本發明涉及一種功能化離子液體修飾脂肪酶催化合成曲酸月桂酸單酯(kml)的方法，屬于食品生物技術領域。

背景技術：

曲酸(kojicacid)為無色棱柱狀晶體,化學名稱為5-羥基-2-羥甲基-吡啶-4-酮，是由曲霉屬中某些菌株利用葡萄糖、果糖、山梨糖和糖醉等原料，好氧發酵產生的一種弱酸化合物。最早是由齋藤在1970年從蒸米發酵物中發現的。

曲酸具有抑菌能力、抗氧化性、與金屬離子鰲合等性質，并具有抑制酪氨酸酶減少黑色素生成的作用，因此在食品中可作為防腐劑、保鮮劑、護色劑。經過大量實驗證明，適量的曲酸對人體無害，曲酸可安全應用于食品、護膚品及醫療行業。目前對于曲酸的開發研究，大多數集中在尋找能夠保留甚至提高曲酸抑制酪氨酸酶活力的性能，又可以克服曲酸易變性的缺點的曲酸衍生物。因而，曲酸衍生物的制被成為近年來的研究應用上的焦點和相關產品開發的新動向。

ariff等人(lajisaf,etal.jbiomedbiotechnol.2012；2012:952452.)通過研究曲酸酯對細胞及mushroom酪氨酸酶的抑制活性，結果表明，曲酸酯是安全無毒的除色劑，能有效抑制b16f1黑色素瘤細胞的酪氨酸酶活性。人們嘗試通過其與脂肪酸的酯化反應，以期提高曲酸的脂溶性，尤其是通過利用生物轉化法獲得更為安全可靠的曲酸脂肪酸酯衍生物(liukj,shawjf.jamoilchem-soc.1998,75:1507–1511；el-boulifin,asharise,serranom,etal.enzymeandmicrobtechnol.2014,55:128–132；gunawaner,basrim,etal.enzymeandmicrobtechnol.2005,37:739–744.)，進一步擴大其在疏水性食品中的應用范圍。

我們的前期研究結果表明，曲酸月桂酸單酯(kojicmonolaurate，kml)具有良好的抑菌能力、抗氧化性能，有望被開發成為防腐劑、保鮮劑、護色劑，應用于果蔬及甲殼類水產品保鮮領域。

合成kml的方法主要有化學合成與生物催化法。化學合成法使用大量有機溶劑和價格昂貴的金屬催化劑，通過復雜的保護與去保護步驟，提高產物的單酯選擇性。分離純化復雜、投資成本大、易污染環境等缺點。而生物催化法具有條件溫和、能耗低、無有害副產物、分離純化操作簡便等特點。此外生物催化劑—酶可以重復利用，大大降低了成本。

酶促法制備kml，主要利用脂肪酶作為催化劑，使曲酸與月桂酸(酯)發生直接酯化(或酯交換)反應。但從國內外的研究發現，常規脂肪酶在有機溶劑(叔戊醇、叔丁醇等)介質中催化酯化反應仍存在反應活性低、時間過長、產率低、酶用量大、成本高等問題?；谝陨涎芯楷F狀，如何縮短反應時間、提高酶活性及產物得率，同時減少脂肪酶用量已成為制約kml生物法合成的主要問題。

離子液體因具備對環境友好的特性而被稱為“綠色”溶劑，己經在有機合成與生物化學、電化學、分離過程、催化等領域得到廣泛的應用。同時，離子液體又被稱為“可設計性”溶劑，通過改變陰、陽離子的結構可調節離子液的物化特性(如極性、疏水性、黏性、熔點、密度等)以完成其在各領域中的應用任務(task-specificionicliquid)。目前，離子液體在生物催化領域的應用研究往往就是將結構相對簡單的傳統型離子液用作催化反應介質或少量添加的反應促進劑(enhancer)，以期改善酶促反應，提高產物得率或反應選擇性。2011年，bastiendoumèche等研究發現含羥基的離子液體在活化劑作用下可實現甲酸脫氫酶的化學修飾，但這類常規離子液體不僅修飾作用有限，且對酶活影響較大。

本發明是利用一類功能化離子液體共價修飾脂肪酶，再將此高催化活性及反應選擇性的修飾脂肪酶用于催化合成食品添加劑kml，縮短了反應時間，避免環境污染，為生物法制備kml提供了又一成功范例。

技術實現要素：

本發明提供了一種生物法合成曲酸月桂酸單酯的方法，該方法具有較高的轉化率和選擇性，同時，縮短了反應時間，避免了環境污染。

一種生物法合成曲酸月桂酸單酯的方法，包括以下步驟：

在生物催化劑和分子篩存在的條件下，曲酸和月桂酸在反應介質中進行反應，反應結束后，經過后處理得到所述的kml；

所述的催化劑為功能化離子液體共價修飾脂肪酶。

該方法首先利用一類具有多重雜環骨架結構的功能化離子液體共價修飾脂肪酶，再將此高催化活性及反應選擇性的修飾脂肪酶用于催化合成食品添加劑kml。本發明具有反應條件溫和、反應選擇性高、綠色無污染等優點，符合現代食品添加劑制造的要求。

用于游離脂肪酶化學修飾的功能化離子液體的陰離子是具有不同親水性或電負性的極性離子，陽離子是含多重雜環骨架結構的離子，且含有機官能團為羧基。該功能化離子液體可用于對游離脂肪酶進行化學修飾，目的在于提高游離脂肪酶的穩定性、活性及催化選擇性。

作為優選，所述的功能化離子液體為6,7-二氫-5h-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸鹽和5,6,7,8-四氫吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸鹽；作為進一步的優選，所述的功能化離子液體中陽離子部分的脂肪酸支鏈選自羧乙基、羧丙基、羧丁基、羧戊基。

本發明還提供了一種采用所述的功能化離子液體共價修飾得到的脂肪酶，所述的修飾方法如下：

將所述的離子液體、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與n-羥基琥珀酰亞胺按1:1-3:1的摩爾比溶于嗎琳乙磺酸(mes)中活化1-3h，將活化后的離子液體與脂肪酶按摩爾比100-1000：1在0-4℃混合反應2-6h；或者將所述的離子液體與cdi按摩爾比1:1-3溶于dmso中活化1-3h，將活化后的功能化離子液與脂肪酶按摩爾比100-1000：1在0-4℃混合反應1-6h。通過上述方法可以使離子液的活性官能基團與脂肪酶的氨基酸殘基通過共價結合得到修飾后的脂肪酶，從而將多重雜環骨架結構引入到脂肪酶的表面。

本發明中食品添加劑kml的具體制備方法如下：

將一定量的曲酸、月桂酸、分子篩、修飾脂肪酶與非水反應介質加入生物反應器中，控制反應溫度60℃，反應時間為48h。反應結束后，離心，反應體系經乙酸乙酯洗滌，收集有機相，減壓除溶劑，得固體粗產品；過柱純化，收集有機相，除水，減壓除溶劑，得白色固體kml。

其中，上述脂肪酶為疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶、褶皺假絲酵母脂肪酶、南極假絲酵母脂肪酶、豬胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋蔥假單胞菌脂肪酶、洋蔥布克氏菌脂肪酶；或上述一種或多種的脂肪酶。

其中，上述脂肪酶的用量為2.0～2.5％(w/v)。

其中，上述非水反應介質為離子液體或有機溶劑；或離子液體與有機溶劑的混合物。

其中，上述的反應介質為離子液體，三辛烷基甲基季銨鹽、氯化-1-烯丙基-3-甲基咪唑鹽、1-乙基-3-甲基咪唑乙酸正離子、1-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物、1-羥乙基-3-甲基咪唑四氯硼酸鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑氯鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑硝酸鹽、及各類含peg支鏈的功能離子液體；或上述一種或多種的混合離子液體。

其中，上述反應介質為有機介質，叔丁醇、叔戊醇、正己烷、環己烷、異辛烷、丙酮、辛醇、丁醇、十二烷醇、2-甲基-2-丙醇、dmso；或上述兩種或多種有機溶劑的混合物。

作為最優選，所述的反應介質為叔丁醇和[peg350im]pf6的混合物，此時，催化效率最高。

其中，其中，上述曲酸的用量為6-10mg/l,且曲酸與月桂酸的摩爾比為1:2-1:6。

其中，上述反應溫度為50-75℃。

其中，上述催化反應時間為6-48h。

其中，上述分子篩為3a型，分子篩用量為10-12％(w/v)。

本發明還提供了一種曲酸月桂酸單酯在制備食品添加劑中的應用，所述的食品添加劑用于抑制單增李斯特菌。

同現有技術相比，本發明的有益效果體現在：

本發明提供的功能化離子液體修飾脂肪酶催化合成kml的方法，具有多重雜環骨架結構的功能性離子液體對脂肪酶實施了有效化學修飾，調整酶活性中心的空間結構，強化了脂肪酶的催化性能。不僅反應迅速，得到高純度的曲酸月桂酸單酯，而且提高了脂肪酶的選擇性，有效解決了副產物多、反應耗時、操作繁瑣等問題，符合綠色化學的要求。

附圖說明

圖1是實施例1中，對比研究了自由酶與化學修飾脂肪酶在有機介質中催化合成kml的反應情況；

圖2是實施例2中，化學修飾脂肪酶在離子液體/有機溶劑混合體系中[peg350im]pf6/叔丁醇中催化合成kml的反應情況。

圖3是實施例3中，酶促反應產物kml對單增李斯特菌的抑菌效果。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡明本發明，但本發明不限于此。

氣相色譜(gc)分析條件：不同時間從反應器中取出適量樣品用色譜純甲醇稀釋并置于樣品瓶中。立刻加樣入gc色譜儀(agilent6890n)中，以防止樣品的分解。色譜柱：ht-5fusedsilicacapillarycolumn(0.15μm,0.53mm,0.30m),檢測器：fid，進樣口及檢測器溫度340℃和350℃，柱溫采用程序升溫：70℃到340℃，升溫速率20℃/min。載氣為n2，流速：1.0ml/min，進樣量：2μl。kml得率(摩爾轉化率)＝曲酸月桂酸單酯摩爾數/初始曲酸摩爾數×100％。

樣品處理條件：反應結束后，反應體系進行離心分離，并用乙酸乙酯洗滌固體相兩次，收集有機相，減壓除溶劑得白色固體粗產物；再經過色譜分離，收集樣品組分，合并有機相，干燥，減壓除溶劑，得白色產物。

實施例1

本實施例對比研究了修飾脂肪酶與自由酶在有機介質中催化合成kml的反應差異。

僅用自由脂肪酶催化反應：

在生物反應器中加入42mm曲酸、130mm月桂酸、300mg3a分子篩和60mg脂肪酶，3ml叔丁醇，水浴60℃，反應時間為48h。測定kml產率隨時間的變化曲線。如圖1所示。

功能離子液體共價修飾脂肪酶催化反應：

功能化離子液體的活化：將0.30g6,7-二氫-5h-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化鹽與0.2gcdi(1,1′-羰基二咪唑)溶于5mldmso，在室溫條件下反應2h，得到活化后的功能化離子液體，未經處理，4℃冷藏備用。酶的共價修飾：功能化離子液體經活化后與游離南極假絲酵母脂肪酶b(candidaantarcticalipaseb)按摩爾比200:1混合反應，反應溫度控制在0～4℃，反應時間4h，離心去除殘留修飾劑后得到修飾脂肪酶。

在生物反應器中加入42mm曲酸、130mm月桂酸、300mg3a分子篩和60mg共價修飾脂肪酶，3ml叔丁醇，水浴60℃，反應時間為48h。反應結束后，測定kml產率隨時間的變化曲線。如圖1所示。

實施例2

本實施例對比研究了共價修飾脂肪酶在離子液體[peg350im]pf6與叔丁醇混合體系中催化合成kml的反應情況。

在生物反應器中加入42mm曲酸、130mm月桂酸、300mg3a分子篩和60mg共價修飾脂肪酶，3ml[peg350im]pf6/叔丁醇(3:1,1:1,1:3,v/v)，設定反應溫度60℃，反應時間為24h。反應結束后，計算產物kml產率，如圖2所示。

實施例3

本實施例探究產物kml對單增李斯特菌的抑菌效果(瓊脂擴散法)。

單增李斯特菌在tsb培養基中37℃培養12h。取其中100μl菌懸液，將其稀釋至濃度為10⁶cfu/ml，在55℃將20mltsa培養基與其混合均勻后立即置于培養皿中，冷卻固化。利用無菌打孔器在固化培養基上打孔(直徑7.0mm)，分別將100μl的10mm的抑菌劑溶液滴加入板空內，在還有實驗菌的瓊脂培養基上進行擴散滲透，并將他們置于37℃培養12h，再測定抑菌圈的大小。如果抑菌劑能殺死或抑制培養皿中供試菌的生長，則在牛津環的周圍會出現一個無菌生長的透明圈，即抑菌圈。以抑菌圈的直徑作為評定指標，直徑越大，說明該抑菌劑對此種供試菌的抑制效果越好，反之則抑制效果越差。

(0)號，對應乙醇，作為陰性對照。(1)號，l-抗壞血酸；(2)號，對應kml；(3)號，對應醋酸，作為陽性對照；對應kml；(4)號，蔗糖單硬脂酸酯

抑菌圈測定結果為：12.2±0.4(1),15.4±0.2(2),13.4±0.3(3)和12.1±0.2mm(4)。結果表明kml對單增李斯特菌具有較好的抑菌效果。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應該視為本發明的保護范圍。