本發(fā)明涉及一種采用離體葉片鑒定甘蔗梢腐病抗性的方法。
背景技術(shù)：
甘蔗梢腐病是甘蔗生產(chǎn)上的一種重要葉部病害，甘蔗梢腐病(Pokkah Boeng)是由多種鐮刀菌引起的一種甘蔗葉部病害，病原菌為藤倉赤霉病菌復(fù)合種(Gibberella fujikuroi complex)，無性態(tài)至少包括Fuarium sacchri、F.proliferatum、F.verticillioides、F.subglutinan和F.andiyazi等5種鐮刀菌。病原菌主要通過氣流傳播到甘蔗心葉侵染為害，造成葉片死亡，植株生長受阻，嚴(yán)重可造成植株死亡，導(dǎo)致甘蔗減產(chǎn)5％-20％，甘蔗糖分降低達(dá)3％，對感病甘蔗品種造成待影響更加顯著。該病在幾乎所有甘蔗生產(chǎn)國家和地區(qū)均普遍發(fā)生，雖然通過化學(xué)藥劑進(jìn)行防控可降低該病的發(fā)生。但應(yīng)用抗病品種可有效減少甘蔗梢腐病的發(fā)生，并降低化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染。
近年來，甘蔗梢腐病在我國蔗區(qū)的發(fā)生呈逐漸加重的趨勢，對我國的甘蔗生產(chǎn)和糖業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，建立一套快速、精準(zhǔn)的甘蔗梢腐病抗性鑒定方法，有利于對現(xiàn)有的甘蔗種質(zhì)資源和品種進(jìn)行科學(xué)評價，為甘蔗梢腐病的抗病育種以及品種的和合理布局提供科學(xué)依據(jù)。
現(xiàn)有技術(shù)中已有甘蔗苗期人工針刺接種對梢腐病的抗性評價，但是整個過程需要經(jīng)歷甘蔗種消毒、播種，待蔗苗長至3～4片完全葉后才能接種，接種后需要10～15天才能觀察和判斷甘蔗品種的抗病性。整個周期較長，甘蔗從播種到可以接種的適當(dāng)苗齡至少需要1.5～2個月的時間，且大棚不易控制溫濕度，不同的季節(jié)播種，甘蔗的抗性不同，容易造成重復(fù)性試驗結(jié)果的不一致。另外，不及時進(jìn)行接種時，隨著苗齡的增加，品種本身的抗性會不斷提高，接種難以致使甘蔗葉片發(fā)病，導(dǎo)致抗性水平的判別誤差。
公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種采用離體葉片鑒定甘蔗梢腐病抗性的方法，該方法能縮短鑒定評價的周期，簡易、精準(zhǔn)、有效、重復(fù)性好，樣本的采集不易受栽培季節(jié)以及苗齡的影響。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種采用離體葉片鑒定甘蔗梢腐病抗性的方法，包括以下步驟：
(1)將甘蔗梢腐病菌接種在PDA培養(yǎng)基平板上，25-28℃培養(yǎng)3-5天；
(2)采集新鮮甘蔗葉片，清洗葉片，將葉片剪成片段，在葉片中間葉脈兩側(cè)刺傷，取甘蔗梢腐病菌的菌塊接種在刺傷部位，以長有菌絲的一面貼在傷口處；
(3)將接菌的甘蔗葉片置于培養(yǎng)皿中，噴灑無菌水，于室溫條件下放置3-5天；
(4)病情調(diào)查，觀察和測量病斑的長度，沿著葉脈方向測量黃色暈圈的長度，根據(jù)病斑長度對甘蔗品種梢腐病抗性進(jìn)行評價，去除一個最高值和一個最低值，以剩余數(shù)值的平均值代表該甘蔗品種的抗性；甘蔗梢腐病的發(fā)病等級劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：
0級：無發(fā)病癥狀；
1級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度≤1.0cm；
2級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度1.1-2.0cm；
3級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度2.1-3.0cm；
4級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度3.1-4.0cm；
5級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度>4.0cm。
優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，根據(jù)甘蔗梢腐病的發(fā)病等級劃分標(biāo)準(zhǔn)對甘蔗抗性等級進(jìn)行劃分，甘蔗抗性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：
高抗：發(fā)病等級為0；
抗病：發(fā)病等級為1；
中抗：發(fā)病等級為2；
中感：發(fā)病等級為3；
感病：發(fā)病等級為4
高感：發(fā)病等級為5。
優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟(2)中采集新鮮甘蔗葉片為，從心葉往下數(shù)第2至第4張完全展開葉片。
優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟(2)中葉片剪成的片段長度為10-14cm。
優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟(2)中取菌塊為，用滅菌的移液器槍頭挖取菌塊，菌塊直徑為5-6mm。
優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟(3)中噴灑無菌水的量為3-5ml。
優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟(3)中培養(yǎng)皿選用直徑為15cm。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明一種采用離體葉片鑒定甘蔗梢腐病抗性的方法，采用離體接種測定甘蔗品種對梢腐病抗性水平，甘蔗葉片樣本的采集不受甘蔗苗齡，種植時期的影響，測定條件易控制。甘蔗離體葉片在保溫保濕條件下可在一定時間內(nèi)不干枯，保證了病原菌的侵染。接種體的制備省工省事，直接接種在PDA培養(yǎng)基平板室溫培養(yǎng)即可，無需額外制作液體培養(yǎng)液以及分生孢子液。無需按照季節(jié)進(jìn)行甘蔗種苗的種植，也不受甘蔗苗齡和場地的限制，在室內(nèi)操作簡便，重復(fù)性好，尤其對于大量樣本的篩選具有較好的省工、省時的特點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。
實(shí)施例
一種采用離體葉片鑒定甘蔗梢腐病抗性的方法，包括以下步驟：
1、接種體的制備
采用致病力較強(qiáng)的兩個甘蔗梢腐病鐮刀菌菌株進(jìn)行分別培養(yǎng)。具體為：分別將甘蔗梢腐病病原菌接種在PDA培養(yǎng)基平板上活化3天，挑取邊緣菌絲接種新的PDA培養(yǎng)基平板上，25-28℃培養(yǎng)3-5天，用滅菌的1mL移液器槍頭(寬口的一端)挖取菌絲塊(直徑約5-6mm)，待用。
2、接種材料的處理
選擇生產(chǎn)上表現(xiàn)為甘蔗梢腐病感病品種GT37和LC05-136，抗病品種ROC22以及5個區(qū)試品系(G505-3217、GR2、GT08-6、GT09-1743和GT08-120)，采集新鮮甘蔗葉片(從心葉往下數(shù)第2至第4張完全展開葉片)，用自來水沖洗干凈表面的塵土，晾干，剪成約12cm的片段。
3、接種
用大頭針在葉片中間葉脈兩側(cè)刺傷，按照約3×3mm的方式共刺4針。取甘蔗梢腐病菌菌塊，接種在刺傷部位，以長有菌絲的一面貼在傷口處，菌碟完全覆蓋刺傷口。每個菌株分別在10張葉片葉脈的一側(cè)接種，另一側(cè)以接純PDA培養(yǎng)基為對照。將接菌的甘蔗葉片至于直徑15cm的玻璃培養(yǎng)皿中，噴灑適量的無菌水(約3-5mL)。于室溫條件(25-28℃)下放置3-5天。
4、病情調(diào)查
觀察和測量病斑的長度，沿著葉脈方向測量黃色暈圈的長度，根據(jù)病斑長度對甘蔗品種梢腐病抗性進(jìn)行評價，去除一個最高值和一個最低值，以剩余數(shù)值的平均值代表該甘蔗品種的抗性；對針刺接種法，甘蔗梢腐病的發(fā)病等級劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：
0級：無發(fā)病癥狀；
1級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度≤1.0cm；
2級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度1.1-2.0cm；
3級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度2.1-3.0cm；
4級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度3.1-4.0cm；
5級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度>4.0cm。
根據(jù)甘蔗梢腐病的發(fā)病等級劃分標(biāo)準(zhǔn)對甘蔗抗性等級進(jìn)行劃分，甘蔗抗性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：
高抗：發(fā)病等級為0；
抗病：發(fā)病等級為1；
中抗：發(fā)病等級為2；
中感：發(fā)病等級為3；
感病：發(fā)病等級為4
高感：發(fā)病等級為5。
5、抗性結(jié)果鑒定
不同甘蔗品種接種梢腐病菌抗性水平鑒定結(jié)果見表1。不同甘蔗品種對對不同梢腐病菌株的感病情況不一樣，采用兩個前期篩選為致病力較強(qiáng)的菌株分別對8個甘蔗品種(材料)進(jìn)行接種，除了在個別材料上表現(xiàn)抗性有些差異，但總體水平較為一致。例如，抗性最差的兩個甘蔗品種LC05-136和GT37分別接種2個病原菌株時，均表現(xiàn)為抗性最差；而抗性較強(qiáng)的甘蔗材料GT08-120分別接種2個病原菌株時，也均表現(xiàn)為較好的抗性。室內(nèi)離體抗性鑒定結(jié)果與生產(chǎn)上的表現(xiàn)基本一致。說明該方法能較好地適用于甘蔗梢腐病抗性材料的篩選。
表1不同甘蔗品種接種梢腐病菌抗性水平鑒定結(jié)果
前述對本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。