本發(fā)明屬于荔枝遺傳育種技術領域，具體涉及一種鑒定荔枝真雜種的分子標記及其應用。

背景技術：

荔枝(litchichinensissonn.)起源于中國，為典型的無患子科(sapindaceae)荔枝屬(litchisonn.)亞熱帶常綠果樹，因果實形、色、香、味俱佳和營養(yǎng)豐富而譽稱“嶺南果王”、“人間仙果”以及“佛果”等美譽馳名中外。我國是荔枝的最大生產國，主產區(qū)主要分布在廣東、廣西以及海南，福建、云南、四川、貴州等省份有少量種植，然而隨著荔枝產業(yè)的快速發(fā)展，很多產業(yè)結構突出問題開始大量顯現(xiàn)，其中一個主要問題是各主產區(qū)品種栽培結構不夠合理：特早熟和特晚熟品種所占比例特小，而中熟品種所占比例得多，造成荔枝產期過于集中，在6、7月份大量上市，常造成廣大果農豐產年而不豐收，嚴重影響了我國荔枝產業(yè)經濟效益的提高，消減了果農栽培荔枝的積極性，出現(xiàn)荔枝果園無人管理現(xiàn)象，大片果園荒廢令人惋惜。造成以上結果的一個主要原因是現(xiàn)有的荔枝品種已經很難滿足荔枝生產發(fā)展的需求，缺乏品質優(yōu)良的特早熟和特晚熟荔枝品種。因此，培育優(yōu)質的荔枝新品種刻不容緩，特別是特早熟和特晚熟優(yōu)良品種的選育，進而為荔枝不同品種栽培結構比例的優(yōu)化提供品種支撐，以達到延長荔枝產期的目的。

雜交育種有利于綜合雙親的優(yōu)良性狀，可以針對目標性狀進行有目的的育種，在荔枝育種方法中，人工雜交育種是最要的方法之一。然而荔枝是長壽命木本果樹，童期長，一般從實生種子播種到開花需要5年左右，造成荔枝雜交育種周期在10年以上，同時荔枝樹體高大，占地面積多，管理上費工、費時，再加上荔枝基因組高度雜合、遺傳背景不清、缺乏有效的雜種鑒別技術以及我國荔枝人工雜交育種起步晚，以上原因導致荔枝雜交育種的成效至今甚微。分子標記輔助育種是植物雜交育種中一個重要技術手段，可以在幼苗階段對真雜種進行早期鑒定，能夠顯著縮短育種周期。因此，針對以上問題，借助分子標記輔助育種手段在荔枝雜交育種上尤為重要。

毛細管電泳(capillaryelectrophoresis，ce)是20世紀80年代問世的一種高效液相分離法，是經典電泳技術和現(xiàn)代微柱分離技術相結合的產物，被認為是當代分析科學最具活力的前沿研究課題。毛細管電泳技術因其分離效率高、分析速度快、樣品用量少、易于自動化等特點而廣泛應用于分子生物學、醫(yī)學、藥學、高分子等領域，尤其在生物分析及生命科學相關研究中顯示廣闊的應用前景。

發(fā)明人通過人工設施栽培在夏季對荔枝開展反季節(jié)低溫誘導實驗，有力證明了低溫是誘導荔枝成花的關鍵環(huán)境因子，對荔枝的葉片和頂芽開展局部低溫誘導實驗，證明了荔枝的葉片是感受低溫誘導信號的關鍵器官，為此申請工作人員對低溫處理0h、8h、32h、9d、27d、47d和61d的葉片開展rna-seq和小rna高通量深度測序。其中通過rna-seq篩選到一個荔枝成花關鍵基因lcft1，進一步研究證明低溫是通過誘導荔枝葉片中l(wèi)cft1基因的表達進而導致其成花，并且lcft1基因啟動子存在兩個類型，早花荔枝屬于一個類型，晚花荔枝屬于另一個類型，這種啟動子差異導致誘導早、晚花荔枝lcft1基因表達所需低溫量不同，進而導致早花荔枝易成花并早于晚花荔枝(相關結果以promoterdifferenceoflcft1isaleadingcauseofnaturalvariationoffloweringtimingindifferentlitchicultivars(litchichinensissonn.)發(fā)表在plantscience,2015,241:128-137)。早花品種(如“三月紅”、“褐毛荔”、“妃子笑”等)僅需要較短時間的低溫就能夠完成成花誘導(十月中下旬)，因而易成花，一般在2月左右開花；而晚花品種(如“馬貴荔”、“桂味”、“糯米糍”等)必須經過整個冬天的低溫才能完成成花誘導(一月上中旬)，因而難成花，一般在4月左右開花，兩者相差兩個多月。研究調查發(fā)現(xiàn)早花品種和晚花品種起源不同，早花品種起源于北方地區(qū)如云南等地，而晚花品種起源于南方地區(qū)如海南等地，由于開花時間的不同造成它們之間存在生殖上的隔離。一般而言荔枝花期早晚與熟期早晚是相關聯(lián)的，即早花品種是早熟品種，晚花品種是晚熟品種，當然不同品種果實發(fā)育的快慢也與熟期有關。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明首次根據(jù)早花荔枝lcft1基因啟動子屬于一個類型，晚花荔枝lcft1基因啟動子屬于另一個類型，開發(fā)一種基于毛細管電泳技術的用于鑒定早、晚花荔枝雜交后代真雜種的分子標記。本發(fā)明提供的分子標記可顯著縮短荔枝熟期雜交育種周期，節(jié)省人力、物力及土地。

本發(fā)明目的之一是提供一種鑒定早、晚花荔枝雜交后代真雜種的分子標記開發(fā)的原理。

本發(fā)明目的之二是提供上述分子標記的檢測方法。

本發(fā)明目的之三是提供上述分子標記在早、晚花荔枝雜交育種中的用途。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種鑒定荔枝真雜種的分子標記lccezw1，其由下列引物對經pcr擴增獲得，所述引物對的上游引物為seqidno.1所示的序列，所述引物對的下游引物為seqidno.2所示的序列。

seqidno.1：5’-aacaaagtggttctagtttcaga-3’；

seqidno.2：5’-attaatggtaacaattccaagtg-3’。

本發(fā)明還提供了一種所述的鑒定荔枝真雜種的分子標記lccezw1的設計方法：根據(jù)早、晚花荔枝lcft1基因啟動子的差異，早花荔枝lcft1基因啟動子存在4處smallindels差異，在早、晚花荔枝lcft1基因啟動子前兩個smallindels差異序列兩端相同的區(qū)域設計一對引物lccezw1。

本發(fā)明還提供一種對早、晚花荔枝雜交f1代進行真雜種檢測的試劑盒，所述的pcr檢測試劑盒反應體系共25μl，具體組成如下：dna模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，2×taqpcrmastermix(tiangen)12.5μl，ddh2o9.5μl。

作為優(yōu)選，所述的上游引物為seqidno.1所示的序列，所述的下游引物為seqidno.2所示的序列。

本發(fā)明還提供了所述的分子標記lccezw1用于鑒定早、晚花荔枝雜交后代的方法，包括以下步驟：以早花荔枝dna為模板進行pcr擴增，通過毛細管電泳擴增的目的片段大小在444bp處左右出現(xiàn)峰值；以晚花荔枝dna為模板進行pcr擴增，通過毛細管電泳擴增的目的片段大小在432bp處左右出現(xiàn)峰值；以早、晚花荔枝雜交f1代dna為模板進行pcr擴增，通過毛細管電泳如果在444bp和432bp處左右都出現(xiàn)峰值則表明為真雜種，如果在444bp和432bp處左右只出現(xiàn)其中一個峰值則表明為假雜種。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明提供了一個基于毛細管電泳技術的分子標記lccezw1，用以鑒定早、晚花荔枝雜交后代的真假性。本發(fā)明提供的分子標記及其鑒定方法不僅分離效率高、分析速度快、樣品用量少、易于自動化、鑒定結果精確等特點，同時不受環(huán)境影響，選擇目標明確。對于木本果樹的荔枝來說，可在幼苗階段進行早期鑒定，在早、晚花荔枝間雜交育種上具有重要的意義，可顯著縮短育種周期，大大節(jié)省人力、物力及土地，具有很高的社會經濟價值和廣泛的應用前景。

(2)本發(fā)明所提供的分子標記及鑒定方法能夠在dna水平上對早、晚花荔枝雜交后代進行真假性鑒定，有助于建立早、晚花荔枝的分子標記輔助育種體系，便于快速、高通量的應用于早、晚花荔枝間雜交育種實踐中。

附圖說明

圖1為早、晚花荔枝lcft1基因啟動子序列比對圖；

其中，‘z’為早花荔枝lcft1基因啟動子序列；‘w’為晚花荔枝lcft1基因啟動子序列；三角形為早花荔枝lcft1基因啟動子4處smallindels差異：橫線標注部分為分子標記上下游引物所在位置；方框為lcft1基因開放閱讀框(orf)起始密碼子atg。

圖2為以早花荔枝dna為模板擴增的目的片段毛細管電泳圖，在444bp處左右出現(xiàn)目的片段峰值(橫坐標表示擴增片段大小，縱坐標表示信號強度)；

圖3為以晚花荔枝dna為模板擴增的目的片段毛細管電泳圖，在432bp處左右出現(xiàn)目的片段峰值(橫坐標表示擴增片段大小，縱坐標表示信號強度)；

圖4為以早、晚花荔枝雜交f1代真雜種dna為模板擴增的目的片段毛細管電泳圖在444bp和432bp處左右都出現(xiàn)目的片段峰值(橫坐標表示擴增片段大小，縱坐標表示信號強度)。

具體實施方式

下面結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細的闡述，但本發(fā)明的實施方式并不局限于實施例表示的范圍。這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內容后，本領域的技術人員可以對本發(fā)明作各種修改，這些等價變化同樣落于本發(fā)明所附權利要求書所限定的范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1：分子標記lccezw1鑒定“三月紅”和“桂味”雜交f1代真雜種的方法(注：“三月紅”為早花荔枝，作為母本；“桂味”為晚花荔枝，作為父本)。

(1)引物的設計原理

所述分子標記lccezw1開發(fā)的原理是根據(jù)早、晚花荔枝lcft1基因啟動子的差異：早花荔枝lcft1基因啟動子存在4處smallindels差異(圖1)，在早、晚花荔枝lcft1基因啟動子前兩個smallindels差異序列兩端相同的區(qū)域設計一對引物lccezw1(圖1)。

所述分子標記lccezw1是由seqidno.1所示的核苷酸堿基序列和seqidno.2所示的核苷酸堿基序列組成。以“三月紅”dna為模板擴增的目的片段大小為444bp，其具有如seqidno.3所示的序列；以“桂味”dna為模板擴增的目的片段大小為432bp，其具有如seqidno.4所示的序列，比早花荔枝少12bp。

所述分子標記lccezw1是由seqidno.1所示的上游引物和seqidno.2所示的下游引物擴增得到；

seqidno.1：5’-aacaaagtggttctagtttcaga-3’；

seqidno.2：5’-attaatggtaacaattccaagtg-3’。

(2)待檢測荔枝基因組dna的提取

采集母本“三月紅”和父本“桂味”以及它們雜交f1代幼苗植株健康的葉片，采用改良ctab法提取待檢測荔枝葉片基因組dna，具體步驟如下：

(1)將葉片材料洗凈放入液氮冷凍的研缽中，加少許不溶性的pvp，加液氮研磨成粉末；

(2)取0.5g粉末轉移至10ml離心管中并加入3ml65℃水浴的ctab提取液，劇烈震蕩，65℃水浴30-60min，每隔10min輕輕震蕩一次；

(3)加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(v/v/v：25：24：1)輕柔顛倒混勻，12000rpm離心10min；

(4)取上清，加入等體積的氯仿：異戊醇(v/v：24：1)輕柔顛倒混勻，12000rpm離心10min；

(5)取上清，加入等體積的氯仿：異戊醇(v/v：24：1)，輕柔顛倒混勻，12000rpm離心10min，取上清，加入2/3v預冷的異丙醇輕柔顛倒混勻，-20℃沉淀dna30min；

(6)12000rpm離心20min，棄上清，加70％乙醇洗滌沉淀2次；

(7)加100-300μlte緩沖液，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，紫外分光光度計檢測其濃度與純度，最終將dna稀釋到50ng/μl，放入-20℃冰箱備用。

(3)pcr擴增篩選

分別以母本“三月紅”和父本“桂味”以及它們雜交f1代植株的dna為模板進行pcr擴增，其標準pcr反應體系為25μl，具體組成如下：

dna模板1μl，seqidno.1上游引物1μl，seqidno.2下游引物1μl，2×taqpcrmastermix(tiangen)12.5μl，ddh2o9.5μl。

pcr具體擴增程序如下：

94℃預變性3min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35循環(huán)，72℃延伸10min，10℃停止。

(4)毛細管電泳檢測擴增dna片段

從熒光選擇擴增的pcr產物中取1μl加入到96孔板的各孔中，再分別加入9μl去離子甲酰胺，1μlgs3730-500分子量內標，95℃預變性5min，4℃保溫10min后3000rpm離心1min，然后通過abi3730xldna分析儀進行毛細管電泳30min，電壓2kv，進樣時間5s，熒光6-fam，用abidatacollection2.1軟件收集原始數(shù)據(jù)，再用genemarkerv1.91demo軟件對收集的原始數(shù)據(jù)進行分析，系統(tǒng)將各峰值的位置與其泳道中gs3730-500分子量內標做比較確定片段大小，生成圖像。

(5)“三月紅”和“桂味”雜交f1代植株真雜種鑒定

分子標記lccezw1用于鑒定母本“三月紅”和父本“桂味”以及它們雜交f1代植株，如圖2所示一樣，以母本“三月紅”dna為模板，擴增的目的片段通過毛細管電泳在444bp左右處出現(xiàn)峰值；如圖3所示一樣，以父本“桂味”dna為模板，擴增的目的片段通過毛細管電泳在432bp處左右出現(xiàn)峰值；如圖4所示一樣，以“三月紅”和“桂味”雜交f1代植株dna為模板，擴增的目的片段通過毛細管電泳在444bp和432bp處左右都出現(xiàn)峰值，表明為真雜種，否則為假雜種。

sequencelisting

<110>廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院園藝研究所

<120>一種鑒定荔枝真雜種的分子標記及其應用

<130>zyws

<160>4

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<213>人工序列

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