本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及分離的核酸及其應用，更具體地，涉及分離的核酸、分離的多肽、表達載體、重組細胞、制備重組細胞的方法、制備分離的多肽的方法，以及藥物組合物。

背景技術：

乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)是乙型肝炎病毒(HBV)的一個重要成分。具有免疫原性，無致病性。現有的乙型肝炎病毒核心抗原的原始基因大多在常見的表達載體里無表達，或表達量很低，限制了工業應用。

由此，對乙型肝炎病毒核心抗原的體外表達方法有待改進。

技術實現要素：

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種分離的核酸，該核酸在體外表達載體中的表達量高，表達的重組蛋白活性好。

需要說明的是，本發明是基于發明人的下列工作而完成的：

目標乙肝核心抗原原始的基因序列如圖1中hbcYS基因序列所示，該序列通過基因重組在大腸桿菌中基本無表達，為了提高目標乙肝核心抗原基因在大腸桿菌中的表達量，優化表達特性，發明人對hbcYS基因序列進行重新設計，得到了圖1中的hbcYH基因序列，即SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，該基因在大腸桿菌中能夠以可溶性蛋白形式表達，并且該可溶性蛋白的氨基酸序列與目標乙肝核心抗原的氨基酸序列一致，其氨基酸序列比對圖如圖2所示，并且該蛋白的表達量高，表達的重組蛋白活性好，適于工業生產。

因而，根據本發明的第一方面，本發明提供了一種分離的核酸。根據本發明的實施例，該分離的核酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，該序列具體如下：

發明人驚奇的發現，通過對乙肝核心抗原原始的基因序列進行重新設計，得到的分離的核酸能夠在體外的表達載體中表達，解決了現有的原始乙肝核心抗原基因在體外載體中不表達或表達量極低的問題，并且，重組蛋白的表達量高，活性好。根據本發明的實施例，該核酸在體外載體中表達的目標多肽，即乙肝核心抗原(HBC)，在全菌蛋白中占20％以上。

對于本發明說明書和權利要求書中所提及的核酸，本領域技術人員應當理解，實際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權利要求書中，雖然多數情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如，提及SEQ ID NO：1，實際包括其互補序列。本領域技術人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之亦然。

本發明中所用術語“分離的”是指如核酸、多肽或者蛋白質等材料，其與其天然存在的環境相分離。所述分離的材料任選包含在其天然環境中未發現的材料。

在本發明的第二方面，本發明提供了一種分離的多肽。根據本發明的實施例，該分離的多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其序列具體如下：

在本文中所使用的術語“多肽”應做廣義理解，是指包含至少兩個以肽鍵結合的氨基酸的化合物，其可以含有任選經過修飾的氨基酸或者非氨基酸結構。另外，在本文中，如沒有明確說明，“多肽”、“蛋白質”以及“肽鏈”可以互換使用。

根據本發明實施例的分離的多肽是前述的分離的核酸在體外表達載體中表達得到的重組蛋白，即乙肝核心抗原(HBC)，該多肽的表達量高，活性好。

根據本發明的實施例，分離的多肽為可溶性多肽。由此，能夠較好的保持多肽的活性，便于分離純化，節約生產成本。

根據本發明的第三方面，本發明提供了一種表達載體。根據本發明的實施例，該表達載體包含前述的分離的核酸。

根據本發明的實施例表達載體，能夠高表達前述的分離的核酸，從而大量獲得本發明所提出的前述的分離的多肽，該多肽的產量與現有采用原乙肝核心抗原基因體外合成的相比，產量顯著提高；并且如前所述，該蛋白具有高水溶性的特點。

根據本發明的第四方面，本發明提供了一種重組細胞。根據本發明的實施例，該重組細胞含有權利要求1所述的基因。由此，該重組細胞能夠高表達本發明前述的核酸，從而大量獲得前述的多肽，該多肽的產量和純度與現有乙肝核心抗原相比，產量和活性均顯著提高。根據本發明的實施例，該多肽的表達量高，在全菌蛋白中占20％以上。

根據本發明的第五方面，本發明提供了一種制備前述的重組細胞的方法。根據本發明的實施例，該方法包括：將前述的表達載體引入宿主細胞中。根據本發明的實施例，本發明所提出的制備重組細胞的方法能夠大量獲得高活性的前述的重組細胞，進而大量獲得本發明所提出的前述的多肽，該多肽的產量和活性與現有體外合成的乙肝核心抗原相比，產量和活性均顯著提高；并且根據本發明的一些實施例，該多肽具有高水溶性的特點。根據本發明的實施例，該多肽的表達量高，在全菌蛋白中占20％以上。此外，該制備重組細胞的方法簡單，可操作性強，制備成本低，適宜于大規模的工業化制備。

根據本發明的一些實施例，所述宿主細胞可以是大腸桿菌細胞或其衍生細胞，大腸桿菌細胞或其衍生細胞可以進一步提高所述重組細胞的產量和活性，從而進一步提高所述蛋白的表達。根據本發明的優選實施例，宿主細胞可以是大腸桿菌(E.coli)BL21、大腸桿菌(E.coli)JM109、大腸桿菌(E.coli)Origami和大腸桿菌(E.coli)Rosetta。具體地，可以是大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)、大腸桿菌(E.coli)JM109(DE3)、大腸桿菌(E.coli)Origami(DE3)和大腸桿菌(E.coli)Rosetta(DE3)。由此，重組細胞的產量和活性更高。

根據本發明的第六方面，本發明提出了一種制備前述分離的多肽的方法。根據本發明的實施例，該方法包括：在適于所述分離的多肽表達的條件下，培養本發明前述的重組細胞，以便獲得所述分離的多肽。據本發明的實施例方法，能夠大量獲得高純度的前述的多肽，并且該多肽具有高水溶性和高活性的特點。根據本發明的實施例，該多肽的表達量高，在全菌蛋白中占20％以上。

根據本發明的第七方面，本發明提供了一種分離的多肽在制備藥物中的用途，其特征在于，所述藥物在預防和治療流感病毒誘發的疾病中的應用。

其中，流感病毒誘發的疾病包括未變異的流感病毒所引起的疾病和流感病毒變異導致所用疫苗株未產生有效保護力所造成的疾病。

根據本發明的第八方面，本發明提供了一種藥物組合物。根據本發明的實施例，該藥物組合物的活性成分包括前述分離的多肽。

根據本發明的一些實施例，本發明所提出的以本發明所提出的蛋白作為活性成分的藥物組合物還可以包括藥物上可接受的載體，且藥物組合物的劑型和給藥方式不受特別限制，所述載體、劑型和給藥方式的選擇以不影響或增強本發明所提出蛋白的活性為前提。對于口服給藥，該藥物上可接受的載體可以包括粘合劑，潤滑劑，崩解劑，賦形劑，增溶劑，分散劑，穩定劑，懸浮劑，著色劑和芳香劑。對于注射制劑，藥物上可接受的載體可以包括緩沖劑，防腐劑，止痛劑，增溶劑，等滲壓劑(isotonic agent)和穩定劑。對于局部給藥的制劑，藥物上可接受的載體可以包括堿，賦形劑，潤滑劑和防腐劑。本發明的藥物組合物可以與上述的藥物上可接受的載體結合被制備成各種劑型。例如，對于口服給藥，藥物組合物可以被制備成小片，片劑，膠囊，酏劑，混懸液，糖漿或薄片。對于注射制劑，藥物組合物可以被制備成例如一次劑量的劑型的安瓿或例如多劑量容器的單元型劑型。藥物組合物還可以被制備成溶液，懸浮液，藥片，藥丸，膠囊和長效制劑。

其中，根據本發明的一些具體示例，適合藥物配方的載體中賦形劑和稀釋液的可以包括：乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麥芽糖醇，淀粉，阿拉伯橡膠，藻酸鹽，凝膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羥基苯甲酸甲酯，羥苯丙酯，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。

根據本發明的另一些實施例，本發明的藥物組合物中還可以包括填充劑，抗凝血劑，潤滑劑，保濕劑，芳香劑和防腐劑。

在本文中所使用的術語“給藥”指將預定量的物質通過某種適合的方式引入病人。本發明的藥物組合物可以通過任何常見的途徑被給藥，途徑的選擇以不影響所述蛋白的活性為前提，只要它可以到達預期的組織。給藥的各種方式是可以預期的，包括腹膜，靜脈，肌肉，皮下，皮層，口服，局部，鼻腔，肺部和直腸，但是本發明不限于這些已舉例的給藥方式。然而，由于口服給藥時，口服給藥的組合物的活性成分應該被包被或被配制以防止其在胃部被降解。優選地，本發明的組合物可以注射制劑被給藥。此外，本發明的藥物組合物可以使用將活性成分傳送到靶細胞的特定器械來給藥。

本發明的藥物組合物的給藥頻率和劑量可以通過多個相關因素被確定，該因素包括要被治療的疾病類型，給藥途徑，病人年齡，性別，體重和疾病的嚴重程度以及作為活性成分的藥物類型。根據本發明的一些實施例，日劑量可分為適宜形式的1劑、2劑或多劑，以在整個時間段內以1次、2次或多次給藥，只要達到治療有效量即可。

術語“治療有效量”是指足以顯著改善某些與疾病或病癥相關的癥狀的量，也即為給定病癥和給藥方案提供治療效果的量。例如，在促進成骨細胞的增殖，促進成骨細胞的分化，促進成骨細胞的礦化，或預防或治療骨質疏松中，減少、預防、延緩、抑制或阻滯疾病或病癥的任何癥狀的藥物應當是治療有效的。治療有效量的藥物不需要治愈疾病或病癥，但將為疾病或病癥提供治療，使得個體的疾病或病癥的發作被延緩、阻止或預防，或者疾病或病癥的癥狀得以緩解，或者疾病或病癥的期限被改變，或者例如疾病或病癥變得不嚴重，或者加速康復。

術語“治療”用于指獲得期望的藥理學和/或生理學效果。所述效果就完全或部分預防疾病或其癥狀而言可以是預防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病導致的不良作用而言可以是治療性的。本文使用的“治療”涵蓋哺乳動物、特別是人的疾病(主要指骨質疏松)的治療，包括：(a)在容易患病但是尚未確診得病的個體中預防疾病(例如預防或治療骨質疏松)或病癥發生；(b)抑制疾病，例如阻滯疾病發展；或(c)緩解疾病，例如減輕與疾病相關的癥狀。本文使用的“治療”涵蓋將藥物給予個體以治療、治愈、緩解、改善、減輕或抑制個體的疾病的任何用藥，包括但不限于將含本文所述提出的以本發明所提出蛋白為活性成分的藥物組合物給予有需要的個體。

根據本發明的實施例，本發明藥物組合物可與常規治療方法和/或療法相結合使用，或者可與常規治療方法和/或療法分開使用。當本發明的藥物組合物在采用與其它藥物的聯合療法中給藥時，它們可序貫地或同時地給予個體。或者，本發明的藥物組合物可包含本發明所提出的蛋白、藥學上可接受的載體或藥學上可接受的賦形劑以及本領域已知的其它治療藥或預防藥的組合。

本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。

附圖說明

本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據本發明一個實施例的核酸序列比對示意圖；

圖2顯示了根據本發明一個實施例的氨基酸序列比對示意圖；

圖3顯示了根據本發明一個實施例的電泳結果示意圖；

圖4顯示了根據本發明又一個實施例的電泳結果示意圖。

具體實施方式

下面參考具體實施例，對本發明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發明的限制。

下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品，例如可以采購自Sigma公司。

實施例1

1實驗原料

1.1質粒與菌種：質粒pET-28a，pET-30a，pET-32a，pET-26b。大腸桿菌BL21(DE3)、JM109(DE3)、OrigmaB(DE3)或Resseta(DE3)。

1.2工具酶：NcoI、XhoI、T4DNA連接酶、NEB公司產品。Taq酶TaKaRa公司。

1.3DNA分子量標志：TaKaRa公司。DL-2000由片段2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp構成。

1.4蛋白質分子量標記：Thmero產品。分子量大小：

1.5試劑：

細菌液體培養基(LB)：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化鈉10g；加蒸餾水至1000ml，溶解后用氫氧化鈉調pH至7.5，高壓滅菌。

細菌液體培養基(LA)：在上述培養基中加入卡那霉素使終濃度為50μg/ml。

LB、LA固體培養基：在LB、LA固體培養基中加入1.5％瓊脂。

電泳緩沖液(TAE)(50x)：Tris 242g，Na2EDTA·2H2O 37.2g，57.1ml的冰乙酸，加雙蒸水至1000ml。

上樣緩沖液(6x)：0.25％溴酚藍，40％(w/v)蔗糖，溶于雙蒸水，4℃保存。

試劑盒

質粒DNA小量提取試劑盒：Thermo公司的GeneJETTMPlasmid Miniprep Kit

凝膠回收試劑盒：Fermentas公司的GeneJETTMGel Extraction Kit

1.7主要儀器設備及其它

水浴鍋(55℃-65℃)、離心機(Sigma 2-16K)、移液器(量程為100-1000μl，10-100μl)

2.乙肝核心抗原HBC制備方法

2.1克隆編碼HBC的基因

利用PCR技術，模板DNA具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，引物序列如下：

正向引物：5’-tataccATGGATATTGATCCGTATAAAG-3’(SEQ ID NO：3)

反向引物：5’-GGTGCTCGAGTCATTAGCACTGCGGTTC-3’(SEQ ID NO：4)

克隆得到大量與模板DNA相同的目的基因，該目的基因編碼乙肝核心抗原。

2.2構建含有HBC基因片段的重組質粒

選用Nco I和Xho I酶切合成的序列和pET-28a，pET-30a，pET-32a，pET-26b載體，構建重組質粒，電泳鑒定后切膠回收目的條帶。將回收的目的條帶再次電泳鑒定。

測定回收DNA片段的濃度，具體方法如下：

(1)按照HBC酶切DNA片段和酶切載體DNA片段3:1的比例混合，加入T4連接酶于16℃連接12小時，構建表達載體。

(2)將表達載體轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培養箱中過夜培養。

(3)挑選不同表型的單菌落進行PCR反應鑒定是否含有插入的目的片段(555bp)，反應條件如下：95℃預變性5min后，進行30輪循環(95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s)，最后72℃延伸10min。電泳分析是否含有重組質粒。經鑒定含有重組質粒的單菌落于含有50μg/ml卡那霉素的5ml液體LB培養基中。

(4)將含有重組質粒的單菌落37℃、220rpm培養過夜，按照分子克隆描述的方法提取質粒DNA，測定DNA濃度和純度后，再次按步驟(3)的程序進行的PCR鑒定，鑒定含有目的片段的質粒選用Nco I和Xho I酶切鑒定，篩選出正確的重組質粒，結果如圖3所示。

2.3將重組質粒轉化至表達宿主中誘導表達

(1)將鑒定含有目的片段的重組質粒轉化至大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)、JM109(DE3)、OrigmaB(DE3)或Resseta(DE3)感受態細胞中，涂于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培養箱中過夜培養。

(2)挑選步驟(1)得到的不同表型的單菌落進行PCR反應，鑒定是否含有插入的目的片段(555bp)。其中，PCR反應條件如下：95℃預變性5min后，進行30輪循環(95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s)，最后72℃延伸10min。

(3)利用電泳分析各表型的單菌落是否含有重組質粒，經鑒定含有重組質粒的單菌落于含有50μg/ml卡那霉素的5ml液體LB培養基中。

(4)將含有重組質粒的感受態細胞于37℃、220rpm培養過夜，按照分子克隆描述的方法提取質粒DNA，測定DNA濃度和純度后，再次按“2.2”中步驟(3)的程序進行進一步的PCR鑒定，鑒定含有目的片段的質粒選用NcoI、XhoI酶切鑒定。

(5)將鑒定正確的單菌落于含有50μg/ml卡那霉素的5ml液體LB培養基中，37℃、220rpm培養過夜，加入不含卡那霉素的LB下回培養液至OD600為0.8時，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導表達4小時。

(6)收集誘導液于10000rpm離心，收集菌體，加入上樣緩沖液懸浮細胞，99℃加熱處理5min，將處理的樣品聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳分析，分析目的蛋白的表達量，結果如圖4所示。將由目的蛋白表達的菌株送至上海生工生物測序鑒定重組質粒的正確性，經測序表明，菌種質粒中含有的HBC序列與設計序列一致。結果表明，利用本發明實施例提供的具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的基因可以表達原有的乙肝核心抗原，解決了現有的原始乙肝核心抗原基因在體外載體中不表達或表達量極低的問題，并且，重組蛋白的表達量高，活性好。

在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。

盡管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由權利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 華蘭生物工程股份有限公司

華蘭生物疫苗有限公司

華蘭基因工程有限公司

<120> 分離的核酸及其應用

<130> PA161-07022

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 555

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 分離的核酸

<400> 1

atggatattg atccgtataa agaatttggc gcgtcggtgg aactgttatc attcctgcct 60

tcggactttt tcccgtcaat tcgcgatctg ctggataccg cctcggcgct gtaccgcgaa 120

gcgctggagt caccggaaca ttgttcgccg catcacaccg ccctgcgtca ggcggttctg 180

tgctggggcg aactgatgaa cctggcgacc tgggtgggtt cgaacctgga agatccggcc 240

tcacgcgagt tggtggtttc gtatgtgaac gtgaacatgg gcctgaaaat tcgtcagctg 300

ttatggtttc acatctcatg tctgacgttc ggccgcgaaa ccgtgctgga atacctggtg 360

tcgtttggtg tttggattcg caccccgcct gcgtatcgcc cgcctaacgc cccgattttg 420

tcaaccctgc cggagaccac ggtggttcgt cgtcgcggcc gttcgccgcg ccgtcgcacc 480

ccgtcaccgc gccgtcgccg ttcgcagtcg ccgcgccgtc gccgttcgca gtcacgcgaa 540

ccgcagtgct aatga 555

<210> 2

<211> 183

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 分離的多肽

<400> 2

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Val Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala

65 70 75 80

Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

85 90 95

Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr

145 150 155 160

Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser

165 170 175

Gln Ser Arg Glu Pro Gln Cys

180

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物

<400> 3

tataccatgg atattgatcc gtataaag 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 4

ggtgctcgag tcattagcac tgcggttc 28