本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于多價(jià)腦膜炎球菌和肺炎球菌綴合疫苗的重組δfhbp-nada蛋白載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

一、病原微生物與疫苗

能引起人體或動(dòng)物體發(fā)生傳染病的微生物，稱為病原微生物或致病微生物。傳染是指病原微生物侵入機(jī)體后，在一定的部位生長(zhǎng)、繁殖，并引起一系列病理生理的過(guò)程。當(dāng)病原微生物侵入機(jī)體后，病原微生物與機(jī)體互相作用，互相改變對(duì)方的活性與功能，因此能否引起傳染病，一方面取決于病原微生物的致病能力即致病性或毒力，另方面還取決于機(jī)體的抵抗力即免疫力。病原性細(xì)菌引起傳染的能力大小，就是細(xì)菌的毒力或致病性。細(xì)菌毒力的有無(wú)和毒力的強(qiáng)弱主要取決于它的侵襲力、產(chǎn)毒素性和引起超敏反應(yīng)的能力。

細(xì)菌產(chǎn)生的毒素可分為外毒素和內(nèi)毒素兩大類。外毒素是病原菌在生長(zhǎng)繁殖期間分泌到周圍環(huán)境種的一種代謝產(chǎn)物，主要由革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生，少數(shù)革蘭氏陰性菌也能產(chǎn)生。其化學(xué)組成是蛋白質(zhì)，抗原性強(qiáng)，毒性也強(qiáng)，但極不穩(wěn)定，對(duì)熱和某些化學(xué)物質(zhì)敏感，容易受到破壞。常見的如：白喉棒桿菌產(chǎn)生的白喉外毒素、破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素、霍亂弧菌產(chǎn)生的腸毒素、肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒毒素等。大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌能產(chǎn)生內(nèi)毒素，實(shí)際上它存在于細(xì)菌細(xì)胞壁的外層，屬于細(xì)胞壁的組成部分，一般情況下并不分泌到環(huán)境中，只有當(dāng)細(xì)菌溶解后才釋放出來(lái)，因而稱為內(nèi)毒素，其毒性比外毒素要低，抗原性也弱。

同種生物的不同個(gè)體，當(dāng)它們與病原菌接觸后，有的患病，有的則安然無(wú)恙，原因在于不同個(gè)體的免疫力不同。免疫就是指機(jī)體識(shí)別和排除抗原異物(如病原微生物等)的一種保護(hù)性反應(yīng)。一般來(lái)講，它對(duì)機(jī)體是有利的，在異常條件下，也可能損害機(jī)體。人體的免疫分為非特異性免疫和特異性免疫。其中特異性免疫是指機(jī)體針對(duì)某一種或某一類微生物或產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異抵抗力。而疫苗即是科學(xué)家研制出來(lái)使機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫抵抗病原微生物對(duì)人體侵害的生物制品，通常由病原微生物本身加以制備而成的。細(xì)菌、病毒和立克次氏體等病原微生物制成疫苗，注射機(jī)體后，使機(jī)體產(chǎn)生特異性或致敏性淋巴細(xì)胞，分泌抗體，達(dá)到特異性免疫效果。

而疫苗又分為治療性和預(yù)防性兩種，通過(guò)治療性疫苗治療疾病，并通過(guò)預(yù)防性疫苗保護(hù)人體不受致病性微生物的侵害。經(jīng)過(guò)多年的努力，醫(yī)學(xué)界已經(jīng)開發(fā)出各種不同的疫苗用以預(yù)防，諸如細(xì)菌、病毒和真菌等，感染造成的各種疾病，極大地提高了人類的健康水平。生物技術(shù)的不斷發(fā)展，促進(jìn)了疫苗品種的多樣化。用以預(yù)防病毒導(dǎo)致的傳染病有滅活病毒技術(shù)開發(fā)出來(lái)的疫苗，如乙腦疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、流感疫苗等；減毒病毒技術(shù)開發(fā)出來(lái)的減毒活疫苗，如輪狀病毒疫苗、口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、風(fēng)疹病毒疫苗和水痘疫苗等。用以預(yù)防細(xì)菌性傳染病的有用蛋白和多糖等生物大分子純化技術(shù)開發(fā)出來(lái)的細(xì)菌類疫苗，如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素及其亞細(xì)胞組分、流行性腦膜炎球菌多糖和23價(jià)肺炎球菌多糖等。更先進(jìn)的有用半化學(xué)結(jié)合技術(shù)開發(fā)出來(lái)的預(yù)防腦膜炎和肺炎的細(xì)菌疫苗，如流行性嗜血桿菌b型多糖-蛋白綴合疫苗、7價(jià)或10價(jià)肺炎球菌多糖-蛋白綴合疫苗以及4價(jià)腦膜炎球菌多糖-蛋白綴合疫苗。通過(guò)對(duì)生物技術(shù)的不斷改進(jìn)，能夠開發(fā)出更多的新型疫苗產(chǎn)品來(lái)應(yīng)付不同的病原微生物對(duì)人類健康的挑戰(zhàn)。

二、多糖-蛋白綴合疫苗及其蛋白載體

多糖是病原菌中的一種重要免疫有效成分，有菌體多糖(ops)和莢膜多糖(cps)之分。當(dāng)病原體侵入機(jī)體后，它們作為免疫原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。而目前許多能引起危害嚴(yán)重的疾病的病原體如流感嗜血桿菌b型(haemophilusinfluenzaetypeb，hib)，肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae，spn)和腦膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis，nm)其表面都具有多糖，這些多糖能夠賦予病原體對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷和吞噬作用產(chǎn)生抗性，從而促進(jìn)它們發(fā)病期間在血液中的存活。第一代針對(duì)hib，spn和nm的疫苗即以多糖為抗原。但不幸的是，這些多糖疫苗在幼兒中不是免疫原性的，并且不能產(chǎn)生免疫記憶。這是因?yàn)槎嗵欠肿訉儆趖細(xì)胞不依賴性抗原(ti-ag)，免疫原性較弱，接種嬰幼兒后免疫效果尤其不理想。為了提高多糖疫苗的免疫原性，在20世紀(jì)20年代和30年代由landsteiner，avery和goebel通過(guò)與蛋白質(zhì)偶聯(lián)來(lái)增強(qiáng)。1980年，johnrobbins和rachelschneerson描述了hib多糖與白喉和破傷風(fēng)類毒素蛋白的綴合物，極大的增強(qiáng)了動(dòng)物模型中的抗體反應(yīng)。最終hib多糖-蛋白質(zhì)綴合物，在人類嬰兒中引發(fā)記憶型抗體應(yīng)答。新一代的多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗，在疫苗學(xué)中創(chuàng)造了復(fù)興。這類綴合物將過(guò)去的t細(xì)胞非依賴性多糖疫苗轉(zhuǎn)化為在兒童中具有更強(qiáng)免疫原性的t細(xì)胞依賴性疫苗，顯示具有產(chǎn)生具有高親合力的抗體的能力，建立免疫記憶，并產(chǎn)生群免疫效應(yīng)。此外，它們改善了年輕嬰兒的未成熟免疫系統(tǒng)和老年人的衰老免疫系統(tǒng)的保護(hù)性應(yīng)答，從而達(dá)到最佳的免疫效果。

迄今為止，5種載體蛋白已用于許可上市的綴合疫苗中：白喉毒素?zé)o毒變異體(crm197)，破傷風(fēng)類毒素(tt)，腦膜炎球菌外膜蛋白復(fù)合物(omp)，白喉類毒素(dt)和流感嗜血桿菌蛋白d(hid)。臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明這些綴合疫苗在預(yù)防感染性疾病和改變hib，spn和nm的藥物中的功效。所有5種載體蛋白質(zhì)在增加疫苗免疫原性方面都是有效的，但是它們引起的抗體的量和親合力不同，在同一產(chǎn)品中攜帶多種多糖的能力以及與其它疫苗同時(shí)作用的能力也不同。

crm197是從白喉棒桿菌c7(β197)培養(yǎng)物中分離的白喉毒素的無(wú)毒變體。crm197與野生型白喉毒素的不同之處在于，在氨基酸位置52處的點(diǎn)突變用谷氨酸代替甘氨酸，這消除了其酶活性和毒性。crm197與白喉毒素在抗原上是不可區(qū)分的，但是具有作為綴合蛋白的優(yōu)點(diǎn)：無(wú)毒的，并且具有更多的賴氨酰側(cè)鏈可用于綴合。用作綴合物的crm的另一種形式是純化的天然白喉毒素，其隨后用甲醛解毒，稱為白喉類毒素(dt)，不應(yīng)與crm197混淆。tt是破傷風(fēng)梭菌培養(yǎng)物產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素用甲醛解毒來(lái)制備得來(lái)。omp為nm菌血清型b群外膜蛋白復(fù)合物。dt是白喉?xiàng)U菌培養(yǎng)物產(chǎn)生的白喉毒素，通過(guò)甲醛解毒制備得來(lái)。hid是最初用超聲處理流感嗜血桿菌中，通過(guò)sds-page步驟純化分離流感嗜血桿菌表面蛋白，但是目前的疫苗都是通過(guò)基因工程獲得重組蛋白。

tt、dt等類毒素早已工業(yè)化生產(chǎn)，較易獲得，而且與多糖偶聯(lián)后確實(shí)可大大增強(qiáng)多糖的免疫原性。但為獲得類毒素，需對(duì)細(xì)菌毒素進(jìn)行化學(xué)脫毒。而在這一過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生點(diǎn)對(duì)點(diǎn)突變或不必要的修飾，致毒素的理化性質(zhì)改變，破壞了重要的t細(xì)胞抗原表位，影響其免疫原性。如采用無(wú)毒的變異毒素crm197就可避免上述問(wèn)題。然而體內(nèi)存在的類毒素抗體(tt和dt已大量使用)可能會(huì)導(dǎo)致超敏反應(yīng)或引起抑制抗糖反應(yīng)(免疫抑制)等問(wèn)題。采用相同種屬細(xì)菌的多糖與載體蛋白就可避免這些潛在問(wèn)題。例如開發(fā)nm疫苗，以b群的蛋白或omp蛋白為載體制備a、c、y、w135群多糖-蛋白綴合疫苗不失為一個(gè)良好策略，理論上其可預(yù)防幾乎所有致病性nm，但前提是該b群蛋白載體是“廣譜”的或是具有很大交叉反應(yīng)性的。因此，開發(fā)新型的，能夠賦予疫苗以真正的保護(hù)性免疫原性的蛋白載體迫在眉睫。

三、腦膜炎奈瑟氏菌(nm)及其流行病學(xué)

流行性腦脊髓膜炎(epidemiccerebrospinalmeningitis)是由腦膜炎奈瑟氏菌，通過(guò)呼吸道傳播引起的急性化膿性腦膜炎，在世界各地均有不同程度的流行。腦膜炎奈瑟菌也稱為腦膜炎球菌，是一類革蘭染色陰性雙球菌，通常定植在人的鼻咽部。人類是其唯一宿主，因而nm表現(xiàn)出對(duì)人類鼻咽部高度的適應(yīng)性，10％-40％的健康人群都是nm的無(wú)臨床癥狀攜帶者，在腦膜炎爆發(fā)性流行時(shí)期，無(wú)癥狀攜帶者比例更可高達(dá)70％。少數(shù)情況下，nm可經(jīng)血侵入腦脊髓膜，引起化膿性炎癥，出現(xiàn)腦膜刺激癥和化膿性腦膜炎的腦脊液變化。疫苗預(yù)防是防治腦膜炎球菌病的重要手段，因?yàn)榧词共捎每股馗缮妫@種疾病仍有高發(fā)病率和死亡率。

具有致病性的nm菌株一般都具有莢膜結(jié)構(gòu)，健康人群正常攜帶的菌株往往會(huì)缺失莢膜，成為不能分群的菌株。根據(jù)nm莢膜多糖的化學(xué)組成可將其分成a、b、c、d、h、i、k、l、x、y、z、29e和w13513個(gè)血清群(serogroup)，而根據(jù)其外膜蛋白(omp)、porb(2或3類omp)和pora(1類omp)的抗原性差異，又可分成不同的血清型和血清亞型。全球每年約發(fā)生120萬(wàn)的nm感染病例，多數(shù)病例是由a、b、c、w135、y群菌株引起。而在發(fā)達(dá)國(guó)家中由b群nm引起的流行性腦脊髓膜炎病例更是高達(dá)總病例的80％。在我國(guó)的流行主要以a群為主，近年來(lái)由于疫苗的廣泛接種，a群引起的感染得到有效控制，而由b群引起的病例也相對(duì)增多。單一血清群、血清型和血清亞型的流腦菌苗在整體上很難預(yù)防流行性腦脊髓膜炎的發(fā)生。隨著對(duì)nm表面抗原結(jié)構(gòu)更加深入的研究，流腦菌苗正朝著多元化方向發(fā)展。

流腦多糖-蛋白綴合菌苗已有研制，chiron和wyem使用脫毒白喉類毒素(crm197)作為蛋白載體，baxter用破傷風(fēng)類毒素作為載體，開發(fā)了a/c群腦膜炎球菌綴合疫苗，于1999年11月引入了英國(guó)。此后sanofi-pasteur開發(fā)了a/c/y/w135群多糖共價(jià)結(jié)合白喉類毒素(mcv4)的四價(jià)綴合疫苗，我國(guó)已有幾種a、c群腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白tt的綴合疫苗批準(zhǔn)上市。由于腦膜炎球菌多糖及綴合疫苗應(yīng)用，有效的預(yù)防了a、c、y和w135群腦膜炎球菌的感染。與a、c、w135、y群菌株莢膜多糖不同，b群nm菌株的莢膜多糖免疫原性較低，并且menb莢膜多糖的結(jié)構(gòu)與正在發(fā)育的神經(jīng)組織及少數(shù)成熟組織中的神經(jīng)細(xì)胞黏附分子同源，免疫接種易產(chǎn)生自身免疫。因此，b群nm的莢膜多糖不能用作疫苗的抗原成份。b群疫苗的研究目前主要集中在非莢膜抗原，如蛋白、脂多糖(1ipopolysaccharide，los)等。篩選非莢膜表面抗原的主要挑戰(zhàn)是其安全性、抗原保守性及能引發(fā)廣泛有效的殺菌力反應(yīng)。能作為候選疫苗的具有免疫原性的蛋白質(zhì)需具備以下特點(diǎn)：在大多數(shù)菌株中都表達(dá)且結(jié)構(gòu)保守；可誘生殺菌抗體或保護(hù)性抗體。目前在蛋白質(zhì)疫苗的研究方面取得了一定進(jìn)展，諾華公司應(yīng)用反向疫苗學(xué)研制的4cmenb疫苗已通過(guò)ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)。在研熱點(diǎn)候選抗原有pora，nhha、gna2132、nada和fhbp等，其中fhbp是最有前途的候選蛋白質(zhì)之一。

fhbp為因子h結(jié)合蛋白(factorh-bindingprotein，fhbp)，又稱為脂蛋白2086，幾乎表達(dá)于所有腦膜炎奈瑟菌表面，由255個(gè)氨基酸殘基組成，分子量29000。因子h是補(bǔ)體替代途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，它在因子i介導(dǎo)的c3b裂解為滅活片段ic3b過(guò)程中發(fā)揮輔助因子作用。也促進(jìn)替代途徑c3轉(zhuǎn)化酶c3bbb的衰變。fhbp和因子h結(jié)合可下調(diào)替代途徑，從而有利于腦膜炎奈瑟菌生存。fhbp對(duì)于腦膜炎球菌在人類的血液、血清和抗菌性多肽存在的情況下的生存是極為重要的。其氨基酸序列較保守，變種內(nèi)91.6％-100％氨基酸相同。重組fhbp抗體可引起針對(duì)同一類變種的補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌作用和誘導(dǎo)感染乳鼠模型的被動(dòng)保護(hù)。由完整fhbp獲得的抗體不僅滴度高，且對(duì)順序變異不敏感，即使有少量氨基酸改變，只要決定空間構(gòu)象的關(guān)鍵氨基酸不變，抗體殺菌活性變化不大。所有這些特點(diǎn)使fhbp成為腦膜炎奈瑟菌最有效的抗原之一和最有希望的候選通用疫苗。根據(jù)整個(gè)蛋白的抗原交叉反應(yīng)性和序列相似性，腦膜炎球菌fhbp可以被分為3個(gè)抗原變體組。通常，針對(duì)變體v1的fhbp(也被稱為亞家族b)制備的抗體對(duì)來(lái)自變體v1表達(dá)fhbp的菌株具有殺菌活性，但不針對(duì)變體v2和v3(也稱為亞族a)中表達(dá)fhbp的菌株，反之亦然。在每個(gè)變體組中也存在fhbp的亞變體。最近，fhbp的分子結(jié)構(gòu)已顯示為“模塊化”，fhbp變體含有五個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的不同組合(va～ve)，每個(gè)可變區(qū)段衍生自亞族a和亞族b。因此，通過(guò)基因工程手段自由組合五個(gè)結(jié)構(gòu)域可以得到覆蓋a、b兩個(gè)亞族三種變體的抗原的重組δfhbp蛋白，成為廣譜的疫苗抗原及蛋白載體。

但是，單獨(dú)使用fhbp蛋白也有一定的缺陷，因?yàn)樵谟行﹎enb菌株中fhbp蛋白表達(dá)水平較低，只有fhbp的抗原的疫苗不可能足以用于廣泛的免疫腦膜炎球菌的感染，融合表達(dá)多種抗原不失為一個(gè)良好的選擇。在研的一種純蛋白疫苗(lp2086)中含有三種組分，其中兩個(gè)組分是融合蛋白(gna2091與fhbp融合，gna2132與gna1030融合)，第三個(gè)組分是重組nada。5種抗原負(fù)染應(yīng)用可以引起小鼠中的大多數(shù)血清殺菌應(yīng)答，起到良好的保護(hù)。其中，gna2091、gna2132和gna1030均為未知功能蛋白組分，而nada為奈瑟氏菌粘附素a，在體外結(jié)合上皮細(xì)胞的粘附素/侵襲素。該抗原在menb菌株中是非常保守的(>96％氨基酸同一性)，但是不存在于某些遺傳譜系的菌株中，僅有50％的menb致病菌株表達(dá)nada蛋白，但這50％都是高致病菌。融合表達(dá)δfhbp蛋白和nada蛋白，無(wú)疑能提高其抗原性，并以此抗原為蛋白載體，結(jié)合a、c、y和w135群腦膜炎球菌的莢膜多糖，理論上該多價(jià)綴合疫苗可預(yù)防a、b、c、y和w135五個(gè)亞群致病菌的感染，從而預(yù)防絕大部分nm感染導(dǎo)致的流行性腦脊髓膜炎。

四、肺炎球菌的危害及其流行病學(xué)研究

由肺炎球菌所引起的感染是全世界肺炎發(fā)病率和死亡率的主要起因，已成為全球一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。肺炎球菌已成為全球兒童的頭號(hào)殺手。我國(guó)肺炎的病死率為16.4％，其中50歲以上中老年人及1歲以下嬰幼兒分別高達(dá)28.6％和22.0％。根據(jù)莢膜多糖免疫原性的不同，spn可分為93種血清型，但多數(shù)血清型很少引起疾病，世界范圍內(nèi)至少70％-75％的侵襲性肺炎是由13種常見的血清型引起的，而我國(guó)的統(tǒng)計(jì)資料顯示肺炎球菌感染菌株前幾個(gè)血清型依次為：5、6、19、23、14、2、4型，spn疫苗是預(yù)防其感染的重要手段。中國(guó)生物技術(shù)集團(tuán)成都生物制品研究所生產(chǎn)的23價(jià)肺炎球菌疫苗是選取了23種最常見的致病菌(1，2，3，4，5，6b，7f，8，9n，9v，10a，11a，12f，14，15b，17f，18c，19a，19f，20，22f，23f，33f)，分別發(fā)酵培養(yǎng)并分離提純肺炎球菌莢膜上的各型多糖，按等比例混合制成疫苗。臨床使用證明，莢膜多糖制作的疫苗明確有效，并在多個(gè)國(guó)家廣泛使用。但是這類多糖疫苗存在產(chǎn)生的抗體親和力低、對(duì)侵入型肺炎球菌保護(hù)率只有50％-70％、只產(chǎn)生短暫免疫，不具備免疫記憶、對(duì)2歲以下嬰幼兒無(wú)保護(hù)作用等諸多問(wèn)題。最主要的原因是單純的多糖抗原不能激活t細(xì)胞，無(wú)法誘導(dǎo)免疫記憶效應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要是igm和igg2，不能夠有效地激活補(bǔ)體系統(tǒng)。

因此，肺炎球菌的多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗應(yīng)運(yùn)而生。通過(guò)多年的技術(shù)發(fā)展，2000年，美國(guó)惠氏(wyeth)公司成功開發(fā)并上市了7價(jià)肺炎球菌多糖-crm197綴合疫苗，是由7個(gè)不同的肺炎球菌血清型多糖分別共價(jià)鍵連接到crm197蛋白載體上，混合配制而成的一種多價(jià)疫苗，用以預(yù)防小兒肺炎，所述7個(gè)血清型肺炎球菌涵蓋了北美和歐洲90％以上流行的肺炎球菌不同血清型菌株。同年，美國(guó)輝瑞公司第一個(gè)7(4、6b、9v、14、18c、19f和23f)價(jià)肺炎球菌蛋白綴合疫苗上市，目前，輝瑞公司正在中國(guó)注冊(cè)13價(jià)綴合疫苗，增加了6個(gè)血清型(1，3，5，7f，6a，19a)。但是我國(guó)的流行病學(xué)顯示肺炎球菌感染菌株血清型依次為：5、6、1、19、23、14、2、4型，輝瑞7價(jià)肺炎球菌綴合疫苗對(duì)我國(guó)常見致病菌型覆蓋率只有50％左右，而13價(jià)綴合疫苗的覆蓋率也僅有70％。國(guó)外研發(fā)的綴合疫苗不太適合我國(guó)大范圍的兒童肺炎預(yù)防。

還有一個(gè)不容忽視的問(wèn)題是，隨著不同血清型的增加和同種載體蛋白的重復(fù)使用，使得載體蛋白用量增多，其免疫原性反而降低。臨床試驗(yàn)表明，當(dāng)多價(jià)肺炎綴合疫苗與其他含有與蛋白載體相同組分的單價(jià)疫苗或多聯(lián)疫苗同時(shí)接種時(shí)，比如hib-tt、百白破-hib多糖綴合疫苗-ipv(滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗)-乙肝疫苗(簡(jiǎn)稱6聯(lián)疫苗)，多價(jià)肺炎球菌綴合疫苗中的大部分血清型多糖的免疫原性會(huì)受到抑制，特別是對(duì)用破傷風(fēng)類毒素作為載體的血清型多糖免疫原性影響尤其明顯。原因是多價(jià)肺炎球菌綴合疫苗中作為載體的破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素總濃度過(guò)高，在同時(shí)接種含有百白破組分的聯(lián)合疫苗時(shí)，會(huì)造成載體受體競(jìng)爭(zhēng)性抑制效應(yīng)，降低了綴合疫苗多糖部分的免疫原性。在現(xiàn)有上市的五種載體蛋白(crm197、tt、omp、dt和hid)大量使用的情況下，開發(fā)新的載體蛋白迫在眉睫。在此基礎(chǔ)上開發(fā)適合中國(guó)流行病學(xué)的23價(jià)多糖-蛋白綴合疫苗，具有重大的意義和社會(huì)價(jià)值，保護(hù)我國(guó)嬰幼兒免受spn侵染引起的肺炎。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種重組δfhbp-nada融合蛋白，該融合蛋白具有更強(qiáng)的menb菌群免疫原性，能誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)大的血清殺菌應(yīng)答。同時(shí)，以δfhbp-nada為蛋白載體，提供了一種能覆蓋a、b、c、y和w135五種菌群的強(qiáng)免疫原性綴合疫苗。

本發(fā)明第一方面提供了一種重組δfhbp-nada融合蛋白載體，包括重組δfhbp、柔性連接肽段和nada，所述重組δfhbp包含fhbp可變體v1的va、vb結(jié)構(gòu)域以及fhbp可變體v3的vc、vd、ve結(jié)構(gòu)域。

所述重組δfhbp的氨基酸序列如序列表seqidno：1所示，其核苷酸編碼序列如序列表seqidno：2所示。

所述柔性連接肽段的核苷酸編碼序列如序列表seqidno：3所示。

所述重組δfhbp-nada融合蛋白載體的氨基酸序列如序列表seqidno：4所示，其核苷酸編碼序列如序列表seqidno：5所示。

本發(fā)明第二方面提供了上述重組δfhbp-nada融合蛋白載體的制備方法，步驟包括：

s1、設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增得到fhbpv1基因片段、fhbpv3基因片段，再以這兩段基因片段為模板進(jìn)行搭橋pcr擴(kuò)增得到重組的δfhbp全長(zhǎng)片段，回收δfhbp基因片段和pet載體，制備重組質(zhì)粒pet-δfhbp；

s2、設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到nada蛋白的全長(zhǎng)cds序列，回收nada基因片段和重組質(zhì)粒pet-δfhbp，制備重組質(zhì)粒pet-δfhbp-nada；

s3、將重組質(zhì)粒pet-δfhbp-nada轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，得到重組δfhbp-nada融合蛋白載體。

本發(fā)明第三方面提供了上述重組δfhbp-nada融合蛋白載體在制備多糖-蛋白綴合疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明第四方面提供了一種多價(jià)腦膜炎球菌綴合疫苗，該綴合疫苗中，a群、c群、y群和w135群腦膜炎球菌莢膜多糖與重組δfhbp-nada融合蛋白載體綴合。

本發(fā)明第五方面提供了一種多價(jià)肺炎球菌綴合疫苗，該綴合疫苗中，肺炎球菌莢膜多糖與重組δfhbp-nada融合蛋白載體綴合。

本發(fā)明的有益效果是：1、針對(duì)b群腦膜炎球菌莢膜多糖成份不適合用作疫苗，利用反向遺傳學(xué)的技術(shù)，表達(dá)b群腦膜炎球菌人h因子結(jié)合蛋白重組蛋白與奈瑟氏菌粘附素a蛋白的融合產(chǎn)物δfhbp-nada。該融合蛋白的δfhbp含有fhbpa亞族和fhbpb亞族(v1～v3三種變體)的保守結(jié)構(gòu)域，能夠覆蓋所有表達(dá)fhbp蛋白的nmb群菌株，并且，δfhbp包含fhbp完整的va～ve五個(gè)結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)、功能和抗原位點(diǎn)保持了完整性；同時(shí)，該融合蛋白的nada在50％的nmb群菌株中表達(dá)，且這些菌株基本為高致病菌。因此即使不表達(dá)fhbp但表達(dá)nada的菌株也能被δfhbp-nada蛋白覆蓋，以此重組蛋白為抗原制成的蛋白疫苗能廣譜保護(hù)幾乎所有nmb群致病菌的感染。

2、重組δfhbp-nada是一種全新的可用于綴合疫苗的載體蛋白，不同于現(xiàn)有綴合疫苗工藝中常用蛋白載體(crm197、tt、omp、dt、hid)，因而不會(huì)因同種蛋白載體接種過(guò)多導(dǎo)致綴合疫苗的免疫原性下降。

3、δfhbp-nada中的δfhbp和nada組分雖然是nm生存和致病的重要因子，但其本身無(wú)毒性，從而在工業(yè)生產(chǎn)中不需要對(duì)該活性蛋白進(jìn)行脫毒處理，不會(huì)改變其結(jié)構(gòu)和抗原活性位點(diǎn)，從而獲得更佳的免疫效果。

4、δfhbp-nada通過(guò)設(shè)計(jì)軟性連接肽鏈將兩個(gè)活性蛋白融合表達(dá)，再保持各自的活性的同時(shí)讓兩者成為單一的蛋白質(zhì)，因而在工業(yè)生產(chǎn)及免疫接種是更具有可控性，風(fēng)險(xiǎn)大大降低，又能提供更多的多糖-蛋白結(jié)合位點(diǎn)。

5、本發(fā)明提供的以重組δfhbp-nada為蛋白載體的新型多價(jià)腦膜炎球菌綴合疫苗具有廣譜的免疫效果，其免疫小鼠血清能與a、b、c、y和w135五個(gè)群的模式菌株產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)能夠覆蓋b群中表達(dá)fhbp(3中變體)以及不表達(dá)fhbp但表達(dá)nada的高致病菌，并在殺菌檢測(cè)中表現(xiàn)出廣譜且極強(qiáng)的殺菌效果。

6、本發(fā)明提供的以重組δfhbp-nada為蛋白載體的新型23價(jià)肺炎球菌綴合疫苗具有廣譜的免疫效果，其免疫小鼠血清能與1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、33f血清型spn菌株多糖抗原產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)能夠覆蓋中國(guó)流行的血清型1、3、4、5、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f、23f、33f菌株，并在殺菌檢測(cè)中表現(xiàn)出廣譜且極強(qiáng)的殺菌效果，此類多糖-蛋白綴合疫苗更適合我國(guó)人群使用。

7、本發(fā)明提供的以重組δfhbp-nada為蛋白載體的新型綴合疫苗具有多糖-蛋白綴合疫苗的通用優(yōu)勢(shì)：免疫后能激活t細(xì)胞效應(yīng)，產(chǎn)生免疫記憶，從而真正保護(hù)2歲以下的嬰兒。

8、本發(fā)明應(yīng)用cdap活化多糖后衍化結(jié)合的工藝制備多價(jià)莢膜多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗。不僅消除了常規(guī)方法中溴化氰的毒性，且活化效能明顯提高。

附圖說(shuō)明

圖1為fhbpv1～v3可變體結(jié)構(gòu)域及重組δfhbp結(jié)構(gòu)域。

圖2為δfhbp擴(kuò)增電泳圖譜與pet-δfhbp鑒定電泳圖譜。

圖3為nada擴(kuò)增電泳圖譜與pet-δfhbp-nada鑒定電泳圖譜。

圖4為iptg誘導(dǎo)重組菌表達(dá)δfhbp和δfhbp-nada蛋白。

圖5為western-blot鑒定δfhbp和δfhbp-nada重組蛋白。

圖6為sds-page鑒定純化后的δfhbp和δfhbp-nada重組蛋白。

圖7為sds-page鑒定大規(guī)模純化后的δfhbp-nada重組蛋白。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種δfhbp-nada蛋白載體及基于δfhbp-nada蛋白載體的多價(jià)腦膜炎球菌和肺炎球菌綴合疫苗予以進(jìn)一步說(shuō)明。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市場(chǎng)購(gòu)買得到。

一、δfhbp和δfhbp-nada重組蛋白的克隆和原核表達(dá)

1、pet-δfhbp和pet-δfhbp-nada重組質(zhì)粒的構(gòu)建

fhbp是一種膜表面脂蛋白，許多腦膜炎球菌的菌株都帶有其基因，也發(fā)現(xiàn)不攜帶該基因的菌株。根據(jù)整個(gè)蛋白的抗原交叉反應(yīng)性和序列相似性，腦膜炎球菌fhbp可以被分為3個(gè)抗原變體組v1～v3。通常，針對(duì)變體v1的fhbp(也被稱為亞家族b)制備的抗體對(duì)來(lái)自變體v1表達(dá)fhbp的菌株具有殺菌活性，但不針對(duì)變體v2和v3(也稱為亞族a)中表達(dá)fhbp的菌株，反之亦然。fhbp的蛋白分子含有五個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的不同組合(va～ve)，每個(gè)可變區(qū)段衍生自亞族a和亞族b。我們根據(jù)其結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了δfhbp的結(jié)構(gòu)(如圖1所示)，其包含v1的a、b結(jié)構(gòu)域(b結(jié)構(gòu)域上含有v1的抗原表位)，以及v3的c、d、e結(jié)構(gòu)域(c、d、e結(jié)構(gòu)域含有v2和v3的抗原表位，且其174-216位氨基酸高度保守，只有個(gè)別氨基酸的差異)，理論上，重組的δfhbp能覆蓋所有野生型fhbp3個(gè)變體的抗原位點(diǎn)，具有廣譜抗菌的潛力。

根據(jù)genebank登錄的fhbpv1和fhbpv3全長(zhǎng)cds序列，我們?cè)O(shè)計(jì)如下2對(duì)引物：引物在p1和p4位置分別引入bamhⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)。

p1：ggattcatgaaccgaactgccttctgctgcc

p2：gccgggcagttggttgaaggcggta

p3：acggcattcggttcagacgatgcca

p4：aagcttttactgcttggcggcaagaccgata

分別以表達(dá)fhbpv1和v3的兩株menb群菌為模板(購(gòu)自美國(guó)atcc)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。其中p1，p2可擴(kuò)增fhbpv1的a、b結(jié)構(gòu)域基因片段，p3和p4可擴(kuò)增v3的c、d、e結(jié)構(gòu)域基因片段。再以這兩段基因片段為模板，p1，p4為引物，進(jìn)行搭橋pcr，可擴(kuò)增得到重組的δfhbp全長(zhǎng)片段。用bamhi和hindⅲ雙酶切目的基因(pcr產(chǎn)物)和原核表達(dá)載體pet32a(+)，凝膠回收盒回收δfhbp基因片段和線性pet32a載體。膠回收后，用dna連接酶，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5a菌株，單克隆擴(kuò)增，小提質(zhì)粒后，bamhi和hindⅲ雙酶切鑒定的約800bp條帶，在卡那霉素抗性下篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒pet-δfhbp，pcr擴(kuò)增電泳圖譜與鑒定正確電泳圖譜如圖2所示。將鑒定正確的重組質(zhì)粒以15％甘油菌形式-70℃保存，并測(cè)序鑒定正確，其δfhbp的氨基酸序列如序列表seqidno：1所示，其核苷酸編碼序列如序列表seqidno：2(826bp)所示。

seqidno：2(826bp)：

atgaaccgaactgccttctgctgccttttcctgaccaccgccctgattctgaccgcctgcagcagcggaggcggcggaagcggaagcggcggtgtcgccgccgacatcggcacggggcttgccgatgcactaactacgccgctcgaccataaagacaaaggtttgaaatctctgacattggaagactccattccccaaaacggaacactaaccctgtcggcacaaggtgcggaaaaaactttcaaagccggcgacaaagacaacagcctcaacacgggcaaactgaagaacgacaaaatcagccgcttcgacttcgtgcaaaaaatcgaagtggacggacaaaccatcacgctggcaagcggcgaatttcaaatatacaaacaggaccactccgccgtcgttgccctacagattgaaaaaatcaacaaccccgacaaaatcgacagcctgataaaccaacgctccttccttgtcagcggtttgggcggagaacataccgccttcaaccaactgcccggcacggcattcggttcagacgatgccagtggaaaactgacctacaccatagatttcgccgccaagcagggacacggcaaaatcgaacatttgaaatcgccagaactcaatgttgacctggccgcctccgatatcaagccggataaaaaacgccatgccgtcatcagcggttccgtcctttacaaccaagccgagaaaggcagttactctctaggcatctttggcgggcaagcccaggaagttgccggcagcgcagaagtggaaaccgcaaacggcatacgccatatcggtcttgccgccaagcagtaa

其氨基酸序列為seqidno：1：

mnrtafcclflttaliltacssggggsgsggvaadigtgladalttpldhkdkglksltledsipqngtltlsaqgaektfkagdkdnslntgklkndkisrfdfvqkievdgqtitlasgefqiykqdhsavvalqiekinnpdkidslinqrsflvsglggehtafnqlpgtafgsddasgkltytidfaakqghgkiehlkspelnvdlaasdikpdkkrhavisgsvlynqaekgsyslgifggqaqevagsaevetangirhiglaakq

但單獨(dú)使用δfhbp蛋白也有一定的缺陷，因?yàn)樵谟行﹎enb菌株中fhbp蛋白表達(dá)水平較低，只有δfhbp抗原的疫苗不可能足以用于廣泛的免疫腦膜炎球菌的感染。奈瑟氏菌粘附素a(nada)，在體外結(jié)合上皮細(xì)胞的粘附素/侵襲素。該抗原在menb菌株中是非常保守的(>96％氨基酸同一性)，不存在于某些遺傳譜系的菌株中，僅有50％的menb致病菌株表達(dá)nada蛋白，但這50％都是高致病菌。融合表達(dá)δfhbp蛋白和nada蛋白，無(wú)疑能提高其抗原性，但兩個(gè)蛋白之間要加上柔性的鏈接肽段，最為經(jīng)典的即為huston設(shè)計(jì)合成的(ggggs)3序列，有利于兩個(gè)蛋白能夠正確折疊，從而不影響其各自的免疫原型。根據(jù)genebank登錄的nada全長(zhǎng)cds序列，設(shè)計(jì)引物：引物p5和p6分別引入hindⅲ和xhoⅰ酶切位點(diǎn)，同時(shí)p5的酶切位點(diǎn)后設(shè)計(jì)表達(dá)(ggggs)3連接蛋白的序列。

p5：aagcttggcggcggcggcagtggcggcggcggcagtggcggcggcggcagtatgaaacactttccatccaaagtac(seqidno：3)

p6：ctcgagttaccactcgtaattgacgccgaca

以表達(dá)nada的menb群菌為模板(購(gòu)自美國(guó)atcc)，p5，p6為引物，擴(kuò)增得到nada蛋白的全長(zhǎng)cds序列，用hindⅲ和xhoⅰ雙酶切目的基因(nada產(chǎn)物)和重組質(zhì)粒pet-δfhbp，凝膠回收盒回收nada基因片段和線性pet-δfhbp載體。膠回收后，用dna連接酶，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5a菌株，單克隆擴(kuò)增，小提質(zhì)粒后，bamhi和xhoⅰ雙酶切鑒定的約1900bp條帶，在卡那霉素抗性下篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒pet-δfhbp-nada，pcr擴(kuò)增電泳圖譜與鑒定正確電泳圖譜如圖3所示。將鑒定正確的重組質(zhì)粒以15％甘油菌形式-70℃保存，并測(cè)序鑒定正確，重組δfhbp-nada融合蛋白載體的氨基酸序列如序列表seqidno：4所示，其核苷酸編碼序列如序列表seqidno：5(1089bp)所示。

seqidno：5(1089bp)：

atgaaccgaactgccttctgctgccttttcctgaccaccgccctgattctgaccgcctgcagcagcggaggcggcggaagcggaagcggcggtgtcgccgccgacatcggcacggggcttgccgatgcactaactacgccgctcgaccataaagacaaaggtttgaaatctctgacattggaagactccattccccaaaacggaacactaaccctgtcggcacaaggtgcggaaaaaactttcaaagccggcgacaaagacaacagcctcaacacgggcaaactgaagaacgacaaaatcagccgcttcgacttcgtgcaaaaaatcgaagtggacggacaaaccatcacgctggcaagcggcgaatttcaaatatacaaacaggaccactccgccgtcgttgccctacagattgaaaaaatcaacaaccccgacaaaatcgacagcctgataaaccaacgctccttccttgtcagcggtttgggcggagaacataccgccttcaaccaactgcccggcacggcattcggttcagacgatgccagtggaaaactgacctacaccatagatttcgccgccaagcagggacacggcaaaatcgaacatttgaaatcgccagaactcaatgttgacctggccgcctccgatatcaagccggataaaaaacgccatgccgtcatcagcggttccgtcctttacaaccaagccgagaaaggcagttactctctaggcatctttggcgggcaagcccaggaagttgccggcagcgcagaagtggaaaccgcaaacggcatacgccatatcggtcttgccgccaagcagtaaggcggcggcggcagtggcggcggcggcagtggcggcggcggcagtatgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcgcactggcagccacaagcgacgacgatgttaaaaaagctgccactgtggccattgttgctgcctacaacaatggccaagaaatcaacggtttcaaagctggagagaccatctacgacattggtgaagacggcacaattacccaaaaagacgcaactgcagccgatgttgaagccgacgactttaaaggtctgggtctgaaaaaagtcgtgactaacctgaccaaaaccgtcaatgaaaacaaacaaaacgtcgatgccaaagtaaaagctgcagaatctgaaatagaaaagttaacaaccaagttagcagacactgatgccgctttagcagatactgatgccgctctggatgaaaccaccaacgccttgaataaattgggagaaaatataacgacatttgctgaagagactaagacaaatatcgtaaaaattgatgaaaaattagaagccgtggctgataccgtcgacaagcatgccgaagcattcaacgatatcgccgattcattggatgaaaccaacactaaggcagacgaagccgtcaaaaccgccaatgaagccaaacagacggccgaagaaaccaaacaaaacgtcgatgccaaagtaaaagctgcagaaactgcagcaggcaaagccgaagctgccgctggcacagctaatactgcagccgacaaggccgaagctgtcgctgcaaaagttaccgacatcaaagctgatatcgctacgaacaaagctgatattgctaaaaactcagcacgcatcgacagcttggacaaaaacgtagctaatctgcgcaaagaaacccgccaaggccttgcagaacaagccgcgctctccggcctgttccaaccttacaacgtgggtcggttcaatgtaacggctgcagtcggcggctacaaatccgaatcggcagtcgccatcggtaccggcttccgctttaccgaaaactttgccgccaaagcaggcgtggcagtcggcacttcgtccggttcttccgcagcctaccatgtcggcgtcaattacgagtggtaa

其氨基酸序列為seqidno：4：

mnrtafcclflttaliltacssggggsgsggvaadigtgladalttpldhkdkglksltledsipqngtltlsaqgaektfkagdkdnslntgklkndkisrfdfvqkievdgqtitlasgefqiykqdhsavvalqiekinnpdkidslinqrsflvsglggehtafnqlpgtafgsddasgkltytidfaakqghgkiehlkspelnvdlaasdikpdkkrhavisgsvlynqaekgsyslgifggqaqevagsaevetangirhiglaakqggggsggggsggggsmkhfpskvlttailatfcsgalaatsdddvkkaatvaivaaynngqeingfkagetiydigedgtitqkdataadveaddfkglglkkvvtnltktvnenkqnvdakvkaaeseieklttkladtdaaladtdaaldettnalnklgenittfaeetktnivkidekleavadtvdkhaeafndiadsldetntkadeavktaneakqtaeetkqnvdakvkaaetaagkaeaaagtantaadkaeavaakvtdikadiatnkadiaknsaridsldknvanlrketrqglaeqaalsglfqpynvgrfnvtaavggyksesavaigtgfrftenfaakagvavgtssgssaayhvgvnyew

2、δfhbp和δfhbp-nada重組蛋白的原核表達(dá)及鑒定

將重組質(zhì)粒pet-δfhbp和pet-δfhbp-nada轉(zhuǎn)化e.colibl21(de3)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)(含50μg/ml卡納青霉素)，得到δfhbp/bl21(de3)和δfhbp-nada/bl21(de3)表達(dá)菌，挑取單克隆，37℃振蕩培養(yǎng)至菌密度達(dá)od600約0.5～1.0，加入終濃度0.5mm的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，37℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)2-6小時(shí)，經(jīng)sds-page鑒定，結(jié)果如圖4顯示，δfhbp/bl21(de3)和δfhbp-nada/bl21(de3)誘導(dǎo)后有明顯的表達(dá)條帶，分子量分別為30kd和72kd。經(jīng)western-blot鑒定為δfhbp和δfhbp-nada重組蛋白，如圖5所示：1，3泳道為δfhbp/bl21(de3)誘導(dǎo)表達(dá)物，2，4泳道為δfhbp-nada/bl21(de3)誘導(dǎo)表達(dá)物，1，2用fhbp單抗檢測(cè)，分別有30kd和72kd的預(yù)期條帶，3，4用nada單抗檢測(cè)，只有4泳道有72kd條帶，結(jié)果符合預(yù)期。最后兩個(gè)重組蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定，確定為δfhbp和δfhbp-nada重組蛋白。

二、δfhbp和δfhbp-nada重組蛋白的小規(guī)模純化及其免疫效果評(píng)價(jià)

將δfhbp/bl21(de3)和δfhbp-nada/bl21(de3)接種lb(含50μg/ml卡納霉素)液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)12小時(shí)，以1％接種比例擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃、200rpm培養(yǎng)3-6小時(shí)后，od600至16～20，iptg(0.5mm)誘導(dǎo)4小時(shí)。離心機(jī)離心收集菌體。超聲破菌，之前的sds-page顯示，重組蛋白表達(dá)以包涵體的形式(圖3)。先后用te+300mmnacl，te+1％triton-100洗滌包涵體后，8000rpm離心20min獲得包涵體，洗滌后，溶解于3mol/lurea，20mmol/ltris-cl，1mmol/ledta，ph4.0溶液中，經(jīng)cm柱離子交換層析純化，可得到與目標(biāo)蛋白大小相符的兩個(gè)目的蛋白。最后待重組蛋白稀釋復(fù)性至24h后，超濾器低溫快速濃縮至原體積的1.2倍，過(guò)陰離子交換柱qsepharosef.f，收集目的蛋白峰，檢測(cè)方法同圖4與圖5，凝膠檢測(cè)蛋白含量達(dá)到95.3％以上，純化效果如圖6所示，wb檢測(cè)確為目的蛋白。用pbs(ph7.4)透析除鹽后，bca法測(cè)蛋白濃度含量約0.5mg/ml。

小鼠免疫：分別用純化后的δfhbp和δfhbp-nada重組蛋白皮下免疫6周齡spf級(jí)nih小鼠10只，免疫劑量為每次純化后的δfhbp或δfhbp-nada重組蛋白50ug/只(溶解于0.2ml生理鹽水中)，免疫程序?yàn)?，2，4周，免疫結(jié)束后2周采血，離心收集血清；另設(shè)10只小鼠對(duì)照，相同方法注射生理鹽水。收集好的血清e(cuò)lisa法測(cè)血清抗體的滴度，具體方法如下：采用純化后的δfhbp或δfhbp-nada重組蛋白，分別以適宜劑量包被酶標(biāo)板，37℃孵育過(guò)夜，洗板后加入系列稀釋的待測(cè)小鼠血清，37℃孵育后洗板，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠igg二抗顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定，讀取492nm(630nm為參比波長(zhǎng))吸光度值(a值)。陰性對(duì)照組血清a均值+3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差為cutoff值，待測(cè)血清a值大于cutoff值判為陽(yáng)性，以a值大于cutoff值的最大稀釋度計(jì)算各型別小鼠的幾何平均滴度，即為小鼠血清igg抗體效價(jià)(表1)。兩種重組蛋白免疫小鼠后均產(chǎn)生了高低度的血清抗體。

表1.各組抗原三次免疫小鼠后血清抗體的滴度測(cè)定(幾何平均值)

兩種重組蛋白免疫效果的評(píng)價(jià)，采取兩種方法，一為全菌體包被測(cè)定全細(xì)胞elisa，另一為流行株的殺菌力實(shí)驗(yàn)。全菌體包被選擇menb群菌株mc58(高表達(dá)fhbpv1可變體)、8047(高表達(dá)fhbpv2可變體)、m1239高表達(dá)fhbpv3可變體)，961-5945(中量表達(dá)fhbp蛋白)和67/00(低量表達(dá)fhbp蛋白)，將這些菌株擴(kuò)大培養(yǎng)增殖后，刮取細(xì)菌菌苔，以生理鹽水溶解，甲醛殺菌后，稀釋為2×10⁸個(gè)/ml，以此濃度包被96孔酶標(biāo)板，100ul/孔，4℃包被過(guò)夜，洗板后，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。同樣，培養(yǎng)menb群菌株mc58(高表達(dá)fhbpv1可變體)、8047(高表達(dá)fhbpv2可變體)、m1239高表達(dá)fhbpv3可變體)，961-5945(中量表達(dá)fhbp蛋白)和67/00(低量表達(dá)fhbp蛋白)后用相應(yīng)血清抗體進(jìn)行殺菌檢測(cè)，測(cè)定并計(jì)算殺菌抗體滴度(與補(bǔ)體陰性對(duì)照孔相比，50％以上殺菌率的血清最高稀釋度為血清抗體殺菌滴度)，結(jié)果見表3。

表2.各menb菌株全細(xì)胞elisa

表3.各menb菌株殺菌力實(shí)驗(yàn):bc50titer(1：)

備注：殺菌力實(shí)驗(yàn)以大于1：8為具有保護(hù)性。

由表2和表3的結(jié)果綜合分析可得，δfhbp蛋白疫苗能夠有效免疫所有表達(dá)fhbp(v1、v3和v2變體)的menb菌株的侵染，但對(duì)低表達(dá)甚至不表達(dá)fhbp的menb菌株失去保護(hù)能力；而δfhbp-nada蛋白疫苗在免疫所有表達(dá)fhbp(v1、v3和v2變體)的menb菌株的侵染的基礎(chǔ)上，同時(shí)能對(duì)低表達(dá)甚至不表達(dá)fhbp的menb菌株依然具有保護(hù)作用。同時(shí)，δfhbp-nada蛋白疫苗能夠產(chǎn)生更高的抗體效價(jià)并具有更強(qiáng)的殺菌能力，說(shuō)明兩種特異性蛋白的融合表達(dá)能夠起到協(xié)同促進(jìn)免疫反應(yīng)的作用，并能提供更為廣譜的疫苗保護(hù)功能。因此，我們的后續(xù)工藝選擇δfhbp-nada重組蛋白作為新型多價(jià)腦膜炎球菌及肺炎球菌綴合疫苗的蛋白載體。

三、工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)及大規(guī)模抗原蛋白濃縮純化

將上述鑒定正確的δfhbp-nada/bl21(de3)重組菌株按照藥典的要求制成原始種子庫(kù)和工作種子庫(kù)。工藝流程如下：

1.取工程菌株工作種子庫(kù)菌種，劃種lb瓊脂培養(yǎng)基(含卡納霉素)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落接種至lb液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡納霉素)中，并以1-2％的接種比例逐步擴(kuò)大至發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，待od600達(dá)到16-20時(shí)，采用異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)培養(yǎng)4-8小時(shí)，停止培養(yǎng)，大容量離心機(jī)離心收集菌體。

2.取菌體加入破菌緩沖液(50mmpb，2mmedta，ph7.5)，高壓(800-1000bar)均質(zhì)破菌二遍后，離心(10000rpm，60min，8℃)取上清。采用30-60％硫酸銨分級(jí)沉淀，50mmpbph7.5溶解，50kd超濾5次，并濃縮至原體積的1/5-1/3。

3.采用sepharoseqff層析，平衡液：50mmpbph7.2，洗脫液：50mmpb+1mnaclph7.2。洗脫方法：0-100％梯度洗脫，收集10％的洗脫液。

4.取10％梯度洗脫液經(jīng)50kd超濾膜包超濾濃縮，采用sepharose4ff凝膠過(guò)濾層析，收集v0處蛋白峰，以0.15mol/l氯化鈉、10kd超濾5次以上，并濃縮至蛋白含量為1-2mg/ml，0.22μm除菌過(guò)濾。經(jīng)無(wú)菌檢查、蛋白含量檢查、分子量和純度檢查、蛋白特異性檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查即為δfhbp-nada蛋白原液。

技術(shù)要求為得到純度大于95％的重組δfhbp-nada蛋白原液。細(xì)菌內(nèi)毒素不高于20eu/ml，本發(fā)明應(yīng)不高于10eu/ml，最佳不高于5eu/ml。分子量和純度檢查見圖7，純度為96.3％。蛋白特異性檢測(cè)如圖5所示,wb檢測(cè)為目標(biāo)蛋白。

四、多價(jià)nm多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗的制備和免疫效果評(píng)價(jià)

1.a群、c群、y群和w135群nm菌莢膜多糖的制備

a群腦膜炎球菌采用29201菌株，c群腦膜炎球菌采用29205菌株，y群腦膜炎球菌采用29028菌株，w135群腦膜炎球菌采用29037菌株，腦膜炎球菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，采用沙培離心機(jī)、碟片式離心機(jī)或其他大容量離心機(jī)分離培養(yǎng)液，收集離心上清；將離心上清以100kd膜包超濾濃縮，采用25-80％的乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，收集沉淀并用無(wú)水乙醇及丙酮分別洗滌，得到粗制多糖；滅菌注射用水溶解多糖并經(jīng)脫氧膽酸鈉處理后，采用ge填料captoadhere和captodeae或其他廠家相同功能性質(zhì)的離子交換填料，以串聯(lián)層析或分步層析的方法進(jìn)行粗糖精制，收集流穿峰，采用gesephadexg25coarse對(duì)流穿峰進(jìn)行脫鹽，乙醇沉淀或凍干回收多糖，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.a/c/y/w135群多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗的制備

本行業(yè)常用的方法有兩種，即胺還原法或溴化氰活化法制備多糖蛋白結(jié)合物。胺還原法為將a/c/y/w135群多糖經(jīng)高碘酸鈉避光氧化，再加己二酰肼(adh)和硼氰化鈉制備多糖衍生物，采用超濾方法將adh和硼氰化鈉等去除，然后加入制備好的δfhbp-nada載體蛋白，在碳二亞胺(edac)作用下，形成多糖蛋白結(jié)合物。溴化氰活化法為將a/c/y/w135群腦膜炎球菌多糖經(jīng)溴化氰(cnbr)活化，在活化的糖鏈上連接上己二酰肼，采用超濾的方法將溴化氰、游離的己二酰肼去除，然后加入制備好的δfhbp-nada載體蛋白，在碳二亞胺的連接作用下，多糖蛋白結(jié)合形成多糖蛋白復(fù)合物。

其中，溴化氰具有較強(qiáng)的活化多糖羥基的作用，目前國(guó)內(nèi)上市的a群和a、c群腦膜炎球菌多糖綴合疫苗均采用溴化氰活化多糖的方法制備。但由于使用劇毒化學(xué)試劑溴化氰，制備過(guò)程對(duì)人員和環(huán)境均具有較大的潛在風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)合物產(chǎn)率不高。隨著化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，已成功研制了一種新型水溶性氰化物，即1-氰基-4-二甲基氨基吡啶-四氟化硼(1-cyano-4-dimethylamin-opyridiniumtetrafluoroborate，cdap)。應(yīng)用該試劑不僅消除了溴化氰的毒性，且活化效能明顯提高。有研究者將溴化氰與cdap兩種方法進(jìn)行比較，cdap法的多糖收率可達(dá)35％-40％，而溴化氰僅有5％-20％，且結(jié)合物仍具有良好的免疫原性。

因此，本發(fā)明應(yīng)用cdap活化多糖后衍化結(jié)合的工藝制備多價(jià)莢膜多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗。具體方法為：將a/c/y/w135群腦膜炎球菌多糖溶解至5-15mg/ml，調(diào)節(jié)ph值至10.8左右，在多糖溶液中加入1/10(g/g)的cdap，室溫、維持ph值10.8的堿性環(huán)境下活化多糖8min。按1：1(與活化多糖的體積比)的比例加入0.5mol/l的已二酰肼，室溫反應(yīng)50-70min。50kd膜包超濾去除溴化氰及已二酰肼，得到多糖衍生物。將多糖衍生物與載體蛋白δfhbp-nada以1：1(g/g)的比例混合并攪拌，按碳二亞胺：多糖＝1：10的比例加入碳二亞胺，室溫、酸性環(huán)境(ph5.6)下反應(yīng)60min。經(jīng)100kd超濾膜包超濾去除雜質(zhì)，并濃縮。最后采用gesepharose4ff進(jìn)行凝膠層析純化，收集v0附近的洗脫液。用0.22μm濾膜除菌過(guò)濾，得到a/c/y/w135群腦膜炎球菌多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗原液。

將此原液采用磷酸鋁佐劑攪拌吸附，以0.15mol/l氯化鈉稀釋配制，至多價(jià)多糖蛋白結(jié)合物以多糖含量計(jì)終濃度分別為20μg/ml，鋁含量終濃度為0.45-0.6mg/ml，攪拌均勻，以預(yù)填充注射器分裝，0.5ml/支，制成a/c/y/w135群腦膜炎球菌多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗制劑，2-8℃保存。也可在疫苗原液中加入80mg/ml蔗糖作為賦形劑，每支多糖含量20μg/ml凍干后制成蛋白疫苗制劑，2-8℃保存。

3.a/c/y/w135群多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗效果評(píng)價(jià)

小鼠免疫：分別用a/c/y/w135群多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗蛋白原液、凍干制劑和佐劑吸附制劑皮下免疫6周齡spf級(jí)nih小鼠10只，免疫劑量為每次0.2ml/只，免疫程序?yàn)?，2，4周，免疫結(jié)束后2周采血，離心收集血清；另設(shè)10只小鼠對(duì)照，相同方法注射生理鹽水。收集好的血清e(cuò)lisa法測(cè)血清抗體的滴度，具體方法如下：采用純化后的δfhbp-nada重組蛋白，分別以適宜劑量包被酶標(biāo)板，37℃孵育過(guò)夜，洗板后加入系列稀釋的待測(cè)小鼠血清，37℃孵育后洗板，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠igg二抗顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定，讀取492nm(630nm為參比波長(zhǎng))吸光度值(a值)。陰性對(duì)照組血清a均值+3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差為cutoff值，待測(cè)血清a值大于cutoff值判為陽(yáng)性，以a值大于cutoff值的最大稀釋度計(jì)算各型別小鼠的幾何平均滴度，即為小鼠血清igg抗體效價(jià)(表4)。綴合疫苗原液和兩種劑型免疫小鼠后均產(chǎn)生了高低度的血清抗體。

表4.各組抗原三次免疫小鼠后血清抗體的滴度測(cè)定(幾何平均值)

綴合疫苗各劑型免疫效果的評(píng)價(jià)，同樣采取兩種方法，全菌體包被測(cè)定全細(xì)胞elisa和流行株的殺菌力實(shí)驗(yàn)。全菌體包被選擇a群腦膜炎球菌29201菌株，b群腦膜炎球菌mc58和67/00菌株，c群腦膜炎球菌29205菌株，y群腦膜炎球菌29028菌株，w135群腦膜炎球菌29037菌株，將這些菌株擴(kuò)大培養(yǎng)增殖后，刮取細(xì)菌菌苔，以生理鹽水溶解，甲醛殺菌后，稀釋為2×10⁸個(gè)/ml，以此濃度包被96孔酶標(biāo)板，100ul/孔，4℃包被過(guò)夜，洗板后，用相應(yīng)疫苗血清抗體進(jìn)行elisa檢測(cè)，結(jié)果見表5。

表5.各群腦膜炎球菌菌株全細(xì)胞elisa

同樣，a群腦膜炎球菌29201菌株，b群腦膜炎球菌mc58和67/00菌株，c群腦膜炎球菌29205菌株，y群腦膜炎球菌29028菌株，w135群腦膜炎球菌29037菌株后用相應(yīng)疫苗血清抗體進(jìn)行殺菌檢測(cè)，測(cè)定并計(jì)算殺菌抗體滴度(與補(bǔ)體陰性對(duì)照孔相比，50％以上殺菌率的血清最高稀釋度為血清抗體殺菌滴度)，結(jié)果見表6。

表6.各群腦膜炎球菌菌株殺菌力實(shí)驗(yàn):bc50titer(1：)

備注：殺菌力實(shí)驗(yàn)以大于1：8為具有保護(hù)性。

由以上結(jié)果綜合分析可得，以重組δfhbp-nada為蛋白載體的新型多價(jià)腦膜炎球菌綴合疫苗具有廣譜的免疫效果，其免疫小鼠血清能與a、b、c、y和w135五個(gè)群的模式菌株產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)能夠覆蓋b群中表達(dá)fhbp(3種變體)以及不表達(dá)fhbp但表達(dá)nada的高致病菌，并在殺菌檢測(cè)中表現(xiàn)出廣譜且極強(qiáng)的殺菌效果，從而保護(hù)人們(尤其是嬰幼兒及年老體弱者)免受絕大部分nm致病菌侵害導(dǎo)致的脊髓腦膜炎危害。

五、多價(jià)肺炎球菌-δfhbp-nada綴合疫苗的制備和免疫效果評(píng)價(jià)

重組δfhbp-nada是由生物工程技術(shù)制備得來(lái)，是一種全新的可用于綴合疫苗的載體蛋白，不同于現(xiàn)有綴合疫苗工藝中常用蛋白載體(crm197、tt、omp、dt、hid)，因而不會(huì)因同種蛋白載體接種過(guò)多導(dǎo)致綴合疫苗的免疫原性下降。同時(shí)，δfhbp和nada雖然是nm生存和致病的重要因子，但其本身無(wú)毒性，從而在工業(yè)生產(chǎn)中不需要對(duì)該活性蛋白進(jìn)行脫毒處理，不會(huì)改變其結(jié)構(gòu)和抗原活性位點(diǎn)，從而獲得更佳的免疫效果。再次，δfhbp-nada通過(guò)柔性連接肽鏈將兩個(gè)活性蛋白融合表達(dá)，再保持各自的活性的同時(shí)讓兩者成為單一的蛋白質(zhì)，因而在工業(yè)生產(chǎn)及免疫接種時(shí)更具有可控性，風(fēng)險(xiǎn)大大降低，又能提供更多的多糖-蛋白結(jié)合位點(diǎn)。因而，δfhbp-nada可作為新型優(yōu)質(zhì)的載體蛋白用于其他致病菌(如hib和spn)綴合疫苗的開發(fā)，就像nm的膜蛋白o(hù)mp，hib的菌表面蛋白hid，完全可作為常規(guī)載體蛋白應(yīng)用。本發(fā)明以δfhbp-nada重組蛋白為載體，提供一種能覆蓋23種血清型的強(qiáng)免疫原性肺炎球菌綴合疫苗。δfhbp-nada重組蛋白原液制備如前所述，后續(xù)具體制備方案如下：

1.23種血清型spn菌莢膜多糖的制備

選取23種血清型(1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、33f)的肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)后，采用沙培離心機(jī)、碟片式離心機(jī)或其他大容量離心機(jī)分離培養(yǎng)液，收集離心上清；將離心上清以100kd膜包超濾濃縮，采用25-80％的乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，收集沉淀并用無(wú)水乙醇及丙酮分別洗滌，得到粗制多糖；滅菌注射用水溶解多糖并經(jīng)脫氧膽酸鈉處理后，采用ge填料captoadhere和captodeae或其他廠家相同功能性質(zhì)的離子交換填料，以串聯(lián)層析或分步層析的方法進(jìn)行粗糖精制，收集流穿峰，采gesephadexg25coarse對(duì)流穿峰進(jìn)行脫鹽，乙醇沉淀或凍干回收多糖，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.23價(jià)spn菌多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗的制備

同樣應(yīng)用cdap活化多糖后衍化結(jié)合的工藝制備多價(jià)莢膜多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗。具體方法為：將23種血清型spn菌多糖溶解至5-15mg/ml，調(diào)節(jié)ph值至10.8左右，在多糖溶液中加入1/10(g/g)的cdap，室溫、維持ph值10.8的堿性環(huán)境下活化多糖8min。按1：1(與活化多糖的體積比)的比例加入0.5mol/l的已二酰肼，室溫反應(yīng)50-70min。50kd膜包超濾去除溴化氰及已二酰肼，得到多糖衍生物。將多糖衍生物與載體蛋白δfhbp-nada以1：1(g/g)的比例混合并攪拌，按碳二亞胺：多糖＝1：10的比例加入碳二亞胺，室溫、酸性環(huán)境(ph5.6)下反應(yīng)60min。經(jīng)100kd超濾膜包超濾去除雜質(zhì)，并濃縮。最后采用gesepharose4ff進(jìn)行凝膠層析純化，收集v0附近的洗脫液。用0.22μm濾膜除菌過(guò)濾，得到23價(jià)spn菌多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗原液。

可將此原液采用磷酸鋁佐劑攪拌吸附，以0.15mol/l氯化鈉稀釋配制，至多價(jià)多糖蛋白結(jié)合物以多糖含量計(jì)終濃度分別為20μg/ml，鋁含量終濃度為0.45-0.6mg/ml，攪拌均勻，以預(yù)填充注射器分裝，0.5ml/支，制成23價(jià)spn菌多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗制劑，2-8℃保存。也可在疫苗原液中加入80mg/ml蔗糖作為賦形劑，每支多糖含量20μg/ml凍干后制成蛋白疫苗制劑，2-8℃保存。

3.23價(jià)spn菌多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗效果評(píng)價(jià)

小鼠免疫：23價(jià)spn菌多糖-δfhbp-nada蛋白綴合疫苗蛋白原液、市售23價(jià)陽(yáng)性對(duì)照疫苗制劑皮下免疫6周齡spf級(jí)nih小鼠10只，免疫劑量為每次0.2ml/只，免疫程序?yàn)?，2，4周，免疫結(jié)束后2周采血，離心收集血清；另設(shè)10只小鼠對(duì)照，相同方法注射生理鹽水。收集好的血清e(cuò)lisa法測(cè)血清抗體的滴度，具體方法如下：采用純化后23種各血清型多糖，分別以適宜劑量包被酶標(biāo)板，37℃孵育過(guò)夜，洗板后加入系列稀釋的待測(cè)小鼠血清，37℃孵育后洗板，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠igg二抗顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定，讀取492nm(630nm為參比波長(zhǎng))吸光度值(a值)。陰性對(duì)照組血清a均值+3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差為cutoff值，待測(cè)血清a值大于cutoff值判為陽(yáng)性，以a值大于cutoff值的最大稀釋度計(jì)算各型別小鼠的幾何平均滴度，即為小鼠血清igg抗體效價(jià)(表7)。綴合疫苗蛋白原液和市售23價(jià)陽(yáng)性對(duì)照多糖疫苗免疫小鼠后均產(chǎn)生了高低度的血清抗體，且綴合疫苗蛋白原液產(chǎn)生的滴度更高，說(shuō)明蛋白抗原具有協(xié)同促進(jìn)免疫的功能。

表7.疫苗三次免疫小鼠后各種血清型抗體的滴度測(cè)定(幾何平均值)

綴合疫苗與市售多糖疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)，同樣采取兩種方法，全菌體包被測(cè)定全細(xì)胞elisa和流行株的殺菌力實(shí)驗(yàn)。全菌體包被選擇中國(guó)流行的高致病spn菌株血清型1、3、4、5、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f、23f、33f，將這些菌株擴(kuò)大培養(yǎng)增殖后，刮取細(xì)菌菌苔，以生理鹽水溶解，甲醛殺菌后，稀釋為2×10⁸個(gè)/ml，以此濃度包被96孔酶標(biāo)板，100ul/孔，4℃包被過(guò)夜，洗板后，用相應(yīng)疫苗血清抗體進(jìn)行elisa檢測(cè)，結(jié)果見表8。

表8.各血清型肺炎球菌菌株全細(xì)胞elisa

同樣，高致病spn菌株血清型1、3、4、5、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f、23f、33f培養(yǎng)后用相應(yīng)疫苗血清抗體進(jìn)行殺菌檢測(cè)，測(cè)定并計(jì)算殺菌抗體滴度(與補(bǔ)體陰性對(duì)照孔相比，50％以上殺菌率的血清最高稀釋度為血清抗體殺菌滴度)，結(jié)果見表9。

表9.各血清型肺炎球菌菌株殺菌力實(shí)驗(yàn):bc50titer(1：)

備注：殺菌力實(shí)驗(yàn)以大于1：8為具有保護(hù)性。

由以上結(jié)果綜合分析可得，以重組δfhbp-nada為蛋白載體的新型23價(jià)肺炎球菌綴合疫苗具有廣譜的免疫效果，其免疫小鼠血清能與1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、33f血清型spn菌株多糖抗原產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)能夠覆蓋中國(guó)流行的血清型1、3、4、5、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f、23f、33f菌株，并在殺菌檢測(cè)中表現(xiàn)出廣譜且極強(qiáng)的殺菌效果，從而保護(hù)人們(尤其是嬰幼兒及年老體弱者)免受絕大部分肺炎球菌致病菌侵害導(dǎo)致肺炎，此類多糖-蛋白綴合疫苗更適合我國(guó)人群使用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>武漢博沃生物科技有限公司

<120>重組δfhbp-nada融合蛋白載體及其制備方法和應(yīng)用

<130>2017

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>274

<212>prt

<213>人工合成

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