Ala Ser Asp Asp Ser Asp Tyr Val Thr Gly

225 230 235 240

Met Ile His Glu Val Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Gly Ser Pro Gln Tyr

245 250 255

Ala Glu Phe Ser Ala Met Met Glu Arg Ser Arg

260 265

<210> 2

<211> 804

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 本發(fā)明7α-羥基類固醇脫氫酶基因的核苷酸序列

<400> 2

atgaaaaagt tagaagataa agtagcaata attactgcag ctacaaaagg cataggtctt 60

gcttcagcag aagtgttagc tgaaaatgga gctttagtct atatagcagc aagatctgag 120

gaattagcca aggaagttat atccaacatt gaaagtaatg gtggtagagc taagttcgta 180

tatttcaatg ctcgtgagcc acaaacctat actactatgg tagaaactgt ggcacaaaat 240

gaaggaaggt tagacatatt agtaaataac tacggtgaaa ctaacgtaaa gctcgacaga 300

gatttagtta atggggacac agaggaattt tttaggatag ttcaagataa cttacaaagc 360

gtttatttac ctagtaaggc tgcaatacct cgtatggcta aaaatggagg tggaagtata 420

gtaaatatat caacaatagg atctgttgtt ccagacttag gaaggattgc ttattgtgtt 480

tcaaaggcag caataaactc tttaactcaa aatatagctc ttcaatatgc gagacaaggg 540

gtaagatgta atgctgtgct tccaggctta attggaacta aagcagctat ggagaatatg 600

accgatgaat ttagggattc cttcttaaga catgtaccaa taaacagagt cggaaaacca 660

gaagatattg caaaggcagt actttattat gcaagtgatg attcagatta tgtaactgga 720

atgattcatg aagttgctgg aggatatgct ttaggaagtc cacaatatgc tgagttttct 780

gcaatgatgg agagaagtag atag 804

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR擴增本發(fā)明7α-HSDHS1-a-1基因的正向引物

<400> 3

atgaaaaagt tagaagataa agtag 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR擴增本發(fā)明7α-HSDHS1-a-1基因的反向引物

<400> 4

ctatctactt ctctccatca ttg 23