本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一個影響煙草色素含量的ntwrky69基因及其應用的專利申請。

背景技術：

煙草是雙子葉植物綱管花目茄科煙草屬植物，煙草屬(nicotiana)有60多個種，其中2個栽培種中的普通煙草(又稱紅花煙草，nicotianatabacum)占據主要面積，黃花煙草(nicotianarustica)的面積很小。栽培煙草按煙葉品質特點、生物學性狀和栽培調制方法等可分為烤煙、曬煙、晾煙、白肋煙、香料煙和黃花煙六個類型，其中烤煙是栽培最廣的普通煙草。我國烤煙種植面積和總產量均居世界第一位。

作為一種葉用經濟作物，烤煙的栽培技術有別于其它大田作物，不僅要求有一定的煙葉產量，而且更注重煙葉品質。煙葉品質決定煙葉的可用性，直接影響卷煙商品的色、香、味和商品價值，也關系到煙農的經濟效益，是煙草行業的生命和出發點。為使在未來的國內外市場競爭中立于不敗之地，滿足國內外卷煙企業對優質煙葉不斷增長的需求，必須提高煙葉品質和安全性。

植物色素是煙草中一類重要的化合物，主要包括葉綠素和類胡羅卜素類物質。葉綠素在煙草成熟和煙葉調制過程中會大量降解消失，其主要降解方式有兩種：一種方式是葉綠素由噗啉環降解產生吡咯類化合物，從而增加煙葉陳化香；另一種方式是葉綠素水解產生的植醇可進一步降解成新植二烯，并再降解成植物呋喃，轉化成煙葉的清甜成分。一般而言，葉綠素充分降解后對煙質有利，但如果不能降解完全，在干煙葉中，葉綠素就會變成一種不利的化學成分，進而使煙葉帶有明顯青雜氣。如果葉綠素在調制處理過程中沒有充分降解就把煙葉烤干，就會烤出不同程度的“青黃煙”。“青黃煙”不僅外觀品質不良，而且對于煙葉質量影響十分明顯；因而葉綠素是否降解充分是煙葉分級中被嚴格控制的指標之一。煙葉中的黃色素主要是類胡蘿卜素，煙葉中的類胡蘿卜素含量與煙葉品質存在正相關關系，一方面是煙葉外觀品質與該類成分含量直接相關；另一方面類胡蘿卜素是煙草香氣成分的重要前體物質，對煙草的香氣量和香氣品質呈正相關關系。煙葉中的香味成分很大一部分是類胡蘿卜素的降解產物，其中不少化合物是煙草中關鍵的致香成分，如紫羅蘭酮、大馬酮和異佛爾酮等。

由于煙葉中色素類物質與煙葉品質、煙葉質量關系十分緊密，因而對煙葉色素有關基因的充分和深入研究，從而對色素類物質進行有針對性調控，對于煙葉品質改善和煙葉品種改良具有十分重要的理論和應用意義。

技術實現要素：

本發明目的在于提供一個影響煙草色素含量的ntwrky69基因，從而能夠對煙草中色素類物質含量有所調控，進而為煙草質量改善奠定基礎。

本申請所采取的技術方案詳述如下。

一個影響煙草色素含量的ntwrky69基因，包括918bp堿基，其堿基序列如seqidno.1所示；其中第80-600位核苷酸是其特異性核心片段。

影響煙草色素含量的ntwrky69基因所編碼蛋白，包括305個氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述影響煙草色素含量的ntwrky69基因在煙草中的應用，該基因與煙草色素含量高度相關，將該基因沉默后，煙草中色素類物質含量明顯降低。

用于沉默影響煙草色素含量ntwrky69基因的rnai載體trv2-ntwrky69，構建方法為：以ntwrky69基因中第80-600位核苷酸作為vigs的引導序列，將此核酸片段插入trv2載體中，構建獲得trv2-ntwrky69載體。

所述用于沉默影響煙草色素含量ntwrky69基因的rnai載體trv2-ntwrky69在植物中的應用，用于沉默ntwrky69基因，進而下調植物中色素類物質表達量。

利用所述用于沉默影響煙草色素含量ntwrky69基因的rnai載體trv2-ntwrky69所構建的ntwrky69基因沉默植物新品種的培育方法，具體方法為：

通過轉基因技術、瞬時表達技術或基因組編輯技術等干擾、沉默、敲除ntwrky69基因，可獲得色素含量變化的煙草轉化植株新品種（也可采用其他載體以對ntwrky69基因進行超量表達，構建ntwrky69基因超表達轉基因植物新品種）；具體而言：

利用農桿菌介導的轉化方法，將rnai載體trv2-ntwrky69轉化植株，通過篩選、鑒定獲得ntwrky69基因沉默植株，所述ntwrky69基因沉默植株其表型為，基因沉默的轉基因植株中色素類物質含量比正常植株明顯下降。

本申請中，通過對煙草ntwrky69基因的克隆、對應蛋白的分析，發明人發現該基因在煙草色素合成途徑調控上具有重要的用途，與植物葉片中色素類物質含量高度相關。進一步通過病毒介導的基因沉默技術，發明人發現在將ntwrky69基因沉默后，新的轉基因植株中的色素類物質含量明顯降低。利用這一特性，可為煙草的基因工程育種或其他植物新品種培育提供新的策略和路徑。

附圖說明

圖1為與對照植株相比ntwrky69基因沉默植株中該基因的相對表達量；

圖2為病毒誘導ntwrky69基因沉默的煙葉及對照煙葉中的主要色素含量比較。

具體實施方式

下面結合實施例對本申請做進一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中所涉及部分生物材料、實驗試劑、實驗儀器等基本情況簡要介紹如下。

生物材料：

煙草材料，栽培煙草（nicotianatabacum）k326品種，購買于玉溪中煙種子有限責任公司；

本氏煙（nicotianabenthamiana），種子由中國農業科學院煙草研究所饋贈；

沉默煙草基因所用到的載體質粒trv2-lic、trv1、trv2、trv2-pds載體等，購買于中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心；

基因測序及引物合成由上海生工生物工程有限公司提供完成；

實驗試劑：

限制性內切酶、datp、dttp、primerstargxldnapolymerase、dna凝膠回收試劑盒minibestagarosegeldnaextractionkit、質粒dna小量純化試劑盒minibestplasmidpurificationkit、乙酰丁香酮等，均為takara生物技術有限公司產品；

t4dnapolymerase、rna提取trizol試劑等，為invitrogen公司產品；

反轉錄試劑盒，roche公司產品；

dnaase酶，fermentas公司產品；

mes，sigma公司產品；卡那霉素、利福平等抗生素購于上海生工生物工程有限公司；

部分試劑配方及配制方法簡要說明如下：

（1）lb液體培養基（1l）：10g細菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone），10g氯化鈉（nacl），5g酵母抽提物（yeastextract），高溫高壓滅菌；

（2）1m2-(n-嗎啉)乙磺酸（mes）儲備液：ddh2o溶解mes，過濾滅菌，-20℃儲存備用；

（3）200mm乙酰丁香酮（acetosyringone）儲備液：無水乙醇溶解乙酰丁香酮，-20℃儲存備用；

實驗儀器：

梯度pcr儀mastercyclerepgradient（用于克隆目的基因片段），德國eppendorf公司產品。

實施例1

本實施例主要就影響煙草色素含量的ntwrky69基因的獲得過程，簡要介紹如下。

（1）煙草rna提取及cdna合成

rna提取，具體可參考如下步驟：

以生長4周大小的栽培煙草k326幼嫩葉片為樣品，經液氮充分研磨成粉狀后，取約100mg粉末狀材料置于盛有1.0ml的trizol試劑的1.5ml離心管中，加入200μl氯仿；振蕩混勻，離心后，小心取出上層水相，轉入另一離心管中；加入500μl異丙醇，沉淀、離心分離出rna，再經75%酒精洗滌，室溫微干后，加入適當體積的rnasefree的水，充分溶解；

對所提取總rna進行dnasei處理，10μl的消化反應體系設計如下：

所提取rna，1μg；

10×reactionbufferwithmgcl2，1μl；

dnasei,rnase-free，1μl（1u）；

depc-treatedwater加至10μl；

37℃水浴中放置30min。

對上述dnasei處理后rna提取物進行cdna反轉錄，具體可參考如下操作步驟。

第一鏈合成：在無菌的0.2ml離心管中配置下列模板rna/引物混合液（7μl體系）：

模板rna(100ng/μl)，1μl；

oligo(dt)primer(50μm)，1μl；

rnasefreedh2o，5μl；

70℃保溫10min后，迅速在冰上急冷2min以上，離心數秒鐘使模板rna/引物的變性溶液聚集于離心管底部；

在上述離心管中配置如下10μl反轉錄反應液體系：

上述模板rna/引物變性溶液，7μl；

5×m-mlvbuffer，2μl；

dntp(mixture，各10mm)，0.5μl；

rnaseinhibitor（40u/μl），0.25μl；

rtasem-mlv(rnaseh-)(200u/μl)，0.25μl；

42℃保溫1h；70℃保溫15min，然后冰上冷卻，所得cdna用于后續pcr擴增。

（2）pcr擴增獲得ntwrky69基因

設計用于pcr擴增獲得ntwrky69基因全長的引物序列如下：

ntwrky69-f:5'-atggatggaagattcaata-3'，

ntwrky69-r:5'-tcagcccgtggtcccacacc-3'；

以上述步驟（1）中所制備cdna為模板，50μl擴增體系設計如下：

gxlpolymerase，1μl；

cdna，1μl；

5×gxlbuffer，10μl；

dntpmixture(10mm)，4μl；

primer-f/r，8μl；

ddh2o，26μl；

pcr反應程序為：98℃、10sec；55℃、15sec，68℃、1min；40個循環。

對pcr擴增產物進行回收、純化后，測序獲得影響煙草色素含量的ntwrky69基因序列，其堿基序列如seqidno.1所示，包括918bp堿基，其中第80-600位核苷酸是其特異性核心片段。

對該基因序列進行翻譯后，其所編碼蛋白序列如seqidno.2所示，包括305個氨基酸。

實施例2

利用實施例1中所獲得影響煙草色素含量的ntwrky69基因，發明人進一步構建了基因沉默用rnai干涉載體trv2-ntwrky69，相關構建過程簡要介紹如下。

選擇此基因中較特異的一段核酸片段（序列表seqidno.1的第80-600位核苷酸序列）為vigs的引導序列，設計引物獲得此序列。然后將此核酸片段插入vigs載體中，構建trv2-ntwrky69載體，具體構建過程為：

（1）獲得目的片段，選擇此基因中較特異的一段核酸片段（序列表seqidno.1的第80-600位核苷酸序列）為vigs的引導序列，設計引物并以實施1所獲得的基因全長為模板進行pcr擴增，獲得目的基因片段，引物序列設計如下：

ntwrky69-vi-f：5’-cgacgacaagaccctcgccgcgttccgacatgtt-3’，

ntwrky69-vi-r：5’-gaggagaagagccctcgattgacttgcgaaattgc-3’；

ntwrky69-vi-f引物5’端部分序列“cgacgacaagaccct”與ntwrky69-vi-r引物5’端部分序列“gaggagaagagccct”為trv2-lic載體的接頭序列；

pcr擴增片段長度：520bp。

（2）構建trv2-ntwrky69載體，先用限制性內切酶psti將trv2-lic質粒進行單酶切并回收酶切產物，然后用t4dna聚合酶分別對trv2-lic的單酶切產物片段與步驟（1）中所得目的片段（即ntwrky69基因特異片段）進行連接處理；

10μl連接體系設計如下：

t4dna聚合酶，1μl；

10xt4dna聚合酶buffer，1μl；

trv2-lic單酶切片段（或ntwrky69基因特異片段），7μl；

dttp，1μl；

22℃連接30min，隨后70℃、20min；

隨后將上述分別處理后的trv2-lic質粒載體片段和基因片段充分混勻，65℃、2min，再22℃、10min保溫處理；

將此連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞dh5α，在含有卡那霉素（50mg/l）的lb培養基上涂布，37℃過夜倒置培養形成單菌落，對單菌落檢測，獲得構建正確的trv2-ntwrky69重組載體。

為對植株中ntwrky69基因沉默，一般而言，需要將trv2-ntwrky69重組載體轉化農桿菌，進一步利用農桿菌介導的基因轉化方法，將trv2-ntwrky69重組載體整合進植株基因組中，從而實現對目的基因ntwrky69基因的沉默。

將trv2-ntwrky69重組載體轉化農桿菌后，一般尚需進一步篩選、鑒定以獲得用于轉化的工程菌，具體操作過程參考如下：

將trv2-ntwrky69轉化gv3301農桿菌感受態細胞后，涂布在lb平板（含50mg/l卡那霉素、50mg/l利福平）上，28℃倒置黑暗培養2~3天，挑取單菌落，并利用菌落pcr篩選攜帶ntwrky69基因片段的農桿菌單克隆；10μl的菌落pcr擴增檢測體系設計如下：

gxlpolymerase，0.2μl；

5×gxlbuffer，2μl；

dntpmixture(10mm)，0.8μl；

primer-f/r（實施例1中ntwrky69-f/r引物），1.6μl；

ddh2o，5.2μl；

菌落，0.2μl；

pcr反應程序：98℃、10sec；55℃、15sec，68℃、30sec，35個循環。

實施例3

利用實施例2所構建的含有vigs沉默載體trv2-ntwrky69的工程菌，以本氏煙草為例，發明人進一步進行了栽培試驗，以沉默植物體內影響煙草色素含量的ntwrky69基因，相關實驗過程簡要介紹如下。

（1）將煙草種子播種于育苗缽中育苗，待發芽后兩周進行分苗，種于塑料缽（10cm×10cm）中，于22℃，16h光照/8h黑暗條件下進行日常肥水管理等；生長4周，選取長勢一致幼苗分組備用；

（2）將含有trv1、trv2、trv2-ntwrky69、trv2-pds農桿菌單菌落（其他質粒構建過程參考前述構建過程即可）接入5ml的lb培養基中(含50mg/l卡那霉素、50mg/l利福平)，28℃、180r/min過夜振蕩培養至od600約為1.0；

將生長起來的菌液接種到30ml的lb液體培養基中繼續培養，28℃過夜振蕩培養至od約為2.0；

3900r/min離心15min收集農桿菌到50ml離心管中，棄上清，向各菌體中加入注射緩沖液（10mm的mes，10mm的mgcl2，250μm的乙酰丁香酮），調od值約為1.0，室溫放置3-6小時，再向trv2、trv2-ntwrky69、trv2-pds懸浮液中等體積加入trv1懸浮液，混勻；

（3）挑選長勢一致，約4-5片葉子的煙草植株，用1ml無針頭無菌注射器通過壓濾法把含有不同trv重組質粒的農桿菌懸浮液從葉片背面壓入全部展開的葉片中，使菌液充滿整個葉片，于22℃，75%空氣濕度中培養；

接種2周后，采集新生葉片提取rna，利用實時pcr檢測基因沉默效率，同時取材利用高效液相色譜法測量煙草葉片色素類物質含量。

分析結果表明，病毒誘導沉默的trv2-ntwrky69植株中ntwrky69基因的表達水平僅為對照的10%左右（結果如圖1所示），說明沉默效果顯著。trv2-ntwrky69植株中新黃質、紫黃質、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b和β胡蘿卜素雙含量與對照植株相比顯著下降（圖2和下表所示），說明ntwrky69基因與煙草色素含量相關。

ntwrky69沉默煙草植株色素含量測定（對照樣品表示空白載體對照）：

。

綜合上述結果可以看出，ntwrky69基因與植物煙葉色素含量高度相關，通過沉默ntwrky69基因，可明顯調整煙葉中的色素含量，進而可為煙草改良或其他植物新品種培育奠定基礎。

sequencelisting

<110>中國煙草總公司鄭州煙草研究院

<120>影響煙草色素含量的ntwrky69基因及其應用

<130>none

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>918

<212>dna

<213>nicotianatabacumk326

<400>1

atggatggaagattcaataacatttttttatctcatgagcaagaagattccgagaattcg60

ccggaaaacagcctcgattcgccgcgttccgacatgttcaacgataacaagatgatgact120

tctacttcctcccctaaaagaagcagaagatccatacaaaagagagtggtatcagtgcca180

attaaagaagttgaaggatcaaagatgaagggtgaaataagcatgccgccatctgattct240

tgggcatggaggaaatatggacaaaaacccatcaaaggctctccctatcctaggggatat300

tatagatgcagtagttcaaagggatgtccagcaagaaaacaagttgaaaggagccgtgca360

gaccctaacatgttagttgtgacgtattcttgtgaacataaccacccttggccggcttct420

aggaataatcaacacaatcaacgtacaactaccactacatcatgtaccaataatgcaaag480

acgaagacgaaaacattagcatcactaacagcagcagcaacaacaataataacaactacc540

aatattgtagtttcagacattgagcgcgaaaaagacacgagcaatttcgcaagtcaatcg600

gagcccaattcggatgaaaaatttaccaatctcggtgaatcttcactaattagttgcaac660

gaatttggatggttttcggattttgagtgttcttctactaccatgctagaaagtcctatt720

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151015

sergluasnserprogluasnserleuaspserproargseraspmet

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305