本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種用于檢測乳腺癌21基因表達水平的多重熒光pcr檢測試劑盒。
背景技術：
：腫瘤基因的調節通過基因表達(轉錄和翻譯)來完成。基因表達模式包括基因的正向調節和負向調節，它決定著其相關蛋白的表達量。乳腺癌21基因檢測檢測惡性腫瘤組織中一組特異基因的表達，對預測預后、復發、瘤灶轉移乃至指導治療提供信息，最終目的是為患者的個體化治療提供幫助。多參數基因表達試驗同時檢測多種腫瘤基因的表達產物。結果以積分的形式表示，積分用于對腫瘤可能發生的生物學行為的預測。乳腺癌21基因檢測是指檢測乳腺癌腫瘤組織中21個不同基因的表達水平，包含16個乳腺癌相關基因和5個參考基因(如下表)，這個檢測能夠提供個體化的治療效果預測和10年復發風險的預測。通過檢測檢測21個基因，觀察他們之間的相互作用來判斷腫瘤特性，從而可預測乳腺癌復發指數以及接受化療的效益比。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種用于檢測乳腺癌21基因表達水平的多重熒光pcr檢測試劑盒。本發明的技術方案如下：一種用于檢測乳腺癌21基因表達水平的多重熒光pcr檢測試劑盒，依次包括檢測ki-67、stk15、survivin、stromelysin3、cathepsinl2、cyclinb1、grb7、her-2、mybl2、er、pr、bcl2、scube2、gstm1、bag1、cd68、gapdh、beta-actin、rplpo、gus和tfrc的第一至第二十一引物組以及相應的第一至第二十一檢測探針，且第一至第二十一檢測探針的5’端修飾有熒光報告基團，3’端修飾有熒光猝滅基團；其中，第一引物組包括21-mki67-f和21-mki67-r，分別包括如seqidno01和02所示的序列，第一檢測探針為21-mki67-p，包括如seqidno03所示的序列；第二引物組包括21-aurka-f和21-aurka-r，分別包括如seqidno04和05所示的序列，第二檢測探針為21-aurka-p，包括如seqidno06所示的序列；第三引物組包括21-birc5-f和21-birc5-r，分別包括如seqidno07和08所示的序列，第三檢測探針為21-birc5-p，包括如seqidno09所示的序列；第四引物組包括21-mmp11-f和21-mmp11-r，分別包括如seqidno10和11所示的序列，第四檢測探針為21-mmp11-p，包括如seqidno12所示的序列；第五引物組包括21-ctsv-f和21-ctsv-r，分別包括如seqidno13和14所示的序列，第五檢測探針為21-ctsv-p，包括如seqidno15所示的序列；第六引物組包括21-ccnb1-f和21-ccnb1-r，分別包括如seqidno16和17所示的序列，第六檢測探針為21-ccnb1-p，包括如seqidno18所示的序列；第七引物組包括21-grb7-f和21-grb7-r，分別包括如seqidno19和20所示的序列，第七檢測探針為21-grb7-p，包括如seqidno21所示的序列；第八引物組包括21-erbb2-f和21-erbb2-r，分別包括如seqidno22和23所示的序列，第八檢測探針為21-erbb2-p，包括如seqidno24所示的序列；第九引物組包括21-mybl2-f和21-mybl2-r，分別包括如seqidno25和26所示的序列，第九檢測探針為21-mybl2-p，包括如seqdno27所示的序列；第十引物組包括21-esr1-f和21-esr1-r，分別包括如seqidno28和29所示的序列，第十檢測探針為21-esr1-p，包括如seqidno30所示的序列；第十一引物組包括21-pgr-f和21-pgr-r，分別包括如seqidno31和32所示的序列，第十一檢測探針為21-pgr-p，包括如seqidno33所示的序列；第十二引物組包括21-bcl2-f和21-bcl2-r，分別包括如seqidno34和35所示的序列，第十二檢測探針為21-bcl2-p，包括如seqidno36所示的序列；第十三引物組包括21-scube2-f和21-scube2-r，分別包括如seqidno37和38所示的序列，第十三檢測探針為21-scube2-p，包括如seqidno39所示的序列；第十四引物組包括21-gstm1-f1和21-gstm1-r，分別包括如seqidno40和41所示的序列，第十四檢測探針為21-gstm1-p，包括如seqdno42所示的序列；第十五引物組包括21-bag1-f和21-bag1-r，分別包括如seqdno43和44所示的序列，第十五檢測探針為21-bag1-p，包括如seqdno45所示的序列；第十六引物組包括21-cd68-f和21-cd68-r，分別包括如seqidno46和47所示的序列，第十六檢測探針為21-cd68-p，包括如seqidno48所示的序列；第十七引物組包括21-gapdh-f和21-gapdh-r，分別包括如seqidno49和50所示的序列，第十七檢測探針為21-gapdh-p，包括如seqidno51所示的序列；第十八引物組包括21-beta-actin-f和21-beta-actin-r，分別包括如seqidno52和53所示的序列，第十八檢測探針為21-beta-actin-p，包括如seqidno54所示的序列；第十九引物組包括21-rplp0-f和21-rplp0-r，分別包括如seqidno55和56所示的序列，第十九檢測探針為21-rplp0-p，包括如seqidno57所示的序列；第二十引物組包括21-gusb-f和21-gusb-r，分別包括如seqidno58和59所示的序列，第二十檢測探針為21-gusb-p，包括如seqidno60所示的序列；第二十一引物組包括21-tfrc-f和21-tfrc-r，分別包括如seqidno61和62所示的序列，第二十一檢測探針為21-tfrc-p，包括如seqidno63所示的序列；該多重熒光pcr檢測試劑盒的反應體系的組成如下：第一至第二十一引物組中的至少一引物組相應的檢測探針1×pcr緩沖液mgcl2dntpstaq酶h2o模板；該多重熒光pcr檢測試劑盒的每一反應體系的反應條件均為：95℃預變性5分鐘，1個循環；95℃變性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸15秒，15個循環；95℃變性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30個循環；后30個循環在退火時檢測熒光信號。在本發明的一個優選實施方案中，所述模板為自石蠟包埋組織切片中提取的rna。在本發明的一個優選實施方案中，所述第一至第二十一引物組以及相應的第一至第二十一檢測探針分為第一至第八檢測組，所述多重熒光pcr檢測試劑盒的反應體系的組成如下：第一至第八檢測組中的其中之一1×pcr緩沖液mgcl2dntpstaq酶h2o模板。進一步優選的，所述第一檢測組包括第一至第三引物組以及第一至第三檢測探針；所述第二檢測組包括第四至第六引物組以及第四至第六檢測探針；所述第三檢測組包括第七至第九引物組以及第七至第九檢測探針；所述第四檢測組包括第十至第十二引物組以及第十至第十二檢測探針；所述第五檢測組包括第十三至第十四引物組以及第十三至第十四檢測探針；所述第六檢測組包括第十五至第十六引物組以及第十五至第十六檢測探針；所述第七檢測組包括第十七至第十八引物組以及第十七至第十八檢測探針；所述第八檢測組包括第十九至第二十一引物組以及第十九至第二十一檢測探針。在本發明的一個優選實施方案中，所述熒光報告基團包括fam、hex和rox，所述熒光猝滅基團包括bhq1和bhq2。在本發明的一個優選實施方案中，所述反應體系的具體組成如下：本發明的有益效果：本發明的試劑盒采用多重熒光pcr擴增技術，以石蠟包埋組織切片中提取的rna為檢測樣本，能夠準確、簡單、快速地同時檢測乳腺癌腫瘤組織中21個不同基因的表達水平，輔助臨床醫生評估早期乳腺癌患者的化療收益和復發風險。附圖說明圖1為本發明實施例1的多重熒光pcr反應程序圖。圖2為本發明實施例1中多重熒光pcr檢測21基因高表達水平對照樣品檢測曲線圖。圖3為本發明實施例2中多重熒光pcr檢測21基因低表達水平的樣品檢測曲線圖。具體實施方式以下通過具體實施方式結合附圖對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。依次包括檢測ki-67、stk15、survivin、stromelysin3、cathepsinl2、cyclinb1、grb7、her-2、mybl2、er、pr、bcl2、scube2、gstm1、bag1、cd68、gapdh、beta-actin、rplpo、gus和tfrc的第一至第二十一引物組以及相應的第一至第二十一檢測探針，且第一至第二十一檢測探針的5’端修飾有熒光報告基團，3’端修飾有熒光猝滅基團，所述熒光報告基團包括fam、hex和rox，所述熒光猝滅基團包括bhq1和bhq2；其中，第一引物組包括21-mki67-f和21-mki67-r，分別包括如seqidno01和02所示的序列，第一檢測探針為21-mki67-p，包括如seqdno03所示的序列；第二引物組包括21-aurka-f和21-aurka-r，分別包括如seqidno04和05所示的序列，第二檢測探針為21-aurka-p，包括如seqidno06所示的序列；第三引物組包括21-birc5-f和21-birc5-r，分別包括如seqidno07和08所示的序列，第三檢測探針為21-birc5-p，包括如seqdno09所示的序列；第四引物組包括21-mmp11-f和21-mmp11-r，分別包括如seqidno10和11所示的序列，第四檢測探針為21-mmp11-p，包括如seqidno12所示的序列；第五引物組包括21-ctsv-f和21-ctsv-r，分別包括如seqidno13和14所示的序列，第五檢測探針為21-ctsv-p，包括如seqidno15所示的序列；第六引物組包括21-ccnb1-f和21-ccnb1-r，分別包括如seqidno16和17所示的序列，第六檢測探針為21-ccnb1-p，包括如seqdno18所示的序列；第七引物組包括21-grb7-f和21-grb7-r，分別包括如seqidno19和20所示的序列，第七檢測探針為21-grb7-p，包括如seqidno21所示的序列；第八引物組包括21-erbb2-f和21-erbb2-r，分別包括如seqdno22和23所示的序列，第八檢測探針為21-erbb2-p，包括如seqdno24所示的序列；第九引物組包括21-mybl2-f和21-mybl2-r，分別包括如seqidno25和26所示的序列，第九檢測探針為21-mybl2-p，包括如seqidno27所示的序列；第十引物組包括21-esr1-f和21-esr1-r，分別包括如seqidno28和29所示的序列，第十檢測探針為21-esr1-p，包括如seqidno30所示的序列；第十一引物組包括21-pgr-f和21-pgr-r，分別包括如seqidno31和32所示的序列，第十一檢測探針為21-pgr-p，包括如seqidno33所示的序列；第十二引物組包括21-bcl2-f和21-bcl2-r，分別包括如seqidno34和35所示的序列，第十二檢測探針為21-bcl2-p，包括如seqidno36所示的序列；第十三引物組包括21-scube2-f和21-scube2-r，分別包括如seqidno37和38所示的序列，第十三檢測探針為21-scube2-p，包括如seqidno39所示的序列；第十四引物組包括21-gstm1-f1和21-gstm1-r，分別包括如seqidno40和41所示的序列，第十四檢測探針為21-gstm1-p，包括如seqidno42所示的序列；第十五引物組包括21-bag1-f和21-bag1-r，分別包括如seqidno43和44所示的序列，第十五檢測探針為21-bag1-p，包括如seqdno45所示的序列；第十六引物組包括21-cd68-f和21-cd68-r，分別包括如seqidno46和47所示的序列，第十六檢測探針為21-cd68-p，包括如seqidno48所示的序列；第十七引物組包括21-gapdh-f和21-gapdh-r，分別包括如seqidno49和50所示的序列，第十七檢測探針為21-gapdh-p，包括如seqidno51所示的序列；第十八引物組包括21-beta-actin-f和21-beta-actin-r，分別包括如seqidno52和53所示的序列，第十八檢測探針為21-beta-actin-p，包括如seqidno54所示的序列；第十九引物組包括21-rplp0-f和21-rplp0-r，分別包括如seqidno55和56所示的序列，第十九檢測探針為21-rplp0-p，包括如seqidno57所示的序列；第二十引物組包括21-gusb-f和21-gusb-r，分別包括如seqidno58和59所示的序列，第二十檢測探針為21-gusb-p，包括如seqidno60所示的序列；第二十一引物組包括21-tfrc-f和21-tfrc-r，分別包括如seqidno61和62所示的序列，第二十一檢測探針為21-tfrc-p，包括如seqdno63所示的序列；該多重熒光pcr檢測試劑盒的反應體系的組成如下：第一至第二十一引物組中的至少一引物組相應的檢測探針1×pcr緩沖液mgcl2dntpstaq酶h2o模板；該多重熒光pcr檢測試劑盒的每一反應體系的反應條件均為：95℃預變性5分鐘，1個循環；95℃變性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸15秒，15個循環；95℃變性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30個循環；后30個循環在退火時檢測熒光信號。所述模板為自石蠟包埋組織切片中提取的rna。所述第一至第二十一引物組以及相應的第一至第二十一檢測探針分為第一至第八檢測組，所述多重熒光pcr檢測試劑盒的反應體系的組成如下：第一至第八檢測組中的其中之一1×pcr緩沖液mgcl2dntpstaq酶h2o模板。所述第一檢測組包括第一至第三引物組以及第一至第三檢測探針；所述第二檢測組包括第四至第六引物組以及第四至第六檢測探針；所述第三檢測組包括第七至第九引物組以及第七至第九檢測探針；所述第四檢測組包括第十至第十二引物組以及第十至第十二檢測探針；所述第五檢測組包括第十三至第十四引物組以及第十三至第十四檢測探針；所述第六檢測組包括第十五至第十六引物組以及第十五至第十六檢測探針；所述第七檢測組包括第十七至第十八引物組以及第十七至第十八檢測探針；所述第八檢測組包括第十九至第二十一引物組以及第十九至第二十一檢測探針。所述反應體系的具體組成如下：上述引物及探針具體序列如下表所示：實施例1本實施例以人類乳腺癌21基因表達水平為檢測對象，通過本發明中的特異引物的優化組合以及熒光探針，從而實現準確、簡單、快速地同時檢測21基因表達水平。以21個基因dna質粒為對照模板，建立多重熒光pcr檢測21基因表達水平的反應體系，最終以循環次數ct值計算rs值作為結果判斷的標準。上述多重熒光pcr擴增反應體系分8管配制，，各管檢測的突變見下表：管號fam熒光信號hex熒光信號rox熒光信號1ki-67stk15survivin2stromelysin3cathepsinl2cyclinb13grb7her-2mybl24erprbcl25scube2gstm1n/a6bag1cd68n/a7gapdhbeta-actinn/a8rplpogustfrc具體為：1號管配制體系：2號管配制體系：3號管配制體系：序號物料物料濃度用量(μl)11×pcr緩沖液1×102mgcl225mm83dntps10mm5421-grb7-f50μm2521-grb7-r50mm0.1621-grb7-p50mm0.1721-erbb2-f50mm0.1821-erbb2-r50mm0.1921-erbb2-p50mm0.11021-mybl2-f50mm0.11121-mybl2-r150mm0.11221-mybl2-p50mm0.113taq酶5u0.514h2o純化水18.615cdna模板——516總體積——504號管配制體系：5號管配制體系：序號物料物料濃度用量(μl)11×pcr緩沖液1×102mgcl225mm83dntps10mm5421-scube2-f50μm2521-scube2-r50mm0.1621-scube2-p50mm0.1721-gstm1-f150mm0.1821-gstm1-r50mm0.1921-gstm1-p50mm0.110taq酶5u0.511h2o純化水18.912cdna模板——513總體積——506號管配制體系：7號管配制體系：序號物料物料濃度用量(μl)11×pcr緩沖液1×102mgcl225mm83dntps10mm5421-gapdh-f50μm2521-gapdh-r50mm0.1621-gapdh-p50mm0.1721-beta-actin-f50mm0.1821-beta-actin-r50mm0.1921-beta-actin-p50mm0.110taq酶5u0.511h2o純化水18.912cdna模板——513總體積——508號管配制體系：以上試劑組分：1×pcr緩沖液，mgcl2，taq酶，dntp均購自中國大連寶生物公司。所述熒光pcr的反應條件如圖1所示：95℃預變性5分鐘，1個循環；95℃變性25秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，15個循環；95℃變性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30個循環，后30個循環在退火時檢測fam、hex和rox熒光信號。檢測fam、hex和rox熒光信號的ct值，是采用mx3000p熒光pcr擴增儀或mx3005p熒光pcr擴增儀或abi7500熒光pcr擴增儀。一次可檢測12份樣品(包括陰陽性對照)。根據熒光pcr擴增儀顯示的每個基因的ct值，計算出每個樣本的rs值，根據rs值的大小判斷樣本結果，如圖2和圖3所示。以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的范圍，即依本發明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的范圍內。<110>廈門飛朔生物技術有限公司<120>一種用于檢測乳腺癌21基因表達水平的多重熒光pcr檢測試劑盒<160>63<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1tattgaatgtgacatccgt19<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2actgaaattatgtaatattgcc22<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3atccagcttcctgttgtgt19<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4tccattacctgtaaatagtggc22<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5ttctgaaccggcttgtga18<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6aaggacacaagacccgctga20<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<400>7ctttctcaaggaccaccg18<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<400>8aagtctggctcgttctca18<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9ccgaggctggcttcatccac20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10acagaagaggttcgtgcttt20<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<400>11cacatcgctccatacctt18<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列<400>12cctgcaccaactgccatggga21<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<400>13tgaatctttcgctcgtcc18<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列<400>14tcttctgtgtgttgcctt18<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15acagcggaggctattcccaa20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16tattttggttgatactgcct20<210>17<211>18<212>dna<213>人工序列<400>17tcagagaaagcctgacac18<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列<400>18ttcttctgcaggggcacatcc21<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<400>19ctctcctcatcccaaccacc20<210>20<211>18<212>dna<213>人工序列<400>20ccccgagaattgggctct18<210>21<211>24<212>dna<213>人工序列<400>21cctcccctctatccccaacccctt24<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<400>22cagacacgtttgagtccatg20<210>23<211>20<212>dna<213>人工序列<400>23gtcacctcttggttgtgcag20<210>24<211>24<212>dna<213>人工序列<400>24actacctttctacggacgtgggat24<210>25<211>20<212>dna<213>人工序列<400>25ggacactgattgccaagcac20<210>26<211>19<212>dna<213>人工序列<400>26tcctcggtccagcaagact19<210>27<211>23<212>dna<213>人工序列<400>27ccgtgaacgctggcacaaccacc23<210>28<211>23<212>dna<213>人工序列<400>28tacaggccaaattcagataatcg23<210>29<211>19<212>dna<213>人工序列<400>29aagcatagtcattgcacac19<210>30<211>23<212>dna<213>人工序列<400>30aatctgccaaggagactcgctac23<210>31<211>18<212>dna<213>人工序列<400>31cgaaaagacgcaggacca18<210>32<211>18<212>dna<213>人工序列<400>32cgccaacagagtgtccaa18<210>33<211>23<212>dna<213>人工序列<400>33ctggaggcagcagttctagtccc23<210>34<211>18<212>dna<213>人工序列<400>34cgacttctcccgccgcta18<210>35<211>20<212>dna<213>人工序列<400>35caaagaaggccacaatcctc20<210>36<211>20<212>dna<213>人工序列<400>36aagagctcctccaccaccgt20<210>37<211>19<212>dna<213>人工序列<400>37cacagtacaagatgcacac19<210>38<211>18<212>dna<213>人工序列<400>38ttgttgacagcacacgtt18<210>39<211>18<212>dna<213>人工序列<400>39catgagcagccgccgttt18<210>40<211>19<212>dna<213>人工序列<400>40tgcaggaaacaagatcact19<210>41<211>18<212>dna<213>人工序列<400>41gatcttctccaagccctc18<210>42<211>21<212>dna<213>人工序列<400>42atgtccttgacctccaccgta21<210>43<211>18<212>dna<213>人工序列<400>43gcaatgagaagcacgacc18<210>44<211>19<212>dna<213>人工序列<400>44ttccaagtgctgacaacgg19<210>45<211>24<212>dna<213>人工序列<400>45aagactgtggaacccctatgacct24<210>46<211>19<212>dna<213>人工序列<400>46ccccaacaaaaccaaggtc19<210>47<211>18<212>dna<213>人工序列<400>47ttgtactccaccgccatg18<210>48<211>24<212>dna<213>人工序列<400>48tccccacctgcttctctcattccc24<210>49<211>20<212>dna<213>人工序列<400>49aatatgattccacccatggc20<210>50<211>18<212>dna<213>人工序列<400>50ctccacgacgtactcagc18<210>51<211>22<212>dna<213>人工序列<400>51atcttccaggagcgagatccct22<210>52<211>19<212>dna<213>人工序列<400>52ccaggtcatcaccattggc19<210>53<211>18<212>dna<213>人工序列<400>53cggatgtccacgtcacac18<210>54<211>21<212>dna<213>人工序列<400>54ccttcctgggcatggagtcct21<210>55<211>18<212>dna<213>人工序列<400>55ctctgcattctcgcttcc18<210>56<211>18<212>dna<213>人工序列<400>56aaggtgtaatccgtctcc18<210>57<211>22<212>dna<213>人工序列<400>57aaacgagtcctggccttgtctg22<210>58<211>18<212>dna<213>人工序列<400>58gaacagtcaccgacgaga18<210>59<211>18<212>dna<213>人工序列<400>59acattgtgacttggctac18<210>60<211>22<212>dna<213>人工序列<400>60cttcactcggcagagacaacca22<210>61<211>19<212>dna<213>人工序列<400>61aatcttgcgttgtatgttg19<210>62<211>19<212>dna<213>人工序列<400>62ggtaaacaagtctaccgtt19<210>63<211>21<212>dna<213>人工序列<400>63ttgatcacgccagactttgct21當前第1頁12