本發明屬于醫藥技術領域，，尤其是涉及一種6-溴色胺衍生物及其制備方法和應用。

背景技術：

阿爾茲海默癥（alzheimer’sdisease，ad）俗稱老年癡呆，是中樞神經系統的語言、學習、記憶等認識能力受損而產生的神經退行性疾病，是老齡人群中發病率最高的疾病之一。隨著老齡化社會的到來，未來幾十年ad發病人數勢必急劇增加，將給我國醫保系統造成巨大壓力，抗老年癡呆藥物的需求將有廣闊的增長空間。目前，世界上較為接受的ad病理學說為“膽堿能缺失學說”，該學說認為老年性癡呆癥患者大腦內神經遞質-乙酰膽堿（acetylcholine，ach）的缺失是導致ad疾病的關鍵原因。醫學治療上多采用乙酰膽堿酯酶抑制劑（acetylcholinesteraseinhibitors，achei）抑制乙酰膽堿酯酶（ache）活性，延緩ach水解的速度，提高突觸間隙ach的水平，從而發揮其對ad的治療作用。

目前臨床上還沒有藥物可以完全保護神經元，抑制神經元內部ach的降解是治療老年癡呆癥的主要手段achei是美國fda許可唯一作為治療ad的藥物，也是治療ad最有效的藥物之一。因此，抗老年癡呆藥物的研發尤為迫切，尋找和發現新的乙酰膽堿酯酶抑制劑就顯得尤為重要。

海洋天然產物歷經數十年的研究，已經積累了相當豐富的研究資料，為海洋藥物的開發提供了科學依據。從海洋生物中發現的大量活性天然成分，有的可以直接進入新藥的研究開發，但有的活性成分存在著活性較低或毒性較大等問題。因此，需要將這些活性成分作為先導化合物進一步進行結構優化，如結構修飾和結構改造，以期獲得活性更高、毒性更小的新的化學成分。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種可顯著抑制ache的6-溴色胺衍生物及其制備方法和在治療阿爾茨海默癥方面的應用。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種6-溴色胺衍生物，結構式由（ⅰ）表示：

........（ⅰ）

通式（ⅰ）中r選自-cl或-h；

當r=-cl時，化合物為6-溴色胺氯代苯乙酸；

當r=-h時，化合物為即6-溴色胺苯丙酸。

上述6-溴色胺衍生物的制備方法，包括以下步驟：稱取0.35mmol氯代苯乙酸或苯丙酸，用5ml二氯甲烷溶解，接著加入0.096gedc.hcl，出現白色渾濁液體，再加入0.068ghobt，常溫下攪拌30min，白色渾濁現象消失，用薄層色譜檢測反應過程，發現有新的點出現時，將7ml溶解有0.25mmol6-溴色胺的二氯甲烷滴加到反應液中，室溫攪拌反應過夜，用薄層色譜檢測，發現原料點消失，停止反應，蒸掉溶劑，得到粗品，最后用半制備型液相色譜分離微量產物，純化得到6-溴色胺衍生物，其結構式由（ⅰ）表示：

........（ⅰ）

通式（ⅰ）中r選自-cl或-h；

當r=-cl時，化合物為6-溴色胺氯代苯乙酸；

當r=-h時，化合物為即6-溴色胺苯丙酸。

所述的半制備液相色譜條件：粗品用甲醇溶解，0.22μm孔徑過濾，采用xbridge制備柱，每次進樣量1ml，以甲醇與水按體積比65：35混合液為流動相，流速為8ml/min，pda檢測波長為280nm。

上述6-溴色胺衍生物的應用，所述的6-溴色胺衍生物在制備乙酰膽堿酯酶抑制劑方面的用途。

與現有技術相比，本發明的優點在于：本發明首次公開了一種6-溴色胺衍生物及其制備方法和應用，其對6-溴色胺進行結構改造得到6-溴色胺氯代苯乙酸和6-溴色胺苯丙酸衍生物，該6-溴色胺衍生物可顯著抑制乙酰膽堿酯酶活性（ache），ic50分別為溴色胺氯代苯乙酸17.6μm，溴色胺苯丙酸22.3μm，顯示易抑制ache，另外溴色胺氯代苯乙酸可競爭性抑制ache。因此，有望將6-溴色胺衍生物開發為治療阿爾茨海默病藥物。

附圖說明

圖1為體外檢測溴色胺氯代苯乙酸對乙酰膽堿酯酶的抑制效率圖；

圖2為體外檢測溴色胺苯丙酸對乙酰膽堿酯酶的抑制效率圖；

圖3為體外檢測溴色胺苯丙酸對乙酰膽堿酯酶的抑制作用的lineweaverburk雙倒數圖；

圖4為圖3雙倒數直線的斜率對溴色胺苯丙酸濃度的關系圖；

圖5為溴色胺氯代苯乙酸與乙酰膽堿酯酶的分子對接結果圖；（圖中配體使用球棍模型，受體氨基酸殘基使用棍模型表示。球體表示不同原子。lp：親脂性。受體表面深淺表示其親脂性程度，深色表示親脂性強、淺色表示親水性強）；

圖6為溴色胺苯丙酸與乙酰膽堿酯酶的分子對接結果圖；（圖中配體使用球棍模型，受體氨基酸殘基使用棍模型表示。球體表示不同原子。lp：親脂性。受體表面深淺表示其親脂性程度，深色表示親脂性強、淺色表示親水性強）。

具體實施方式

以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。

實施例1

一種6-溴色胺衍生物，結構式由（ⅰ）表示：

........（ⅰ）

通式（ⅰ）中r選自-cl或-h；

當r=-cl時，化合物為6-溴色胺氯代苯乙酸；

當r=-h時，化合物為即6-溴色胺苯丙酸。

實施例2

溴色胺氯代苯乙酸的制備

稱取0.35mmol氯代苯乙酸，用5ml二氯甲烷溶解，接著加入0.096g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（edc.hcl），出現白色渾濁液體，再加入0.068g1-羥基苯并三唑(hobt)，常溫下攪拌30min，白色渾濁現象消失，用薄層色譜檢測反應過程，發現有新的點出現時，將7ml溶解有0.25mmol6-溴色胺（其中6-溴色胺為6-溴色胺鹽酸鹽用氫氧化鈉去除鹽酸獲得）的二氯甲烷滴加到上面的反應液中，室溫攪拌反應過夜，用tlc檢測，發現原料點消失，停止反應，蒸掉溶劑，得到粗品，最后用半制備型液相色譜分離微量產物。半制備液相色譜條件：粗品用甲醇溶解，0.22μm孔徑過濾，采用xbridge制備柱（19mm×250mm，10μm），每次進樣量1ml，以甲醇：水=65：35（v/v）為流動相，流速為8ml/min，pda檢測波長為280nm，純化得到溴色胺氯代苯乙酸，其結構如下：

。

實施例3

6-溴色胺苯丙酸的制備

稱取0.35mmol苯丙酸，用5ml二氯甲烷溶解，接著加入0.096g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（edc.hcl），出現白色渾濁液體，再加入0.068g1-羥基苯并三唑(hobt)，常溫下攪拌30min，白色渾濁現象消失，用薄層色譜檢測反應過程，發現有新的點出現時，將7ml溶解有0.25mmol6-溴色胺的二氯甲烷滴加到上面的反應液中，室溫攪拌反應過夜，用tlc檢測，發現原料點消失，停止反應，蒸掉溶劑，得到粗品，最后用半制備型液相色譜分離微量產物。半制備液相色譜條件：粗品用甲醇溶解，0.22μm孔徑過濾，采用xbridge制備柱（19mm×250mm，10μm），每次進樣量1ml，以甲醇：水=65：35（v/v）為流動相，流速為8ml/min，pda檢測波長為280nm，純化得到苯丙酸，其結構如下：

。

實施例4

乙酰膽堿酯酶抑制活性測試實驗

1、實驗材料和試劑

實驗試劑：碘代乙酰硫代膽堿(achi）購自sigma公司，溶于100mmol/lna2hpo4

溶液，濃度為20mmol/l。0.04mol/l的ph=7.4的na2hpo4溶液、0.1mol/l的ph=7.4的磷酸緩沖鹽溶液（pbs）。濃度為2wt%的ph=7.4的5,5-二硫代-2-硝基苯甲酸（dithiobis-nitrobenzoicacid，dtnb）溶液（用0.01mol/l,ph=7.4的pbs配制），0.02mol/l碘代硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine,achi,用0.1mol/l，ph=7.4的pbs配制），陽性對照6mol/l多奈哌齊（donepezil）。

腦勻漿液制備：小鼠斬首后取腦，在冰上分離取得全腦。全腦稱重后，加入10倍重量的裂解緩沖液（hepes為10mmol/l，tritonx-100為0.5%，edta為5mmol/l，egta為5mmol/l，nacl為1000mmol/l，調節ph=7.5），勻漿直至破壞阻止。勻漿液超聲處理30s后，3000rpm、4℃離心15min，吸取上清。

配制na2hpo4溶液：將14.2gna2hpo4粉末溶解定容到1000ml，濃度為0.04mol/l，調ph=7.4。

配制pbs緩沖液：將pbs粉末定容至500ml容量瓶中，配制得0.01mol/l，ph=7.4的pbs緩沖液。

5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(dtnb)的配制：取100mgdtnb加入50ml濃度為0.04mol/l的ph=7.4的na2hpo4溶液，置于4℃保存供使用；

底物achi的配制：取290mg加入50ml濃度0.04mol/l的ph=7.4的na2hpo4溶液，配制得0.02mmol/l的achi。

2、實驗方法

2.1化合物的乙酰膽堿酯酶抑制活性實驗如下

（1）實驗原理：一定條件下，碘代硫代乙酰膽堿在乙酰膽堿酯酶的作用下分解成碘代硫代膽堿，碘代硫代膽堿與顯色劑dtnb迅速作用，生成的5-巰基-2-硝基苯甲酸是在412nm處具有紫外光吸收的黃色物質。乙酰膽堿酯酶與碘代硫代乙酰膽堿的作用反應如下：

碘化硫代乙酰膽堿碘代硫代膽堿

含巰基化合物可以與dtnb反應，斷裂dtnb的二硫鍵產生2-硝基-5-硫代苯甲酸（ntb-），若在中性或堿性ph條件下的水中可以離子化，生成ntb2-二價陰離子。這種ntb2-離子呈現黃色。

dtnb5-巰基-2-硝基苯甲酸

(黃色)

（2）實驗步驟

樣品組：在96孔酶標板上中依次加入85μl濃度為0.04mol/l的ph=7.4的na2hpo4溶液，5μl乙酰膽堿脂酶（腦勻漿），加入5μl濃度為0.02mmol/l底物achi，再加入5μl樣品，在37℃條件下反應30min。再加入75μl的2wt%的dtnb，用酶標儀在412nm波長處測定其吸光度值，做三組平行實驗。

空白對照組：用5μlna2hpo4溶液代替5μl待測樣品溶液，其它條件不變。

陽性對照組：用5μl濃度為6mol/l多奈哌齊（donepezil）溶液代替5μl待測樣品溶液，其它條件不變。

抑制率(％)=[(空白對照組-陽性對照組)-(樣品組-陽性對照組)]/(空白組-陽性對照組)×100％

根據不同濃度梯度的樣品對乙酰膽堿酯酶的抑制率，繪制樣品及多奈哌齊對乙酰膽堿酯酶的抑制曲線，并通過spss18軟件計算得到化合物的ic50值。結果表明化合物作為抗乙酰膽堿酯酶活性的先導化合物進行后續衍生化開發。

雙底物中底物模型ache活性抑制類型確定：實驗操作：選擇溴色胺苯丙酸進行抑制類型實驗。在96孔板的樣品測定孔中依次加入85μl濃度為0.04mol/l的ph=7.4的na2hpo4溶液，十種不同濃度的5μl乙酰膽堿脂酶（腦勻漿），5μl濃度為0.02mmol/l底物achi，每種濃度的腦勻漿都對應加入5μl兩種濃度的樣品，同時設置相應的的空白對照和陽性對照，在37℃條件下反應30min。再加入75μl的2wt%的dtnb，用酶標儀在412nm波長處測定其吸光度值。繪制米氏方程曲線，根據濃度曲線判定化合物的抑制類型。

2.2分子對接

ache結構信息為ache的三維晶體結構來自proteindatabank，其pdb序號為1zgc，是ache與其特異性抑制劑tacrine(10)-hupyridone（他克林衍生物）共結晶后通過x射線衍射得到的結果，分辨率為2.3埃；分子對接流程為分子對接使用軟件為sybyl。小分子建模使用軟件自帶的powell方法優化。軟件使用surflex-dock程序模擬配體與受體的對接。該方法模擬時，受體位置相對固定，受體可自由變化。模擬結束后可得到相應的分數（surflex-dockscore）。該分值越高，預測配體受體間的親和力越強。

3、實驗結果

3.16-溴色胺衍生物可直接抑制ache

采用上述ache活力測定方法檢測6-溴色胺衍生物對ache的抑制作用。由圖1可知，溴色胺氯代苯乙酸可劑量依賴性抑制ache，其半抑制劑量（ic50）為17.6μm，由圖2可知，溴色胺丙酸可劑量依賴性抑制ache，其半抑制劑量（ic50）為22.3μm。同樣條件下陽性對照donepezil的ic50為15nm。該結果表示巖藻黃素可直接抑制ache，但抑制活性較陽性對照donepezil低。

3.2溴色胺氯代苯乙酸競爭性抑制ache

采用上述ache活力測定方法測溴色胺氯代苯乙酸對ache的抑制模式。在ache活性測定體系中，固定ache濃度，改變底物achi濃度，測定不同濃度溴色胺氯代苯乙酸對酶活力的影響。酶促反應遵循米氏(michaelis-menten)動力學方程。lineweaverburk雙倒數作圖結果如圖3所示，溴色胺氯代苯乙酸競爭性抑制ache。以雙倒數直線的斜率對溴色胺氯代苯乙酸濃度作圖如圖4所示，得到抑制劑常數ki=52.3μm。

3.3分子對接結果

應用分子對接方法模擬6-溴色胺衍生物對ache的分子結合模式。結果如圖5、6所示，提示6-溴色胺衍生物可能對ache有抑制作用。ache分子結構中有一個深而狹窄的溝，兩個活性中心處于溝內，分別為tyr84、ser200、glu199、his440等氨基酸殘基組成的催化陽性中心（cas）和tyr70、tyr121、tyr279等氨基酸殘基組成的外周陰離子中心（pas）。分子對接實驗結果顯示：6-溴色胺衍生物可進入ache溝中。其中溴色胺氯代苯乙酸與ache蛋白的pas活性部位中的tyr84殘基形成氫鍵，溴色胺苯丙酸與pas的glu199殘基形成氫鍵，提示溴色胺氯代苯乙酸可能與pas的結合較緊密。其中ache有cas（催化陰離子位點）和pas（外周陰離子位點）兩個活性中心，其中cas是乙酰膽堿與ache反應的作用位點；pas在空間上與cas有一定距離，但pas構象改變可影響乙酰膽堿與ache的結合，進而影響酶的催化活性。因此，6-溴色胺衍生物可通過形成相應氫鍵競爭性抑制ache的作用。

綜上所述，6-溴色胺衍生物可劑量依賴性抑制ache，溴色胺氯代苯乙酸半抑制劑量（ic50）為17.6μm，溴色胺苯丙酸半抑制劑量（ic50）為22.3μm。進一步研究發現6-溴色胺衍生物可能通過結合ache的酶活性中心位點，競爭性抑制ache。6-溴色胺衍生物對ache的非競爭性抑制作用，可能為新型抗阿爾茲海默病藥物的開發提供理論基礎。本發明化合物溴色胺氯代苯乙酸和溴色胺苯丙酸有治療阿爾茨海默病的藥理作用。

上述說明并非對本發明的限制，本發明也并不限于上述舉例。本技術領域的普通技術人員在本發明的實質范圍內，作出的變化、改型、添加或替換，也應屬于本發明的保護范圍。