【技術領域】

本發明涉及生物技術和植物轉基因技術領域，具體涉及一種提高植物直鏈淀粉含量和降低支鏈淀粉含量的方法及應用。

背景技術：

薯類植物主要指具有可供食用塊根或地下莖的一類陸生作物。有塊根、塊莖類，如番薯(紅薯、甘薯)、木薯、馬鈴薯、薯蕷(山藥)、腳板薯等，多行無性繁殖，只留薯塊作種，并可以用藤本進行繁殖。這類植物一般耐寒力較弱，多在無霜季節栽培，低溫會抑制薯類作物的生長，造成塊根或塊莖的減產，因此種植薯類作物盡量避免長時間的低溫期；此外，疏松、肥沃、深厚的土壤和多量鉀肥有利于提高薯類作物產量及品質。

淀粉作為重要的糧食和工業原材料在國民生產中具有重要的意義。淀粉的組成包含直鏈淀粉和支鏈淀粉兩大部分。直鏈淀粉是d-葡萄糖基以α-(1,4)糖苷鍵連接的多糖鏈，分子中有200個左右葡萄糖基，分子量1～2×105，聚合度990，空間構象卷曲成螺旋形，每一回轉為6個葡萄糖基。支鏈淀粉分子中除有α-(1，4)糖苷鍵的糖鏈外，還有α-(1，6)糖苷鍵連接的分支，分子中含300～400個葡萄糖基，分子量>2×107，聚合度7200，各分支也都是卷曲成螺旋形。不同直鏈淀粉含量的淀粉在工業運用和食品加工中具有極大地差異。

因此，研究薯類植物淀粉的組成和性質，找到調節儲藏根性狀的關鍵性因素，是本領域研究的重點。

技術實現要素：

本發明的目的在于針對現有技術的缺陷和不足，提供一種提高植物直鏈淀粉含量和降低支鏈淀粉含量的方法及應用。

本發明所述的提高植物直鏈淀粉含量和降低支鏈淀粉含量的方法及應用，它采用如下的方法步驟：

步驟一：利用crispr/cas9多元系統編輯薯類植物sbei或者sbeii基因；

步驟二：步驟一中所述的crispr/cas9多元系統包括：系統中含有一個、兩個及兩個以上的sgrna序列的crispr/cas9系統；

步驟三：步驟二中的所述的crispr/cas9多元系統的sgrna核苷酸序列選自下組：

(a)如seqidno：1或者seqidno：3核苷酸序列中的核酸序列；

(b)將seqidno：1或者seqidno：3核苷酸序序列經過一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)核苷酸功能的由(a)衍生的核酸序列；

(c)或者與(a)限定的核酸序列有70％以上同源性且具有(a)核酸功能的由(a)衍生的多核酸序列；

步驟四：步驟一中所述的對sbei或者sbeii基因的編輯包括如下方面：

(a)對sbei或者sbeii基因所在基因組區域的編輯或對包含sbei或者sbeii基因所在基因組區域的編輯

(b)對(a)中所述編輯包括：單個或多個核酸位點的取代、缺失或添加；

步驟五：終止植物中sbei或者sbeii多肽的表達或終止有生物功能的sbei或者sbeii多肽的形成，從而提高薯類植物儲藏根中直鏈淀粉含量，降低支鏈淀粉的含量；以及調節薯類植物儲藏根重量、直徑或數目；

步驟六：從終止sbei或者sbeii多肽的表達或終止有生物功能的sbei或者sbeii多肽的形成后的植物中選擇出相較調節前植物而言性狀獲得變化的植物，包括：直接產生的較調節前而言性狀獲得變化的植物；雜交或者自交產生的有外源基因的相較調節前植物而言性狀獲得變化的植物；雜交或者自交產生的無外源基因的相較調節前植物而言性狀獲得變化的植物；

進一步地，所述薯類植物包括：木薯，甘薯、馬鈴薯、山藥、芋頭、葛根、魔芋、洋姜或雪蓮果。

進一步地，編輯所述sbei或者sbeii核苷酸序列的sgrna靶向sbei或者sbeii基因組核苷酸序列；較佳地，靶向sbei基因組的第1939-1958位和2948-2967位；或者sbeii基因組序列的1-20位和1193-1212位。

采用上述結構后，本發明有益效果為：本發明所述的提高植物直鏈淀粉含量和降低支鏈淀粉含量的方法及應用，它利用多元sgrna介導的crispr/cas9技術定向編輯木薯基因組中sbei或者sbeii基因序列，可以顯著改變薯類植物的淀粉組成和性狀，具有能提高薯類植物淀粉中直鏈淀粉含量；降低薯類植物淀粉中支鏈淀粉；以及調節薯類植物儲藏根重量、直徑或數目；并且通過雜交或者自交可獲得不含外源基因片段的新品系，在植物品質的遺傳改良上具有良好的應用前景。

【附圖說明】

此處所說明的附圖是用來提供對本發明的進一步理解，構成本申請的一部分，但并不構成對本發明的不當限定，在附圖中：

圖1是sgrna在sbei或者sbeii基因組序列中位置示意圖。

圖2是crispr/cas9系統多元載體示意圖。

圖3是轉基因植株southernblot鑒定。

圖4是crispr/cas9轉基因植株pcr檢測結果。

圖5是雙元crisr/cas9基因編輯效果檢測。

圖6是用多元sgrna介導的crisr-cas9技術改造木薯后直鏈淀粉含量。

【具體實施方式】

下面將結合附圖以及具體實施例來詳細說明本發明，其中的示意性實施例以及說明僅用來解釋本發明，但并不作為對本發明的限定。

本發明中，對各附圖進行具體陳述，如下：

圖1是sgrna在sbei或者sbeii基因組序列中位置示意圖。灰色方框區為外顯子區，黑色線區是內含子區。

圖2是crispr/cas9系統多元載體示意圖。其中sgrna-cas9是中間過渡載體；pcambia1301s為終表達載體。sgrna1、sgrna2利用擬南芥u6啟動子啟動；cas9基因由擬南芥ubq啟動子啟動，帶有flag標簽。終載體中帶有潮霉素抗性基因：hygii，以camv35s啟動子啟動。

圖3是轉基因植株southernblot鑒定。mark：λ-hindiiimarker，基因組dna通過hindiii酶切，瓊脂糖膠分離、轉膜后用潮霉素探針雜交，紅色字體為單拷貝植株。dna提取材料為溫室盆栽苗葉片。sbei-cas9是sbei轉基因植株結果；sbeii-cas9是sbeii轉基因植株結果

圖4是crispr/cas9轉基因植株pcr檢測結果。m:dl2000plusmarker；wt:野生型對照組；l系列：轉基因系列株系。dna提取材料為溫室盆栽苗葉片，pcr擴增后瓊脂糖膠凝膠電泳分離，為待選株系。

圖5是雙元crisr/cas9基因編輯效果檢測。dna提取材料為溫室盆栽苗葉片，pcr擴增后瓊脂糖膠凝膠電泳分離，測序；

a:megbssisbei-sg-1表示pcr產物中大片段測序結果中megbssisbei-cas9雙元體系中sgrna1位點的基因編輯結果；megbssisbei-sg-2表示megbssisbei-cas9雙元體系中sgrna2位點的基因編輯結果。mesbei-sg-out或者sbeii-sg-out表示pcr中小片段的測序結果，即敲除目的基因后測序結果。“--”表示核酸被刪除；灰色為原始序列。mesbeii與mesbei相同；

圖6、用多元sgrna介導的crisr-cas9技術改造木薯后直鏈淀粉含量。取種植室外大田生長六個月的野生型和轉基因植株，提取淀粉，測定直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。wt:野生型木薯淀粉；mesi系列：多元sgrna介導的crisr-cas9系統編輯mesbei后的轉基因植株。mesii系列:多元sgrna介導的crisr-cas9系統編輯mesbeii后的轉基因植株。

如圖1-圖6所示，本具體實施方式所述的提高植物直鏈淀粉含量和降低支鏈淀粉含量的方法及應用，它采用如下的方法步驟：

步驟一：利用crispr/cas9多元系統編輯薯類植物sbei或者sbeii基因；

步驟二：步驟一中所述的crispr/cas9多元系統包括：系統中含有一個、兩個及兩個以上的sgrna序列的crispr/cas9系統；

步驟三：步驟二中的所述的crispr/cas9多元系統的sgrna核苷酸序列選自下組：

(a)如seqidno：1或者seqidno：3核苷酸序列中的核酸序列；

(b)將seqidno：1或者seqidno：3核苷酸序序列經過一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)核苷酸功能的由(a)衍生的核酸序列；

(c)或者與(a)限定的核酸序列有70％以上同源性且具有(a)核酸功能的由(a)衍生的多核酸序列；

步驟四：步驟一中所述的對sbei或者sbeii基因的編輯包括如下方面：

(a)對sbei或者sbeii基因所在基因組區域的編輯或對包含sbei或者sbeii基因所在基因組區域的編輯

(b)對(a)中所述編輯包括：單個或多個核酸位點的取代、缺失或添加；

步驟五：終止植物中sbei或者sbeii多肽的表達或終止有生物功能的sbei或者sbeii多肽的形成，從而提高薯類植物儲藏根中直鏈淀粉含量，降低支鏈淀粉的含量；以及調節薯類植物儲藏根重量、直徑或數目；

步驟六：從終止sbei或者sbeii多肽的表達或終止有生物功能的sbei或者sbeii多肽的形成后的植物中選擇出相較調節前植物而言性狀獲得變化的植物，包括：直接產生的較調節前而言性狀獲得變化的植物；雜交或者自交產生的有外源基因的相較調節前植物而言性狀獲得變化的植物；雜交或者自交產生的無外源基因的相較調節前植物而言性狀獲得變化的植物；

作為本發明的一種優選，所述薯類植物包括：木薯，甘薯、馬鈴薯、山藥、芋頭、葛根、魔芋、洋姜或雪蓮果。

作為本發明的一種優選，編輯所述sbei或者sbeii核苷酸序列的sgrna靶向sbei或者sbeii基因組核苷酸序列；較佳地，靶向sbei基因組的第1939-1958位和2948-2967位；或者sbeii基因組序具列的1-20位和1193-1212位。

本設計中，經過深入的研究，發現通過crispr/cas9多元系統編輯薯類植物基因組中sbei或者sbeii基因，調節sbei或者sbeii多肽在薯類植物中的表達，可以顯著調節薯類植物的儲藏根的發育性狀可以顯著調節薯類植物的直鏈淀粉含量，在植物淀粉品質的遺傳改良上具有良好的應用前景。

本發明各術語陳述如下：

本設計中的“薯類植物”也稱為“薯類作物”，主要指具有可供食用塊根或地下莖的一類的陸生作物。包括但不限于：大戟科的塊根植物如木薯、旋花科的塊根植物如甘薯，茄科的塊莖植物如馬鈴薯，薯蕷科的塊根植物如山藥，天南星科的塊莖植物如芋頭、魔芋，豆科塊根植物如葛根，菊科塊莖植物如洋姜，雪蓮果等。

本發明包括crispr/cas9多元載體系統。如本文所用，術語“多元”是指帶有一個、兩個或多于兩個基本上保持本發明中sbei或者sbeii核苷酸序列中的sgrna序列相同的生物學功能或活性的核苷酸序列。多元可以是(i)一個、兩個或兩個以上的sgrna均來自于seqidno:1或者seqidno:3所在區域，或(ii)一個、兩個或兩個以上的sgrna至少有一個來自于seqidno:1或者seqidno:3所在區域，或(iii)一個、兩個或兩個以上的sgrna均來自seqidno:1或者seqidno:3所在區域以外，但敲除或編輯區域包含seqidno:1seqidno:3。

任何一種sbei或者sbeii基因組來源的sgrna的生物活性核苷酸片段都可以應用到本發明中。在這里，sgrna的生物活性片段的含義是指作為一種核苷酸序列，其仍然能保持正常的sgrna的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％的正常的sgrna的活性。在更優選的條件下，所述活性片段能夠保持全長sbei或者sbeii多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本發明的sgrna序列可以是(i)sbei或者sbeii基因組中內含子區域中的核苷酸序列或者有一個或多個核苷酸被取代的但仍具有本發明中sgrna功能的核苷酸序列或(ii)sbei或者sbeii基因組中外顯子區域中的核苷酸序列或者有一個或多個核苷酸被取代的但仍具有本發明中sgrna功能的核苷酸序列或(iii)突變或者敲除區域包含本發明中sbei或者sbeii基因組整個或者部分區域的核苷酸序列或者有一個或多個核苷酸被取代的但仍具有本發明中sgrna功能的核苷酸序列。根據本文的定義這些多元、sgrna屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。

在本發明中，術語“sbei或者sbeii基因組”指具有生物活性的seqidno:1或者seqidno:3序列的多核苷酸。該術語還包括具有與sbei或者sbeii核苷酸相同功能的seqidno:1或者seqidno:3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：若干個(通常為1-150個，較佳地1-90個，更佳地1-60個，最佳地1-30個，還更佳如1-24個、1-15個)核苷酸的缺失、插入和/或取代。例如，在本領域中，不同品種來源的木薯sbei或者sbeii基因組序列存在多態性，通常不會改變核苷酸序列的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一個或數個標簽序列通常也不會改變核算序列的功能。

sbei或者sbeii核苷酸序列的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與sbei或者sbeii核酸序列雜交的dna序列。

任何與所述的sbei或者sbeii基因序列同源性高(比如與seqidno:1或者seqidno:3所示的序列的同源性為70％或更高；優選的，同源性為80％或更高；更優選的，同源性為90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有sbei或者sbeii基因序列相同功能的核酸序列也包括在本發明內。

應理解，雖然本發明的sbei或者sbeii基因序列優選獲自木薯，但是獲自其它植物的與木薯sbei或者sbeii基因序列高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多核苷酸也在本發明考慮的范圍之內。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的，例如blast。

本發明還涉及編碼本發明sbei或者sbeii多肽或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。dna可以是單鏈的或是雙鏈的。dna可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與seqidno:1或者seqidno:3所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有seqidno:2或者seqidno:4的蛋白質，但與seqidno:1或者seqidno:3所示的編碼區序列有差別的核酸序列。

編碼seqidno:2或者seqidno:4的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。

術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼所述多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。

本發明的sbei或者sbeii基因序列全長序列或其片段通常可以用pcr擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于pcr擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cdna庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cdna庫作為模板，擴增而得有關序列。

本發明也涉及包含所述的多核苷酸的載體，以及用所述的載體或sbei或者sbeii基因序列經基因工程產生的宿主細胞。

本發明還提供了一種調節薯類植物的淀粉組成和性質的方法，其方法包括調節所述薯類植物中sbei或者sbeii多肽的表達。

更優選地，所述的方法包括：編輯所述薯類植物中sbei或者sbeii基因組核苷酸序列，調節sbei或者sbeii多肽的表達(包括使終止sbei或者sbeii多肽的表達或終止有生物學功能的sbei或者sbeii多肽的形成)，從而調節薯類植物淀粉的直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，包括：提高薯類植物淀粉中直鏈淀粉含量；降低薯類植物淀粉中支鏈淀粉的含量；調節薯類植物儲藏根重量、直徑或數目。

可以采用本發明中涉及的基因編輯系統來終止sbei或者sbeii多肽的表達或終止有生物學功能的sbei或者sbeii多肽的形成。

作為本發明的一種實施方式，提供了一種通過crispr/cas9多元系統編輯薯類植物基因組中sbei或者sbeii基因，調節sbei或者sbeii多肽在薯類植物中的表達，從而提高薯類植物直鏈淀粉含量同時降低支鏈淀粉含量的方法。所述的方法包括：

(1)將攜帶sbei或者sbeii基因組sgrna的多元crispr/cas9載體分子轉入植物組織、器官或種子，獲得轉化入所述編輯功能的植物組織、器官或種子；和

(2)將步驟(1)獲得的轉入了所述攜帶sbei或者sbeii基因組sgrna的多元crispr/cas9載體分子的植物組織、器官或種子再生成植物。

作為一種優選的實例，所述的方法包括步驟：

(i)提供攜帶可編輯sbei或者sbeii基因組的載體的農桿菌，所述的載體選自下組：

(a)含有啟動的sgrna和cas9多肽的編碼基因或基因片段的載體；

(b)含有可在植物體內編輯sbei或者sbeii基因組和甘薯序列的載體；

(ii)將植物的組織或器官與步驟(i)中的農桿菌接觸，從而使所述載體轉入植物組織或器官。

較佳地，所述方法還包括：

(iii)選擇出轉入了所述載體的植物織或器官；和

(iv)將步驟(iii)中的植物組織或器官再生成植物。

基于sbei或者sbeii基因的核苷酸序列，可以設計出在導入植物體后可特性性識別sbei或者sbeii靶點的多核苷酸。設計時要考慮到特異性以及編輯的效率。本發明對sgrna序列的制備方法沒有特別的限制，包括但不限于：化學合成法，體外轉錄法等。應理解，本領域技術人員在得知了crispr/cas9多元系統的組成、sgrna序列與植物性狀的相關性以后，可以以各種途徑制備出所述的表達系統，從而用于調節植物性狀。所述的多元系統可通過轉基因技術被輸送到植物體內，或還可采用本領域已知的多種技術被輸送到植物體內。

作為本發明的特別優選的方式，提供了一種效果優異的sgrna分子，所述的分子可特異性的編輯sbei或者sbeii基因組序列；并且經驗證，其具有良好的調節sbei或者sbeii多肽生物學功能的效果。所述的sgrna分子是含有seqidno:1中第1939-1958位和2948-2967位或者seqidno:3中第1-20位和1193-1212位。

所示的核苷酸序列的分子，構成雙元系統。所述雙元系統含有兩個sgrna序列，可以在基因組中定向敲除大片段序列。所述的雙元系統在導入到植物體內后，可在基因組中兩個特異的靶點同時編輯基因組，編輯后在造成兩個靶點突變的同時還可以將兩個靶點間的核苷酸序列片段敲除。通常，所述的雙元系統位于表達載體上。

本發明還包括利用前述任一種方法獲得的植物，所述的植物包括但不限于從終止sbei或者sbeii多肽的表達或終止有生物功能的sbei或者sbeii多肽的形成后的植物中選擇出相較調節前植物而言性狀獲得變化的植物，例如：直接產生的較調節前而言性狀獲得變化的植物；雜交或者自交產生的有外源基因的相較調節前植物而言性狀獲得變化的植物；雜交或者自交產生的無外源基因的相較調節前植物而言性狀獲得變化的植物。

可采用任何適當的常規手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施所述的方法。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

具體實施例一，木薯mesbei和mesbeii基因sgrna的選擇和合成：為獲得木薯mesbei和mesbeii基因sgrna序列，本發明人利用ncbi數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找到了木薯的mesbei和mesbeii基因組核苷酸序列。mesbei全長2559bp；mesbeii全長2514bp。將此兩個基因序列通過blastp及blastn在rikencassavacdna數據庫(http://www.brc.riken.jp/inf/en/index.shtml)中搜索找到其基因組序列，mesbei全長7232bp；包含14個外顯子，編碼852個氨基酸。從基因組序列中篩選出特異的sgrna序列mesbei-sgrna1:5’-ggatggttccaaccatagga-3’；mesbei-sgrna2：5’-ccatcatcatgggatcaaca-3’，合成sgrna序列:

sgrna1：

lp:5’-gattgggatggttccaaccatagga-3’；

rp:5’-aaactcctatggttggaaccatccc-3’；

sgrna2:

lp:5’-gattgccatcatcatgggatcaaca-3’

rp:5’aaactgttgatcccatgatgatggc-3’

mesbeii全長13138bp，包含22個外顯子，編碼837個氨基酸。從基因組序列中篩選出特異的sgrna序列mesbeii-sgrna1:5’-atgggacactacaccatatc-3’；mesbeii-sgrna2：5’-aaagagtccttcctgatggt-3’，合成sgrna序列:

sgrna1：

lp:5’-gattgatgggacactacaccatatc-3’；

rp:5’-aaacgatatggtgtagtgtcccatc-3’；

sgrna2:

lp:5’-gattgaaagagtccttcctgatggt-3’

rp:5’-aaacaccatcaggaaggactctttc-3’

具體實施例二，木薯mesbei和mesbeii基因crispr/cas9雙元載體的構建及轉基因木薯的獲得：本設計中，首先通過bbsi酶切方法分別將兩個sgrna片段導入到兩個sgrna-cas9中間載體中，然后在利用kpni和xbai雙酶切將任意一sgrna導入sgrna-cas9中間載體形成雙元中間過渡載體：sgrna1-cas9-sgrna2。再將構建好的雙元中間過渡載體轉入表達載體pcambia1301s中。然后將sgrna1-cas9-sgrna2-p1301s轉入農桿菌lba4404，再通過農桿菌侵染木薯脆性懸浮愈傷，侵染后的愈傷組織通過再生、篩選等過程得到陽性植株，分別將sgrna1-cas9-sgrna2-p1301s轉基因木薯記作megbssisbei和mesbeii-cas9，分別縮寫為megimesi和mesii。如圖1、圖2所示。

具體實施例三，mesbei-cas9和mesbeii-cas9轉基因木薯的分子鑒定：通過農桿菌介導的木薯懸浮愈傷轉化，獲得轉基因植株。通過southernblot篩選最后獲得單拷貝轉基因植株，mesbei-cas9和mesbeii-cas9各選擇4個株系。

具體實施例四，mesbei或者mesbeii-cas9轉基因木薯的基因編輯檢測：為了驗證crispr/cas9的基因編輯效果，本發明人分別提取了轉基因木薯的基因組，設計擴增引物。mesbei-fp:5’-aatttggatttaatagagaagca-3’；mesbei-rp:5’-ctgtgattgctgaagatgtttc-3’通過pcr擴增單拷貝植株中mesbei的目的編輯片段。結果顯示，在mesbei-cas9系列轉基因株系中，l1/l2/l3/l4中有小片段出現(圖3)，測序結果顯示小片段為理論敲除后的序列，切在sgrna1和sgrna2的靶點出存在插入突變(圖4)；對大片段測序結果顯示，在sgrna1和sgrna2編輯位點也存在突變現象其中包括插入突變、刪除突變、替換(圖4)。說明我們的雙元系統具有很高的基因敲除效率和編輯效率。

對于mesbeii基因設計引物：mesbeii-fp:5’-ctttctttgctagaaaatcttt-3’；mesbeii-rp:5’-atatttaagtttagagtttgag-3’通過pcr擴增單拷貝植株中mesbeii的目的編輯片段。結果顯示，在mesbeii-cas9系列轉基因株系中，l4/l7/l4/l15中有小片段出現(圖3)，測序結果顯示小片段為理論敲除后的序列，切在sgrna1和sgrna2的靶點出存在插入突變(圖4)；對大片段測序結果顯示，在sgrna1和sgrna2編輯位點也存在突變現象其中包括插入突變、刪除突變、替換(圖4)。說明我們的雙元系統具有很高的基因敲除效率和編輯效率。

具體實施例四，mesbei-cas9和mesbeii-cas9轉基因木薯對淀粉組成成分的影響：在大田中，觀察野生型木薯以及mesbei-cas9和mesbeii-cas9轉基因木薯的生長、發育以及產量性狀。于四月中旬從三亞種苗庫中收獲mesbei-cas9和mesbeii-cas9轉基因木薯的種莖，在上海五厙中試試驗田中起壟，壟高50cm，壟間距為100cm，將種莖扦插于壟上，隨后鋪上地膜，在前三個月平均每周澆一次水，保持土壤潮濕，三個月以后，20天左右澆一次水，保持土壤不旱即可，并于第五個月施加一次復合肥，直至收獲。提取野生型及轉基因木薯成熟儲藏根中的淀粉，測定其直鏈淀粉含量。結果顯示野生型木薯直鏈淀粉含量為26％，在mesbei-cas9-cas9直鏈淀粉含量顯著提高，介于39％-75％之間；mesbeii-cas9-cas9中直鏈淀粉含量介于37％-64％之間。

以上所述僅是本發明的較佳實施方式，故凡依本發明專利申請范圍所述的構造、特征及原理所做的等效變化或修飾，均包括于本發明專利申請范圍內。

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