本發明涉及藥物化學技術領域，尤其涉及一種合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質及其制備方法和應用。

背景技術：

5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸，又名燈盞花乙素、野黃芩苷，是從菊科飛蓬屬植物短亭飛蓬(eriger0nbreviscapus)的全草(又名燈盞細辛)中提取的黃酮類混合物的主要有效成分，分子式為c21h18012，分子量為462.37，其結構式如式ⅳ所示：

臨床研究表明5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸對高血壓、腦出血、腦血栓形成，腦栓塞多發性神經炎，慢性蛛網膜炎及其后遺癥具有較好療效，并對風濕病、冠心病也有一定療效。此外大量的研究證實5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸具有抗炎、抗氧化、蛋白激酶抑制劑作用，還具有對糖尿病、腎病、風濕類風濕等疾病的治療作用。因此，目前5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸臨床上廣泛用于治療腦血栓、腦梗塞、多發性神經炎、慢性蛛網膜等腦血管意外所致癱瘓以及冠心病、心絞痛、治療痛風性關節炎等癥。

目前除了植物提取的合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸，合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸作為改良型創新原料藥，具有良好的市場前景。但是合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸雜質譜不同于目前上市的植物提取5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸，對于合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸的有關物質目前尚無研究。雜質的存在將影響產品使用的安全性，按照新藥開發過程中雜質控制的相關指導原則的要求，應對樣品中雜質進行徹底研究，嚴格控制。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質及其制備方法和應用。

本發明提供的合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質或其鹽，結構如式(ⅰ)所示：

本發明所述的合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸是指通過化學合成的方法制備的5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸。具體制備方法參照昆藥集團申請號分別為cn201210114758.9，cn201210114894.8，pct/cn2012/086543的專利申請。

所述合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸含量大于99％，其中含有微量的合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質，含量低于0.5％。

本發明還提供了上述合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質的制備方法，包括以下步驟：

1)式(ⅱ)所示化合物在催化劑的作用下，進行選擇性消除反應，生成式(ⅲ)所示化合物；所述催化劑為1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯(dbu)、吡啶和4-二甲氨基吡啶(dmap)中的任意一種或幾種；

2)式(ⅲ)所示化合物進行水解反應，得到式(ⅰ)所示化合物；

其反應方程式如下：

本發明首先以1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯(dbu)、吡啶和4-二甲氨基吡啶(dmap)中的任意一種或幾種作為催化劑，式(ⅱ)所示化合物在催化劑的作用下，進行選擇性消除反應，選擇性的脫去一分子水，生成式(ⅲ)所示化合物。上述催化劑有助于提高選擇性消除反應的速率和選擇性。

所述選擇性消除反應優選在溶劑中進行，在本發明的某些具體實施例中，所述溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、甲苯、四氫呋喃和1,4-二氧六環中的任意一種或幾種。

在本發明的某些具體實施例中，所述式(ⅱ)所示化合物與催化劑的摩爾比為1：(0.1～5)，在某些實施例中為1：(0.2～3)，在一些實施例中為1:1。

所述選擇性消除反應的溫度為10～30℃，反應時間為3～20h，在某些實施例中為4～6h，在一些實施例中為8h，在一些實施例中為10h。

優選的，所述步驟2)具體為：式(ⅲ)所示化合物在無機堿催化下進行水解反應，然后加入無機酸調節體系ph值至2～3，進行中和反應，得到式(ⅰ)所示化合物。

在本發明的某些具體實施例中，所述無機堿選自氫氧化鈉、氫氧化鋰、氫氧化鉀、碳酸鉀和碳酸鈉中的任意一種或幾種。

所述無機酸選自鹽酸、硫酸、乙酸、甲酸、硝酸和磷酸中的任意一種或幾種。

所述水解反應的溶劑選自丙酮、水、甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基亞砜、四氫呋喃和二氧六環中的任意一種或幾種。

所述水解反應的溫度優選為-10～40℃，在某些實施例中為-8～0℃，在一些實施例中為-5℃；反應時間優選為1～10h，在某些實施例中為2～4h，在一些實施例中為3h，在一些實施例中為2h，在一些實施例中為4h。

所述式(ⅲ)所示化合物與無機堿的摩爾比優選為1：(0.1～50)，在某些實施例中為1：(10～30)，一些實施例中為1:25，一些實施例中1:15，一些實施例中1:20。

所述中和反應的溫度優選為-10℃～40℃，在一些實施例中為-5℃。

在本發明的某些具體實施例中，可以進一步采用常規方法如重結晶進行提純，得到符合要求純度的雜質對照品。

本發明通過hplc法、uv吸收法、核磁共振、ms譜分析對上述合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質進行了結構驗證。

本發明所述5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質的結構確證包括以下步驟：

步驟1、hplc法證實制備所得5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b與昆藥集團股份有限公司合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中有關物質(雜質)b的保留時間完全一致。

步驟2、uv譜圖證實制備所得5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b與昆藥集團股份有限公司合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中有關物質b特征峰完全一致。

步驟3、核磁共振氫譜、碳譜對制備所得5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b的化學結構進行了確證。

步驟4、經ms譜分析，證實昆藥集團股份有限公司合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中有關物質b，與制備所得5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b，具有相同的分子離子信號。

本發明所述結構確證方法步驟1中，色譜條件流動相和體積比為：流動相a:water/tfa＝1000/1(v/v)，流動相b:acet0nitrile/tfa＝1000/1(v/v)，樣品溶劑:acetonitrile/dmso＝50/50(v/v)。

本發明所述結構確證方法步驟3和步驟4證實了5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸雜質b的化學結構如式ⅰ所示。

本發明還提供了上述合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質或其鹽或上述制備方法制備的合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質，在合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸或其制劑有關物質檢測時，作為對照品的應用。

具體的，可應用于合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸或其制劑的雜質分析控制、藥理毒理研究等。

本發明以5,6,4’-三乙酰氧基黃酮-7-o-d-三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯(結構式如式ⅱ所示)為原料，經選擇性消除和水解兩步反應，成功制備得到5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b，并進一步純化，最終獲得5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b單體，進行確證后得出該有關物質化學結構。該方法合成路線短、成本低、操作簡單，結果準確，產品純度高，反應收率高，產品易于純化，可用于合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸樣品的雜質分析控制，有利于合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸的質量控制，更好的保障了產品質量。

附圖說明

圖1是實施例1制備的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b(批號：20140913)的hplc分析譜圖；

圖2是昆藥集團股份有限公司合成的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批號20140424-1)的hplc分析譜圖；

圖3是實施例1制備的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b(批號20140913)以5％質量分數加入到5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批號20140424-1)的hplc分析譜圖；

圖4是昆藥集團股份有限公司合成的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批號20140424-1)中5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b的uv譜圖；

圖5是實施例1制備的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b(批號20140913)的uv譜圖；

圖6是實施例1制備的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b(批號20140913)的hplc分析譜圖；

圖7是合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批號20140424-1)+實施例1制備的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b(20140913)的ms譜圖；

圖8是實施例1制備的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸雜質b(20140913)的ms譜圖；

圖9是合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批號20140424-1)的ms譜圖。

具體實施方式

為了進一步說明本發明，下面結合實施例對本發明提供的合成5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質(以下簡稱5,6,4＇-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b)及其制備方法和應用進行詳細描述。

實施例1

(1)化合物ⅲ的制備

20g(27.4mmol)5,6,4’-三乙酰氧基黃酮-7-o-d–三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯溶解于200ml甲苯中，然后攪拌下緩慢滴加入1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯(dbu)4.1g(27mmol)，30℃下攪拌反應約8小時反應完全。反應混合物攪拌下加入約500ml乙酸乙酯，用500ml水洗兩次。分出水層后的有機層中加入適量無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干。硅膠柱層析并用石油醚：乙酸乙酯＝5：1(v/v)的洗脫劑洗脫，得15g白色固體化合物ⅲ,色譜純度98.00％以上，收率為82％。

¹h-nmr(400mhz,dms0),δ(ppm):7.95(2h,d,j＝8.6hz),7.51(1h,s),7.32(2h,d,j＝8.6hz),6.78(1h,s),6.15(1h,d,j＝7.8hz),5.57(1h,d,j＝10hz),5.38(1h,m),4.94(1h,m),3.67(3h,s),2.34(3h,s),2.31(3h,s),2.25(3h,s),2.02(3h,s),2.01(3h,s).

(2)5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b的制備

13.4g(20mmol)化合物ⅲ中加入200ml丙酮和200ml水的混合溶劑，在-5℃攪拌下緩慢滴加10％的naoh水溶液200ml，攪拌反應約三小時后，經tlc監測反應已完全。-5℃下緩緩向反應液中滴加2mol/l鹽酸水溶液中和反應液至ph為2～3，持續攪拌一小時并逐漸升至室溫，反應液中漸漸有黃色固體5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸析出。室溫下靜置過夜，過濾，濾餅用適量水和丙酮洗，干燥后用乙醇重結晶得到8g5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b，批號記為20140913，收率為89％。hplc檢測，純度為98.88％，hplc檢測的色譜圖和統計結果見圖1和表1，表1是圖1的數據匯總。

¹h-nmr(400mhz,dms0),δ(ppm):12.78(1h,s),10.51(1h,s),8.71(1h,s),7.93(2h,d,j＝8.8hz),7.11(1h,s),6.94(2h,d,j＝8.8hz),6.83(1h,s),5.99(1h,d,j＝3.6hz),5.81(1h,d,j＝5.6hz),5.74(1h,s),5.28(1h,s),4.14(1h,dd,j＝4.0,4.5hz),3.84(1h,dd,j＝4.5,6.0hz).

表1圖1的數據匯總

實施例2

(1)化合物ⅲ的制備

20g(27.4mmol)5,6,4’-三乙酰氧基黃酮-7-o-d–三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯溶解于200ml二氯甲烷中，然后攪拌下緩慢加入4-二甲氨基吡啶(dmap)1.7g(13.7mmol,0.5eq)，25℃下攪拌反應約10小時反應完全。反應混合物攪拌下加入約300ml乙酸乙酯，用500ml水洗兩次。分出水層后的有機層中加入適量無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干。硅膠柱層析并用石油醚：乙酸乙酯＝5:1(v/v)的洗脫劑洗脫，得14.3g白色固體化合物ⅲ,色譜純度98.00％以上，收率為78％。核磁鑒定結果與實施例1結果一致。

(2)5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b的制備

13.4g(20mmol)化合物ⅲ中加入200ml丙酮和200ml水的混合溶劑，在0℃攪拌下緩慢滴加10％的氫氧化鉀水溶液220ml，攪拌反應約四小時后，經tlc監測反應已完全。0℃下緩緩向反應液中滴加乙酸中和反應液至ph為2～3，持續攪拌一小時并逐漸升至室溫，反應液中漸漸有黃色固體5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b析出。室溫下靜置過夜，過濾，濾餅用適量水和丙酮洗，干燥后用乙醇重結晶得到7.4g5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b，收率為83％。hplc檢測，純度達98.00％以上，核磁鑒定結果與實施例1結果一致。

實施例3

(1)化合物ⅲ的制備

20g(27.4mmol)5,6,4’-三乙酰氧基黃酮-7-o-d–三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯溶解于200ml四氫呋喃中，然后攪拌下滴加入吡啶6.5g(82.2mmol)，25℃下攪拌反應約6小時反應完全。反應混合物攪拌下加入約200ml乙酸乙酯，用500水洗兩次。分出水層后的有機層中加入適量無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干。硅膠柱層析并用石油醚：乙酸乙酯＝5:1(v/v)的洗脫劑洗脫，得14.7g白色固體化合物ⅲ,色譜純度98.00％以上，收率為80％。核磁鑒定結果與實施例1結果一致。

(2)5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b的制備

13.4g(20mmol)化合物ⅲ中加入200ml丙酮和200ml水的混合溶劑，在5℃攪拌下緩慢滴加10％的氫氧化鋰水溶液190ml，攪拌反應約兩小時后，經tlc監測反應已完全。5℃下緩緩向反應液中滴加2mol/l硫酸水溶液中和反應液至ph為2～3，持續攪拌一小時并逐漸升至室溫，反應液中漸漸有黃色固體5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b析出。室溫下靜置過夜，過濾，濾餅用適量水和丙酮洗，干燥后用乙醇重結晶得到7.6g5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b，收率為85％。hplc檢測，純度達98.00％以上，核磁鑒定結果與實施例1結果一致。

實施例4結構確證

1、hplc確證合成制備所得化合物為合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b：

hplc色譜條件如下：

hplc系統：watersalliance2695四元泵

watersalliance2998pda檢測器

watersalliance2695自動進樣器

watersalliance2695柱溫箱

empower2網絡版工作站

色譜柱:agilentzorbaxsb-c8,5um,250x4.6mmpn:880975-906

流速:1.0ml/min.

檢測波長:uv254nm

進樣體積:10ul

柱溫:30℃

自動進樣器溫度:5℃

流動相a:water/tfa＝1000/1(v/v)

流動相b:acetonitrile/tfa＝1000/1(v/v)

樣品溶劑:acetonitrile/dms0＝50/50

樣品濃度:1.0mg/ml

實施例1合成制備獲得的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b(批號：20140913)，與合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批號20140424-1)中含有的雜質b的等同性驗證：

分別對合成制備所得5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b、合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸進行hplc分析(譜圖如圖1、圖2所示)，表2是圖2的數據匯總。再將約5％的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b標準品，加入昆藥集團股份有限公司合成的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸樣品(批號20140424-1)，進行hplc分析(譜圖如圖3所示)，表3是圖3的數據匯總。

分析結果顯示，合成制備獲得的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b標準品出峰位置與5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中本身含有的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b完全吻合。

對二者的uv吸收進行檢測，譜圖如圖4、圖5所示，結果表明兩者的uv吸收圖譜完全一致。因此它們的等同性可以得到確認。

表2圖2的數據匯總

表3圖3的數據匯總

2、質譜和lc/ms解析

測試條件：

質譜：waterssqd

軟件：watersempower2網絡版

source:120℃desolvati0n:300℃capilary:3.5kv

lc-ms:

流動相a:超純水(milliporeultrapurewatersystem，resistivity：18.2mω.cm)+0.1％甲酸

pumpb:色譜純乙腈(merckkgaa64271,hypergradeforlc-ms)+0.1％甲酸

色譜柱：t3(3μm)，100×4.6mm

柱溫:30℃

檢測波長:λ＝254nm,230nmand218nm/pda

流速:1.0ml/min

譜圖見圖6、圖7、圖8和圖9。

由上述譜圖可知，對5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批號20140424-1)中含有的雜質b，以及合成制備的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸雜質b(批號201409132)進行lc/ms分析，均顯示其分子量為444([m-h]^-443)(見圖8和圖9)。由其分子量可以推測，雜質b應該是5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸脫一分子水后的產物。并且，5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中本身含有的雜質b，與合成制備的雜質b，具有相同的分子離子信號。

3、5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸雜質b的核磁共振譜圖解析

核磁共振氫譜：

儀器型號：brukeravanceiii400spectrometer(z115310,sn10032129)

溶劑：[d6]dmso(d,99.9％)+0.03％v/vtms,10*0.6mlampoule,cambridgeisotopelaboratories,inc.,lot12a-029

溫度：25℃

測試數據見表4。

表4核磁共振氫譜數據匯總

核磁共振¹³c譜：

儀器型號：brukeravanceiii400spectrometer(z115310,sn10032129)

溶劑：[d6]dmso(d,99.9％)+0.03％v/vtms,10*0.6mlampoule,cambridgeisotopelaboratories,inc.,lot12a-029

溫度：25℃

結果見表5。

表55,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸雜質b的核磁共振碳譜分析

由以上結果可知，ms一級譜給出了雜質準確的分子量信息：m/z442.7,與5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸脫一分子水后所得的5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b分子量一致。hplc譜確證了制備所得5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b與合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b的保留時間完全一致，且uv譜證實了二者的特征吸收峰完全一致。核磁共振氫譜和碳譜，證實了5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質(雜質)b化學結構如式(ⅰ)所示：

由上述實施例可知，本發明證實了上述5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有關物質b的結構，并成功制備得到該化合物，且具有較高的純度，可以直接用于合成5,6,4’-三羥基黃酮-7-0-d-葡萄糖醛酸的雜質分析控制，以此基礎制訂了嚴格的雜質限度，為將來產品的安全使用提供了理論依據。

以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。