本申請是原申請、申請日為2013年12月27日，申請號為201380068766.7，發明名稱為“細菌纖維素及生產該細菌纖維素的細菌”的中國專利申請的分案申請。本發明涉及細菌纖維素及生產該細菌纖維素的細菌，尤其涉及在液體中分散性優異的細菌纖維素及生產該細菌纖維素的細菌。
背景技術：
：細菌纖維素通常由寬度為約50nm的微細纖維(納米纖維)構成，具有高機械強度、生物適合性、生物降解性等特性，因此作為能夠用于各種產業領域的材料而受到關注。細菌纖維素通常通過對醋酸菌等細菌進行靜置培養而在培養基表面以包含凝膠狀物質的膜(以下稱為“凝膠狀膜”。)的形式而獲得，但該凝膠狀膜在作為材料應用時缺乏成形性、與其它物質的混合性，此外由于生產效率低而使成本變高，因此存在作為實用材料的應用性匱乏這樣的問題。對于這樣的問題，期待一種非凝膠狀膜、作為材料的應用性優異的、分散在液體中的細菌纖維素。例如，非專利文獻1中公開了一種通過對木醋桿菌sucrofermentans亞種(acetbacterxylinumsubsp.sucrofermentans)進行通氣攪拌培養而獲得的細菌纖維素，此外，非專利文獻2中公開了一種在添加了羧甲基纖維素(cmc)的培養基中對木葡糖酸醋桿菌(gluconacetobacterxylinum)jcm10150株進行旋轉振蕩培養而獲得的細菌纖維素。現有技術文獻非專利文獻非專利文獻1：吉永等、化學和生物、vol.35、no.11、第7～14頁、1997年非專利文獻2：s.warashina等、纖維素學會第17次大會2010celluloser&d講演要旨集、第98頁、2010年技術實現要素：發明要解決的課題但是，從并非使用添加了具有細菌纖維素的分散性提高效果的cmc的培養基而生產、以及在水中分散為“小的粒狀或纖維狀”(同一文獻；第9頁右欄)的記載可知，非專利文獻1所述的細菌纖維素在水中的分散性并不高。因此，在用于實用化的成形性、與其它物質的混合性方面并不充分。此外，非專利文獻2所述的細菌纖維素在向cmc培養基的添加量為0.5％、1％、2％時，任一情況下，含有該細菌纖維素的水均是下部的白濁性高于上部、觀察到沉淀，并且纖維素粒子為能夠目視辨認的程度的大小(同一文獻；fig.1)，因此在水中的分散性不高。因此，在實用化中所必須的成形性、與其它物質的混合性方面并不充分。因此，非專利文獻1及非專利文獻2任一文獻中所述的細菌纖維素作為材料的成形性、與其它材料的混合性均不充分，在材料的生產效率方面也缺乏實用性。本發明是為了解決這樣的問題而做出的發明，其目的在于提供一種在液體中的分散性高、實用化中的成形性和與其它材料的混合性均良好、作為實用材料的應用性優異的細菌纖維素及生產該細菌纖維素的細菌。用于解決課題的手段本發明人進行了深入研究，結果發現，如下獲得的細菌纖維素在水中具有高分散性，由此完成了下述各發明：所述細菌纖維素通過將作為新的菌株的siid9587株(保藏號nitebp-01495)(以下，有時稱為“nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)”。)在含cmc的培養基中攪拌培養而獲得，所述siid9587株以由植物油制造生物柴油燃料時產生的含甘油的副產物(biodieselfuelby-product；bdf-b、廢甘油)、試劑甘油或糖蜜為碳源的中間葡糖醋桿菌。(1)本發明的細菌纖維素具有如下物性：含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細菌纖維素的水的波長500nm的光透過率為35％以上。(2)本發明的細菌纖維素進而具有如下物性：在下述i)～vi)的條件下進行的凝膠滲透色譜的色譜圖的峰頂(ピ一クトツプ)的保留體積為2.5ml以上且小于3.0ml。i)柱：填充有粒徑為9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的內徑為6.0mm及長度為15cm的柱、ii)保護柱：內徑為4.6mm、長度為3.5cm、iii)柱溫度：35℃、iv)送液速度：0.07ml/分鐘、v)洗脫液：40～42％(w/w)四丁基氫氧化磷水溶液、vi)洗脫液中的細菌纖維素的終濃度：0.2％(w/w)。(3)本發明的細菌纖維素，優選將bdf-b同化而生產。(4)本發明的細菌纖維素，優選將選自砂糖、制造砂糖時產生的含有蔗糖的副產物及它們的水解物、以及異構化糖中的1或2種以上同化而生產。(5)本發明的細菌纖維素是將制造砂糖時產生的含有蔗糖的副產物同化而生產的情況下，前述副產物優選為糖蜜。(6)本發明的細菌纖維素也可以利用中間葡糖醋桿菌(gluconacetobacterintermedius)而生產。(7)本發明的細菌纖維素也可以利用中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號nitebp-01495)而生產。(8)本發明的細菌的特征在于，生產前述(1)～(5)中任一項所述的細菌纖維素。(9)本發明的細菌也可以是生產前述(1)～(5)中任一項所述的細菌纖維素的中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號nitebp-01495)。發明的效果根據本發明的細菌纖維素，可以獲得幾乎均一分散在水等液體中的細菌纖維素，該細菌纖維素由于成形性、與其它物質的混合性優異，因此可以有助于最終制品的品質、生產效率的提高或生產成本的降低。此外，根據本發明，可以獲得無需利用混合器進行微細化等工序而通過溫和條件下的精制即可幾乎均一地分散在液體中的細菌纖維素，可以獲得具有較大的平均分子量的細菌纖維素。進而，根據本發明，通過利用bdf-b、糖蜜等制造砂糖時產生的含有蔗糖的副產物作為碳源，有助于資源的有效利用且可以實現細菌纖維素的低價格化。此外，根據本發明還使用中間葡糖醋桿菌或中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)進行生產，由此可以高效率地獲得大量的細菌纖維素。附圖說明圖1是表示分離將bdf-b同化而生產細菌纖維素的細菌的步驟的圖。圖中，細菌纖維素簡記為bc。圖2-1是示出siid9587株和中間葡糖醋桿菌tf2株的16srdna堿基序列的一致點及不同點的圖。圖中，堿基序列的一致點用*標記來表示，不同點用方框圍住來表示。此外，圖中，g.intermedius表示中間葡糖醋桿菌tf2株。圖2-2為示出siid9587株和中間葡糖醋桿菌tf2株的16srdna堿基序列的一致點及不同點的圖。圖中，堿基序列的一致點用*標記來表示，不同點用方框圍住來表示。此外，圖中，g.intermedius表示中間葡糖醋桿菌tf2株。圖3是示出siid9587株的細菌學性狀的圖。圖4是示出對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行靜置培養而獲得的細菌纖維素(上段圖)、以及將bdf-b及試劑甘油作為碳源進行通氣攪拌培養而獲得的生產物(中段圖及下段圖)的ir譜圖的圖。圖5是示出分別包含對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行通氣攪拌培養及進行靜置培養而獲得的細菌纖維素(左圖及中央圖)、以及來自紙漿的細菌纖維素納米纖維(右圖)的水的外觀的圖。圖6是示出含有分別將糖蜜及試劑甘油作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行通氣攪拌培養而獲得的細菌纖維素的水的波長500nm的光透過率以及細菌纖維素的生產量(bc生產量)及生產速度(bc生產速度)的圖。圖7是示出含有對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)、以及作為已知的細菌纖維素生產菌的漢森葡糖醋桿菌(g.hansenii)atcc23769株、木葡糖醋桿菌(g.xylinus)atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株進行通氣攪拌培養而獲得的細菌纖維素的水的波長500nm的光透過率、以及bc生產量、bc生產速度及bc生產速度的比率的圖。圖8是示出將bdf-b作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行旋轉培養的而獲得的細菌纖維素(樣品b)、來自紙漿的纖維素納米纖維(來自紙漿的cnf液)及普魯蘭多糖的凝膠滲透色譜的色譜圖的圖。圖9是示出對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行通氣攪拌培養(攪拌培養bc液)及靜置培養(混合器處理靜置培養bc液)而獲得的細菌纖維素的纖維寬度及利用透射型電子顯微鏡獲得的觀察圖像的圖。圖10為示出對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行通氣攪拌培養而獲得的細菌纖維素(攪拌培養bc液)及來自紙漿的纖維素納米纖維(來自紙漿的cnf液)的利用透射型電子顯微鏡獲得的觀察圖像的圖。圖11為示出對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行通氣攪拌培養而獲得的細菌纖維素(攪拌培養bc液)及來自紙漿的纖維素納米纖維(來自紙漿的cnf液)的利用偏光顯微鏡獲得的觀察圖像的圖。圖12為示出將試劑甘油或bdf-b作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以及作為已知的細菌纖維素生產菌的漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株及木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株進行靜置培養而獲得的細菌纖維素的重量的圖。圖13為示出將試劑甘油或bdf-b作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以及作為已知的細菌纖維素生產菌的atcc53582株及atcc23769株進行振蕩培養而獲得的細菌纖維素的重量的圖。具體實施方式以下，對本發明的細菌纖維素及生產該細菌纖維素的細菌進行詳細說明。本發明中的細菌纖維素是指利用細菌生產的纖維素。本發明中，細菌纖維素“分散”在水等液體中是指，細菌纖維素漂浮或懸浮在液體中。此外，分散性高是指，作為分散介質的細菌纖維素在液體中的粒徑、纖維寬度較小、作為分散介質的細菌纖維素較均一地漂浮或懸浮在液體中等。本發明的細菌纖維素具有幾乎均一地分散在液體中的程度的高分散性。這里，使細菌纖維素分散的液體可以使用有機溶劑及水系溶劑中的任一種，優選水系溶劑。細菌纖維素的分散性的高低例如可以測定光透過率作為指標，存在光透過率越大則分散性越高、光透過率越小則分散性越低這樣的關系。光透過率可以通過將含有規定濃度的細菌纖維素的水供于分光光度計并照射規定波長的光、對透過的光的量進行測定而求出。本發明的細菌纖維素具有如下性質：含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細菌纖維素的水的波長500nm的光透過率為35％以上。這里，作為本發明中的含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細菌纖維素的水的波長500nm的光透過率，除了為35％以上，還可以列舉例如36％以上、37％以上、38％以上、39％以上、40％以上、35％以上且99％以下，36％以上且99％以下，37％以上且99％以下，38％以上且99％以下，40％以上且99％以下，35％以上且95％以下，36％以上且95％以下，37％以上且95％以下，38％以上且95％以下，40％以上且95％以下，35％以上且90％以下，36％以上且90％以下，37％以上且90％以下，38％以上且90％以下，40％以上且90％以下，35％以上且85％以下，36％以上且85％以下，37％以上且85％以下，38％以上且85％以下，40％以上且85％以下，35％以上且80％以下，36％以上且80％以下，37％以上且80％以下，38％以上且80％以下，40％以上且80％以下等。此外，本發明的細菌纖維素可以具有與來自紙漿的纖維素納米纖維等來自植物的纖維素相比大的平均分子量。纖維素的平均分子量可以例如測定凝膠滲透色譜的色譜圖作為指標，存在所述色譜圖的峰頂的保留體積越大則平均分子量越小、保留體積越小則平均分子量越大這樣的關系。即，本發明的細菌纖維素還可以具有如下物性：在下述i)～vi)的條件下進行的凝膠滲透色譜的色譜圖的峰頂的保留體積為2.5ml以上且小于3.0ml。i)柱為填充有粒徑為9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的內徑為6.0mm及長度為15cm的柱、ii)保護柱的內徑為4.6mm、長度為3.5cm、iii)柱溫度為35℃、iv)送液速度為0.07ml/分鐘、v)洗脫液為40～42％(w/w)四丁基氫氧化磷水溶液、vi)洗脫液中的細菌纖維素的終濃度為0.2％(w/w)。此外，本發明的細菌纖維素例如可以通過在含有適當碳源的培養基中培養細菌使其生產細菌纖維素而制造。這里，作為碳源，可以列舉例如葡萄糖、果糖等單糖，蔗糖、麥芽糖、乳糖等二糖，低聚糖、砂糖、制造砂糖時產生的含有蔗糖的副產物、它們的水解物、異構化糖、淀粉水解物等糖類以及甘露糖醇、乙醇、乙酸、檸檬酸、甘油、bdf-b等，可以根據細菌的種類、培養條件、制造成本等適當設定。予以說明的是，bdf-b的常規組成是甘油41.5％、脂肪酸21.4％、甲醇12.4％、強熱殘留成分6.3％、其它18.4％(財團法人日本食品分析中心)，是大量地含有能夠用作細菌的碳源的甘油的組合物。這里，砂糖是指以蔗糖為主成分的甘味料(廣辭苑第6版)，在本發明中既可以是化學合成品，也可以是以甘蔗、甜菜(糖蘿卜)、糖槭、桄榔(sugarpalm)、高粱(sweetsorghum)等天然物質為原料而制造的砂糖。作為本發明中的砂糖，可以列舉例如紅糖、白糖、粗糖(cassonade)(紅糖)、和三盆、楓糖等未分蜜糖以及粗糖、精制糖等分蜜糖。作為精制糖，可以列舉例如白雙糖(shirozarasugar)、粗晶軟糖(coarsecrystalmediumsoftsugar)、細白砂糖(castersugar)等砂糖，上白糖、幼砂糖等綿白糖(softsugar)，方糖、冰糖、粉砂糖、顆粒糖等加工糖以及液體糖等。此外，制造砂糖時產生的含有蔗糖的副產物是指，在砂糖的制造工序中產生的副產物中的含有蔗糖的副產物，具體而言，可以列舉例如上述的甘蔗、甜菜等天然原料的榨渣、糖蜜、利用過濾和/或離子交換樹脂進行的精制工序中產生的殘渣。此外，二糖、低聚糖、砂糖、制造砂糖時產生的含有蔗糖的副產物的水解物是指，在酸性溶液中對二糖、低聚糖、砂糖、制造砂糖時產生的含有蔗糖的副產物進行加熱等水解處理而獲得的物質。碳源以外的培養基成分可以使用與細菌培養中使用的公知的培養基同樣的成分，優選含有cmc。具體而言，可以列舉例如含有cmc、氮源、無機鹽類、以及根據需要而含有的氨基酸、維生素等有機微量營養素的常規營養培養基，作為氮源，可以列舉硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等銨鹽，硝酸鹽、尿素、蛋白胨等有機或無機的氮源。此外，作為無機鹽類，可以列舉磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等，作為有機微量營養素，可以列舉氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸、以及包含這些營養素的蛋白胨、水解酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白水解物等，在使用生育中需要氨基酸的營養要求性變異株時，還可以進一步補充所要求的營養素。此外，作為細菌，只要是能生產細菌纖維素的細菌則沒有特別限定，優選可以通過攪拌培養、通氣培養生產細菌纖維素的細菌，更優選同化bdf-b的細菌。具體而言，可以列舉例如醋桿菌屬細菌、葡糖醋桿菌屬細菌、假單胞菌屬細菌、土壤桿菌屬細菌、根瘤菌屬細菌、腸桿菌屬細菌等，更具體而言，可以列舉中間葡糖醋桿菌、漢森葡糖醋桿菌、斯氏葡糖醋桿菌(gluconacetobacterswingsii)、巴氏醋桿菌(acetobacterpasteurianus)、醋化醋桿菌(acetobacteraceti)、木醋桿菌(acetobacterxylinum)、木醋桿菌sucrofermentans亞種(acetbacterxylinumsubsp.sucrofermentans)、木醋桿菌nonacetoxidans亞種(acetbacterxylinumsubsp.nonacetoxidans)、惡臭醋桿菌(acetobacterransens)、胃八疊球菌(sarcinaventriculi)、bacteriumxyloides、腸桿菌等，這些之中，優選中間葡糖醋桿菌。進而，更具體而言，可以列舉中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號nitebp-01495)、木葡糖醋桿菌atcc53582株、漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、斯氏葡糖醋桿菌bpr3001e株、木醋桿菌jcm10150株、腸桿菌cjf-002株等，這些之中，優選中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號nitebp-01495)。作為培養方法，可以列舉例如攪拌培養、通氣培養等。作為攪拌培養，具體而言，可以列舉使用了發酵罐的不進行通氣的培養(無通氣攪拌培養)、使用了發酵罐的進行通氣的培養(通氣攪拌培養)、使用了帶槳葉的燒瓶的左右搖動的培養(振蕩培養)、使用了帶槳葉的燒瓶的旋轉式培養(旋轉培養)等。此外，培養條件可以設定為上述細菌的培養中所使用的公知的培養條件，可以列舉例如通氣量為1～10l/分鐘、轉速為100～800rpm、溫度為20～40℃、培養期為1天～7天的培養條件。此外，在本發明的細菌纖維素的制造中，可以根據需要進行碳源的前處理工序、前前培養工序、前培養工序、細菌纖維素的精制、干燥、懸浮工序等。本發明的細菌纖維素例如可以作為紙力增強劑、食品的增稠劑、懸浮穩定化劑等添加劑而使用。其次，本發明的細菌是生產前述細菌纖維素的細菌。對于在生產本發明的細菌纖維素的細菌中，與上述的本發明的細菌纖維素相同或相當的構成將省略重復說明。以下，對本發明的細菌纖維素及生產該細菌纖維素的細菌的各實施例進行說明。予以說明的是，本發明的技術范圍不受這些實施例所示特征的限定。實施例<實施例1>細菌的分離及鑒定(1)細菌的分離對同化了bdf-b而生產細菌纖維素的細菌進行了分離。具體而言，按照圖1所示的步驟，首先，以蘋果及西梅為分離源，使用在hestrin-schramm標準培養基(組成：細菌蛋白胨0.5％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、na2hpo40.27％(w/v)、檸檬酸0.115％(w/v)、葡萄糖2％(w/v)；hs培養基)中含有2％(w/v)的試劑甘油(試劑特級、和光純藥株式會社)來代替葡萄糖的培養基(hs/甘油培養基)進行富集培養。將其接種在含有纖維素染色試劑的hs/甘油培養基中，在30℃下進行平板培養，選擇出15種生產細菌纖維素的菌株。然后，將這些菌株接種到含有2％(w/v)的試劑甘油(試劑特級、和光純藥株式會社)的lb培養基(組成；胰蛋白胨1％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、氯化鈉0.5％(w/v))中，在30℃下靜置培養，使其生成凝膠狀膜。測定凝膠狀膜的干燥重量(以下稱為“干燥膜重量”。)，選擇出8種干燥膜重量大的菌株，作為同化甘油且細菌纖維素生產能力高的菌。然后，接種到含有bdf-b的lb培養基中，在30℃下進行平板培養，進而，接種到hs培養基中，在30℃下進行靜置培養，從而使其生成凝膠狀膜。選擇其中干燥膜重量大的菌株，用含有甘油的lb培養基或hs/甘油培養基進行平板培養后，用hs培養基反復進行靜置培養操作，選定一種具有bdf-b同化性、且細菌纖維素生產能力高的菌株，將其作為siid9587株。(2)細菌的鑒定按照常規方法對本實施例1(1)的siid9587株進行測序，確定了全長16srdna的堿基序列(1367bp、序列號1)。然后，在technosurugalaboratoryco.，ltd中進行了16srdna堿基序列解析及細菌學性狀試驗。[2-1]16srdna堿基序列解析16srdna堿基序列解析試驗使用apollo2.0(technosurugalaboratory社)作為軟件、使用apollodb-ba6.0(technosurugalaboratory社)及國際堿基序列數據庫(genbank/ddbj/embl)作為數據庫而進行。相對于apollodb-ba6.0的同源性檢索的結果，siid9587株的16srdna堿基序列(序列號1)相對于葡糖醋桿菌屬的16srdna堿基序列顯示高同源性，相對于中間葡糖醋桿菌tf2株(登錄號y14694)的16srdna堿基序列顯示最高同源性，同源率為99.8％。此外，在相對于genbank/ddbj/embl的同源性檢索的結果中，siid9587株的16srdna堿基序列(序列號1)也相對于葡糖醋桿菌屬的16srdna堿基序列顯示出高同源性，相對于基準株的中間葡糖醋桿菌tf2株(登錄號nr_026435)的16srdna堿基序列顯示高同源性，同源率為99.8％。予以說明的是，登錄號y14694的序列和登錄號nr_026435的序列相同。siid9587株和中間葡糖醋桿菌tf2株(登錄號y14694、nr_026435)的16srdna堿基序列較結果如圖2-1及圖2-2所示。如圖2-1及圖2-2所示，兩者間有4個堿基不同。此外，在相對于apollodb-ba6.0的同源性檢索中，在基于同源性高的排在前面的15株的16srdna堿基序列的簡易分子系統解析的結果中，siid9587株包含在由葡糖醋桿菌屬中的種形成的簇內。[2-2]細菌學性狀試驗細菌學性狀試驗的結果如圖3所示。如圖3所示，siid9587株在含5％乙酸的培養基中不生育，這一點與已知的中間葡糖醋桿菌的性狀不同，其它性狀一致(brenner等、bergey’smanualofsystematicbacteriology.vol.two.theproteobacteria，partcthealpha-，beta-，delta-，andepsilonproteobacteria.2005.springer.p72-77)。從以上的本實施例1(2)[2-1]及[2-2]的結果可知，siid9587株屬于中間葡糖醋桿菌。另一方面，如上所述，siid9587株和作為中間葡糖醋桿菌的基準株的中間葡糖醋桿菌tf2株之間，16srdna堿基序列及細菌學性狀方面存在不同點，因此可知，siid9587株是中間葡糖醋桿菌的新菌株。因此，將該菌株于平成24年(2012年)12月21日保藏在獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利微生物保藏中心(nite-ipod；日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8122號室)，保藏號為nitebp-01495。以下，將該中間葡糖醋桿菌siid9587株(保藏號nitebp-01495)稱為nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)。(3)生產物的確認進行nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)的前培養，使菌體增殖。然后，將進行前培養而獲得的培養液(前培養液)加入到hs培養基(碳源：葡萄糖)中，在30℃下進行約8天靜置培養，由此進行主培養，使其在培養基表面生成凝膠狀膜。對凝膠狀膜，按照常規方法得到紅外分光法(ir)的譜圖及x射線衍射圖并進行解析。由其結果可知，凝膠狀膜為具有i型晶體結構的纖維素。此外，按照常規方法得到掃描型電子顯微鏡圖像并進行了解析，結果表明，凝膠狀膜中，納米級的寬度的纖維素纖維(纖維素納米纖維)形成了網絡結構。由這些結果可確認nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)生產纖維素。<實施例2>通氣攪拌培養所產生的生產物的評價(1)通氣攪拌培養所產生的生產物的調制對bdf-b進行中和處理，進而進行高壓釜處理，由此獲得經過了前處理的bdf-b。調制了在含2％(w/v)的cmc(化學用、和光純藥株式會社)的hs培養基中添加試劑甘油(試劑特級、和光純藥株式會社)代替葡萄糖作為碳源的培養基、及在其中添加濃度為2％(w/v)的經過了前處理的bdf-b代替葡萄糖作為碳源的培養基，分別作為甘油主培養培養基及bdf-b主培養培養基。然后，首先進行nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)的前培養，使菌體增殖。然后，將前培養液分別接種到5l的甘油主培養培養基及bdf-b主培養培養基中，使用發酵罐在通氣量為7～10l/分鐘、轉速為200～800rpm、溫度為30℃的條件下進行通氣攪拌培養4天，由此進行主培養。在進行主培養而獲得的培養液(主培養液)中加入1％(w/v)naoh水溶液，在60℃、80rpm下振蕩4～5小時，由此溶解菌體。將其供于離心分離后，除去上清，回收沉淀物，由此除去水溶性的菌體成分。在其中加入超純水進行離心分離后除去上清，將該操作反復進行至濕潤狀態下沉淀物的ph達到7以下，由此對生產物進行精制，將其作為攪拌培養bc液。(2)利用靜置培養調制細菌纖維素通過實施例1(3)所述的方法獲得凝膠狀膜，裁切為約1cm×1cm的大小。然后，加入1％(w/v)naoh水溶液，在60℃、80strokes/分鐘下振蕩4～5小時后，在20℃下振蕩一晚。使用金屬網進行過濾，由此除去液體而回收凝膠狀膜。在其中加入超純水并在20℃下振蕩一晚，將該操作反復進行至ph達到7以下，由此進行精制后，使用混合器進行數分鐘的懸浮處理，將其作為混合器處理靜置培養bc液。(3)解析將本實施例2(1)的攪拌培養bc液及本實施例2(2)的混合器處理靜置培養bc液分別滴加到硅板上并干燥后，將其供于紅外分光光度計(ft/ir-4200、日本分光株式會社)，在累計次數32次、分辨率2cm-1或4cm-1下進行測定，獲得ir譜圖。其結果如圖4所示。如圖4所示，使用bdf-b主培養培養基及甘油主培養培養基而獲得的攪拌培養bc液的ir譜圖與混合器處理靜置培養bc液的ir譜圖為同樣形狀。由該結果可確認，以bdf-b、試劑甘油為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行攪拌培養而獲得的生產物為纖維素。<實施例3>細菌纖維素在水中的分散性(1)含細菌纖維素的水的外觀準備使用了實施例2(1)的bdf-b主培養培養基的攪拌培養bc液及實施例2(2)的混合器處理靜置培養bc液。此外，將市售的來自紙漿的纖維素納米纖維添加到水中并使其分散，將其作為來自紙漿的cnf液。將攪拌培養bc液、混合器處理靜置培養bc液及來自紙漿的cnf液靜置1天后觀察外觀。其結果如圖5所示。如圖5所示，來自紙漿的cnf液觀察到了纖維素的沉淀。此外，混合器處理靜置培養bc液觀察到了塊狀的細菌纖維素，細菌纖維素的分散狀態不均一。與此相對地，攪拌培養bc液未觀察到沉淀、塊狀的細菌纖維素，觀察到細菌纖維素均一地分散的樣子。由這些結果可知，對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行攪拌培養而獲得的細菌纖維素與來自紙漿的纖維素納米纖維、對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行靜置培養而獲得的細菌纖維素相比分散性高，在水等液體中均一地分散。(2)含細菌纖維素的水的光透過率[2-1]靜置培養的細菌纖維素及來自紙漿的纖維素的比較在實施例2(1)所述的方法中，在主培養中，使用帶槳葉的燒瓶代替發酵罐，在150rpm、溫度為30℃的條件下進行3天旋轉培養，調制攪拌培養bc液，將其作為樣品a(使用了甘油主培養培養基)及樣品b(使用了bdf-b主培養培養基)。此外，將使用了實施例2(1)的bdf-b主培養培養基的攪拌培養bc液作為樣品c、將使用了甘油主培養培養基的攪拌培養bc液作為樣品d。此外，分別準備了實施例2(2)的混合器處理靜置培養bc液及實施例3(1)的來自紙漿的cnf液。將它們的纖維素終濃度調制為0.1±0.006％(w/w)后，在比色皿中分別加入1ml，供于分光光度計(u-2001型雙光束分光光度計、株式會社日立制作所)，測定波長500nm的光透過率。比色皿使用聚苯乙烯制一次性比色皿(半微量、光路長10mm、光路寬度4mm)，參比使用超純水。其結果如表1所示。[表1]如表1所示，樣品a、b、c及d的透過率分別為74.75％、70.53％、63.82％及49.66％，與混合器處理靜置培養bc液的19.19％及來自紙漿的cnf液的12.72％相比顯著大，在大約40％以上且80％以下的范圍。[2-2]培養基中有無cmc的比較在實施例2(1)所述的方法中，分別使用含2％(w/v)cmc的hs培養基和不含cmc的hs培養基獲得攪拌培養bc液。其中，使用糖蜜代替葡萄糖來作為碳源。此外，使用糖蜜作為碳源時，在主培養第3天，培養基中的碳源幾乎變沒，因此將主培養的天數設為3天，來代替4天。然后，根據本實施例3(2)[2-1]所述的方法測定了含細菌纖維素的水的光透過率。其結果如下述表2所示。[表2]培養基中的cmc培養方法碳源透過率(％)含攪拌培養糖蜜57不含攪拌培養糖蜜18如表2所示，使用含cmc的hs培養基時的透過率為57％，與此相對，使用不含cmc的hs培養基時的透過率為18％。由以上的本實施例3(2)[2-1]及[2-2]的結果可知，含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的、用含cmc的培養基對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行攪拌培養而獲得的細菌纖維素的水的波長500nm的光透過率為40％以上且80％以下。由此可知，通過用含cmc的培養基對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行攪拌培養，從而獲得了在液體中的分散性顯著高、在液體中均一地分散的細菌纖維素。<實施例4>碳源不同的情況下的透過率及細菌纖維素的生產速度的比較利用實施例2(1)所述的方法獲得攪拌培養bc液。其中，使用糖蜜及試劑甘油代替葡萄糖來作為碳源。此外，使用糖蜜作為碳源時，將主培養的天數設為3天，來代替4天。然后，利用實施例3(2)[2-1]所述的方法測定含細菌纖維素的水的光透過率。此外，將攪拌培養bc液干燥，測定細菌纖維素的絕干重量，基于測定結果算出每1l培養基的細菌纖維素的濃度，將其作為細菌纖維素的生產量(bc生產量、g/l)。此外，算出將bc生產量除以主培養的天數而得的值，將其作為細菌纖維素的生產速度(bc生產速度、g/l/天)。其結果如圖6所示。如圖6的表及左側的棒圖所示，使用糖蜜作為碳源時的透過率為57％，與使用試劑甘油作為碳源時的57％為相同的值。由該結果可知，通過以糖蜜作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行培養，與以試劑甘油作為碳源時同樣地獲得了含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細菌纖維素的水的波長500nm的光透過率顯著高的細菌纖維素。由此表明，通過將糖蜜作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行培養，由此可獲得分散性高、在液體中均一地分散的細菌纖維素。此外，如圖6的表及右側的棒圖所示，將糖蜜作為碳源時，bc生產速度為1.48g/l/天，比以試劑甘油為碳源時的0.95g/l/天大約1.5倍。由該結果可知，通過將糖蜜作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行培養，由此可在短時間內大量獲得分散性高的細菌纖維素。<實施例5>細菌不同的情況下的透過率及細菌纖維素生產速度的比較利用實施例2(1)所述的方法獲得攪拌培養bc液。其中，使用糖蜜代替葡萄糖來作為碳源。此外，作為細菌，分別使用了nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以及作為已知的細菌纖維素生產菌的漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株。此外，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時，在主培養的第3天，培養基中的碳源幾乎變沒，因此將主培養的天數設為3天，來代替4天。另一方面，使用dsm11804株時，在主培養的第4天，培養基中的碳源的減少程度還很小，因此將主培養的天數設為5天，來代替4天。然后，利用實施例3(2)[2-1]所述的方法測定含細菌纖維素的水的光透過率。此外，利用實施例4所述的方法算出bc生產量(g/l)及bc生產速度(g/l/天)，對于透過率及bc生產速度其數值示于棒圖中。其結果如圖7所示。如圖7的表及左側的棒圖所示，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時的透過率為57％，與此相對地，使用漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株時的透過率分別為20％、33％、29％、27％、9％及13％。由該結果可知，含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的、培養nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)而獲得的細菌纖維素的水的波長500nm的光透過率比培養nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以外的菌株而獲得的含細菌纖維素的水的該透過率顯著大，為35％以上。由此可知，通過對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行培養，由此可以獲得分散性高、在液體中均一地分散的細菌纖維素。此外，如圖6的表及右側的棒圖所示，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時的bc生產速度為1.48g/l/天，與此相對地，使用漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株時的bc生產速度分別為1.05g/l/天、1.03g/l/天、1.11g/l/天、1.10g/l/天、0.42g/l/天及0.43g/l/天。即，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時的bc生產速度顯著大于使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以外的菌株時的bc生產速度。該結果表明，通過對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行培養，由此可以在短時間內大量獲得分散性高的細菌纖維素。<實施例6>細菌纖維素的分子量準備實施例3(2)的樣品a、b、c及d以及來自紙漿的cnf液作為試樣。將這些試樣冷凍干燥，加入57～59％四丁基氫氧化磷水溶液，在35℃下靜置溶解，然后加入水，使四丁基氫氧化磷的濃度為40～42％(w/w)、試樣的濃度為0.2％(w/w)。然后進行離心分離而使雜質沉淀，回收上清。將該上清在下述條件下供于凝膠滲透色譜，測定色譜圖的峰頂的保留體積。同一上清在同一條件下測定3次。其結果如表3所示，且隨機選擇的色譜圖如圖8所示。凝膠滲透色譜的條件機器：高效液相色譜(株式會社島津制作所)柱：填充有粒徑為9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的內徑為6.0mm及長度為15cm的柱(tskgelsuperawm-h：東曹公司)保護柱：內徑為4.6mm、長度為3.5cm(tskguardcolumsuperaw-h：東曹公司)柱溫度：35℃送液速度：0.07ml/分鐘樣品注入量：10μl洗脫液：40～42％(w/w)四丁基氫氧化磷水溶液洗脫液中的細菌纖維素的終濃度：0.2％(w/w)對照樣品：分子量為85.3×104的普魯蘭多糖(shodexstandardp-82)[表3]如表3及圖8所示，樣品a、b、c及d的峰頂的保留體積以平均計分別為2.79ml、2.81ml、2.82ml及2.76ml，小于來自紙漿的cnf液的3.04ml及普魯蘭多糖的3.24ml。該結果表明，對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行攪拌培養而獲得的細菌纖維素的平均分子量大于來自紙漿的纖維素，以普魯蘭多糖換算大于85.3×104。此外，如表3所示，樣品a、b、c及d的峰頂的保留體積在2.737～2.849ml的范圍，因此表明在將對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行攪拌培養而獲得的細菌纖維素在上述條件下供于凝膠滲透色譜時，色譜圖的峰頂的保留體積為2.5ml以上且小于3.0ml。<實施例7>細菌纖維素的形態(1)纖維寬度的測定準備使用了實施例2(1)的甘油主培養培養基的攪拌培養bc液及實施例2(2)的混合器處理靜置培養bc液。將它們的纖維素濃度調制為約0.001％(w/w)后，分別將10μl滴加到包覆有聚乙烯醇縮甲醛(福姆瓦)的銅網上并風干。然后，滴加5μl5％(w/v)醋酸釓水溶液，10秒后用濾紙除去多余的液體，由此進行負染色。使用透射型電子顯微鏡在加速電壓為80kv、觀察倍率為30000倍條件下觀察，基于觀察圖像測定纖維素纖維的寬度。其結果如圖9所示。如圖9所示，對于攪拌培養bc液，其纖維素纖維的寬度為17±8nm，與混合器處理靜置培養bc液的纖維素纖維的寬度55±22nm相比顯著小，且標準偏差也小。由該結果可知，對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行攪拌培養而獲得的是細菌纖維素細、纖維間的寬度偏差小的均一的纖維。(2)纖維寬度的均一性及聚集狀態的確認準備使用了實施例2(1)的bdf-b主培養培養基的攪拌培養bc液及實施例3(1)的來自紙漿的cnf液。將它們的纖維素濃度調制為約0.01％(w/w)后，將噴霧到包覆有聚乙烯醇縮甲醛的銅網上并用干燥器使其干燥的操作反復進行10次。然后，滴加5μl5％(w/v)醋酸釓水溶液，用濾紙除去多余的液體。進而，將滴加5μl的超純水后用濾紙除去多余的液體的一系列操作反復進行2次，然后風干，由此進行負染色。使用透射型電子顯微鏡，在加速電壓為80kv、觀察倍率為10000倍的條件下觀察。其結果如圖10所示。此外，使用偏光顯微鏡通過正交尼科爾棱鏡進行了觀察。其結果如圖11所示。如圖10所示，對于攪拌培養bc液觀察到較多的納米級的同等寬度的纖維素纖維，與此相對地，對于來自紙漿的cnf液則觀察到各種寬度的纖維素纖維，在較大的纖維中觀察到了纖維寬度為約500nm以上的纖維。由該結果再次確認了對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行攪拌培養而獲得的細菌纖維素為納米級的寬度均一的纖維。此外，如圖11所示，如箭頭標記所示，在來自紙漿的cnf液中明確觀察到較粗的纖維，與此相對地，對于攪拌培養bc液，在用虛線包圍的部分觀察到模糊地影像。由該結果可知，對于來自紙漿的纖維素，存在亞微纖維(submicrofiber)、微纖維等較粗的纖維，而對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進行攪拌培養而獲得的細菌纖維素為納米級的細纖維均一地分散著。<實施例8>細菌纖維素生產能力的評價(1)靜置培養中的生產能力調制在lb培養基中添加了經過了前處理的bdf-b及試劑甘油代替葡萄糖來作為碳源的培養基，作為lb/bdf-b培養基及lb/甘油培養基。將nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)、木葡糖醋桿菌atcc53582株、漢森葡糖醋桿菌atcc23769株及木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株接種到lb/甘油培養基及lb/bdf-b培養基中，在30℃下進行7天靜置培養，由此使其生成凝膠狀膜。在其中加入1％(w/v)naoh水溶液并進行高壓釜處理，將該操作反復進行至凝膠狀膜變為白色。然后，將加水進行高壓釜處理的操作反復進行至ph為7以下，進行精制。精制后，測定干燥而獲得的細菌纖維素的絕干重量。其結果如圖12所示。如圖12所示，在lb/甘油培養基及lb/bdf-b培養基中的任一培養基中，漢森葡糖醋桿菌atcc23769株的細菌纖維素的重量均小。此外，木葡糖醋桿菌atcc53582株及木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株在lb/甘油培養基中細菌纖維素的重量較大，但在lb/bdf-b培養基中沒有確認到細菌纖維素的生產。與此相對地，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)在lb/甘油培養基及lb/bdf-b培養基中的任一培養基中細菌纖維素的重量為同等大小。這些結果表明，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)不僅可將試劑甘油為碳源，也可將bdf-b作為碳源，通過靜置培養有效地生產細菌纖維素。可將bdf-b作為碳源生產細菌纖維素的特征是其它比較株所不具有的特征，在可利用副產物的實用方面也是有利的，且非常有助于降低生產成本。(2)攪拌培養中的生產能力在10ml的hs培養基中接種nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)、atcc53582株及atcc23769株，在30℃下進行3天靜置培養，由此進行前前培養。然后，將進行前前培養而獲得的培養液接種在10ml的hs培養基中，在30℃下進行3天靜置培養，由此進行前培養。然后，在帶槳葉的三角燒瓶中裝入100ml的實施例2(1)的甘油主培養培養基及bdf-b主培養培養基，對各菌株接種相當于相同菌體數的量的前培養液，在150rpm、30℃的條件下進行3天振蕩培養，由此進行主培養。然后，利用實施例2(1)所述的方法對主培養液中的細菌纖維素進行精制。其中，在60℃、80rpm下振蕩4～5小時后，再在20℃下振蕩一晚。使精制后的細菌纖維素干燥后測定絕干重量。其結果如圖13所示。如圖13所示，木葡糖醋桿菌atcc53582株在甘油主培養培養基及bdf-b主培養培養基中的任一培養基中均沒有確認到細菌纖維素的生產。此外，漢森葡糖醋桿菌atcc23769株，在甘油主培養培養基中細菌纖維素的絕干重量較大，但在bdf-b主培養培養基中沒有確認到細菌纖維素的生產。與此相對地，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)在甘油主培養培養基及bdf-b主培養培養基中的任一培養基中，細菌纖維素的絕干重量均大。該結果表明，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)不僅可將試劑甘油作為碳源，也可將bdf-b作為碳源，不僅可通過靜置培養也可通過攪拌培養而有效地生產細菌纖維素。當前第1頁12