本發明屬于微生物技術領域，涉及一種鏈霉菌新菌種及其在消毒劑中的應用的技術領域。

技術背景

消毒是指根據不同的生產環節、對象用適宜的方法清除或殺滅畜禽體表及其生存環境中的病原微生物及其它有害微生物。在目前集約化程度越來越高的趨勢下，養殖農場疾病發病越來越復雜，動物疫病防治問題十分突出。規模化養殖場疫病的發生往往是多因素綜合作用的結果，但其中最主要的是由于外界環境中病原微生物的侵入及擴散或場內動物本身病原微生物污染擴散造成的。有效的消毒是杜絕和降低養殖場環境中的病原體，切斷疫病傳播途徑，預防和控制養殖場傳染病的重要措施之一。但是使用現有的消毒劑往往在消毒后還有殘留的耐藥致病菌，使用效果不理想，不能有效防治某些規模化養殖場疫病，如奶牛隱性乳房炎等反復發作，難以治愈，成為畜牧養殖產業的痼疾。

近年來研究發現，生物被膜是導致這些致病菌難以根除的主要原因，以生物被膜形式存在的細菌不同于浮游細菌，它們對抗生素等殺菌劑、惡劣環境及宿主免疫防御機制有很強的抗性，生物被膜內的細菌在生理、代謝、對底物的降解或利用和對環境的抵抗能力等方面都具有獨特的性質，以現有的消毒劑來對這些致病菌進行消除是很難達到理想的消毒效果的，而含有生物膜抑制劑的消毒劑可以很好地解決這一問題，大幅度提升消毒效果，利用微生物生產的生物膜抑制劑是其中一類，一些放線菌能夠產生抑制細菌生物膜形成的活性物質，如吲哚、蛋白酶類等，與傳統抗生素作用機制完全不同的是，這些活性物質在不影響病原菌生長的前提下，通過干擾病原菌生物膜形成相關基因表達來實現抑制作用。與傳統的抗菌消毒劑相比，新型生物膜抑制活性物質在一定程度上能夠緩解細菌耐藥性問題。因此，細菌生物膜形成抑制劑作為新型消毒劑成分，在預防微生物尤其生物膜感染領域具有廣闊的應用前景，但目前關于微生物生物膜抑制劑用于消毒劑的報道很少，因此需要進一步探究微生物的生物膜抑制作用，為微生物生物膜抑制提供具有生物膜形成抑制作用且性能穩定的抗性菌株，將在消毒劑領域有潛在的應用開發前景。

技術實現要素：

針對現有技術中未見有關本發明中的鏈霉菌新菌種及在消毒劑中的應用的相關報道，且現有的消毒劑在消毒后還有殘留的耐藥致病菌，使用效果不理想，不能有效防治規模化養殖場疫病的現狀，本發明旨在為消毒劑中提供具有生物膜形成抑制作用且性能穩定的抗性新的菌株。本發明通過在土壤樣品中分離篩選出一株鏈霉菌新菌種，且具有產生物酶能力較高從而其發酵液有顯著的生物膜抑制作用。通過提供一種鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260，以及該菌的發酵液在消毒劑中的應用技術方案。

本發明采用的主要技術方案：

本發明采用的土壤樣品由塔里木大學生命科學學院采自新疆硝爾庫勒湖，將采集的土壤樣品經大量篩選、優選出一批生長良好的鏈霉菌菌株，進行16srrna基因序列的測定，從中篩選出一株抑制生物膜形成能力較強的鏈霉菌的新菌種(streptomycessalilacus)。

本發明具體提供一種鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260，通過提供確定的的篩選方法，在采集的土壤樣品中分離篩選和培養，獲得一批鏈霉菌微生物菌株，從中篩選出一株抑制生物膜形成能力較強的鏈霉菌菌株trm20170601，經微生物學分類與鑒定，屬于鏈霉菌(streptomycessalilacus)中新的菌株，暫命名為streptomycessalilacustrm20170601。

具體的，本發明通過對采集土壤樣品進行分離、篩選和培養，從中篩選出一株編號為trm20170601的菌株，經微生物學分類與鑒定，該菌株屬于鏈霉菌(streptomycessalilacus)菌株。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)。地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101。保藏日期2017年6月21日，菌種保藏號為cgmccno.14260。經微生物學鑒定為鏈霉菌(streptomycessalilacus)，經過系統分類確定該菌種trm20170601規范名稱為鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)。該菌株最適生長條件為：溫度28℃，培養基采用高氏一號培養基(甘露醇10g、七水硫酸鎂1g、碳酸鈣0.2g、丙氨酸1g、磷酸氫二鉀1g、七水硫酸亞鐵0.01g、氯化鈉15g、重鉻酸鉀50mg、瓊脂粉18g、水1l、微量鹽1ml(0.001g/l)、復合維生素1ml(0.5mg/l)、ph7.2～7.4)，培養時間4d；經4d培養后，在高氏一號培養基表面，菌落呈圓形、邊緣整齊、凸起、光滑、白色、不透明、黏稠不易挑起；該菌為革蘭陽性菌、好氧、菌體桿狀、無鞭毛、有內生孢子形成。根據以上形態特征，參照《伯杰氏系統細菌學鑒定手冊》第八版和《常用細菌系統鑒定手冊》對trm20170601菌株進行形態學，生理生化鑒定，并結合分子生物學測序，初步鑒定該菌株為鏈霉菌(streptomycessalilacus)的成員，但該菌種具有新菌種鮮明特征，從其分類學角度，暫命名為鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601。

同時，本發明通過提取菌株trm20170601的總dna，采用細菌16srdnapcr擴增通用引物，進行pcr擴增，pcr產物經切膠純化后測序。將所測16srrna基因序列與genbank數據庫中的序列進行比對，結果表明：菌株trm20170601與模式菌株streptomycesmacrosporusnbrc14748^t(ab184616)最大同源為98.0％，與同屬其它菌株同源性均小于97.0％，尚不能確定其確切分類，確定為一株新菌種，從其分類學角度暫命名為streptomycessalilacus。

進一步，本發明提供一種鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液在消毒劑中的應用。通過研究在不同ph值、溫度、有機試劑處理條件下鏈霉菌(streptomycessalilacus)發酵液對抑制生物膜形成的影響，得到菌種trm20170601對生物膜形成的最佳抑制條件是ph值11，溫度60℃，經乙醚處理。

通過實施本發明具體技術指標，實現本發明內容，可以達到以下有益效果：

(1)本發明提供的鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260，具有培養條件簡單，繁殖快，遺傳特性穩定，抑制生物膜形成能力較強的優點。

(2)本發明提供的鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液在消毒劑中應用時，在ph值11，溫度60℃，經乙醚處理的條件下，抑制生物膜形成的能力最強，可以使表皮葡萄球菌相對生物膜形成能力低至10.94％，并且在殺菌試驗時作用5min后對菌懸液內表皮葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌平均殺滅對數值均＞5.00。

附圖說明

圖1所示為所示為鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260的菌落和菌體照片。

圖2所示為所示為鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260的系統發育樹狀圖。

圖3所示為溫度對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響。

圖4所示為ph值對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響。

圖5所示為有機試劑處理對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響。

具體實施方式

下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。本發明中選用的所有原輔材料(除表皮葡萄球菌atcc35984(生物膜形成陽性菌株)外，其由上海復旦大學醫學院贈送)，以及選用的菌種培養方法都為本領域熟知選用的，本發明中涉及到的％都為重量百分比，除非特別指出除外。

實施例一：鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260的分離、篩選及鑒定

1、菌種的分離和篩選

本發明所使用的鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601本發明土壤樣品由塔里木大學生命科學學院采自新疆硝爾庫勒湖，將采集的土壤樣品經大量篩選、優選出一批生長良好的鏈霉菌菌株，進行16srrna基因序列的測定，從中篩選出一株編號為trm20170601的菌株。

分離步驟：

采用微生物分離的梯度稀釋法得到一系列的梯度稀釋液，用滅菌吸管分別吸取i0^-1-10^-3稀釋度的混合菌稀釋液0.lml，分別移放到倒有高氏一號培養基的平板上，用無菌玻璃棒涂布均勻，然后倒置于28℃的恒溫培養箱中培養至長出單菌落，在無菌操作臺中以無菌接種環挑取平板上長出的單菌落接種到裝有高氏一號培養基的平板上劃線分離待長出單菌落后，再次轉入滅菌試管斜面上，每株菌每次做三個重復，置于28℃條件下培養3-5天。利用透過光、反射光及暗背景的光線觀察菌落的一致性，涂片染色用光學顯微鏡觀察菌體的一致性，經多次反復分離純化直到菌落及個體均勻一致后備用。

2、菌株的培養條件

(1)編號為trm20170601的菌株的生長培養基為高氏一號培養基：甘露醇10g、七水硫酸鎂1g、碳酸鈣0.2g、丙氨酸1g、磷酸氫二鉀1g、七水硫酸亞鐵0.01g、氯化鈉15g、重鉻酸鉀50mg、瓊脂粉18g、水1l、微量鹽1ml(0.001g/l)、復合維生素1ml(0.5mg/l)、ph7.2～7.4。

(2)編號為trm20170601的菌株在25-50℃條件下均能生長，最適生長溫度為28℃，培養時間為3-5d。

(3)編號為trm20170601的菌株最適生長ph7。

具體的，本發明通過對采集土壤樣品進行分離、篩選和培養，從中篩選出一株編號為trm20170601的菌株，經微生物學分類與鑒定，該菌株屬于鏈霉菌(streptomycessalilacus)菌株。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)。地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101。保藏日期2017年6月21日，菌種保藏號為cgmccno.14260。經微生物學鑒定為鏈霉菌的新菌種，從其分類學角度暫定分類為鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601。該菌株最適生長條件為：溫度28℃，培養基采用高氏一號培養基(甘露醇10g、七水硫酸鎂1g、碳酸鈣0.2g、丙氨酸1g、磷酸氫二鉀1g、七水硫酸亞鐵0.01g、氯化鈉15g、重鉻酸鉀50mg、瓊脂粉18g、水1l、微量鹽1ml(0.001g/l)、復合維生素1ml(0.5mg/l)、ph7.2～7.4)，培養時間4d。

3、菌株trm20170601的生理生化鑒定

形態特征：trm20170601經4d培養后，在高氏一號培養基表面，菌落呈圓形、邊緣整齊、凸起、光滑、白色、不透明、黏稠不易挑起；該菌為革蘭陽性菌、好氧、菌體桿狀、無鞭毛、有內生孢子形成，其菌落和菌體形態參見附圖1。

生理生化特征：biologgn2板檢測該菌可利用的碳源為：l-巖藻糖、葡萄糖和d-果糖。

通過上述菌種鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260的菌體形態、培養特征觀察及生理生化指標測定，即通過菌體形態觀察、菌株培養特征觀察、生長溫度測定等試驗，參照《伯杰氏系統細菌學鑒定手冊》第八版和《常用細菌系統鑒定手冊》的方法進行，編號為trm20170601的菌種與常見的鏈霉菌菌種相比，具有明顯的生理生化特性差異，且抑制生物膜形成能力更強，表明trm20170601菌株是一種典型的新菌種，從其分類學角度，該菌株歸屬鏈霉菌(streptomycessalilacus)的成員，暫命名為鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601。

實施例二：鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260分子水平鑒定

提取菌株trm20170601的總dna，采用采用細菌16srdnapcr擴增通用引物，進行pcr擴增，pcr產物經切膠純化后測序。菌株trm20170601的全基因序列參見附后提供的sequencelisting，將實驗菌株的所得序列與genbank數據庫中的已知序列進行blast比較，確定與實驗菌株親緣關系最近的種屬關系。并結合eztaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)中序列比對并調取相關模式菌株序列，以進行系統發育樹分析標準模式菌序列，利用mega5.0軟件包采用鄰接法(neighbor-joiningmethod)進行聚類分析和系統進化樹構建。由系統進化樹可示，菌株trm20170601與模式菌株streptomycesmacrosporusnbrc14748^t(ab184616)最大同源為98.0％，系統進化樹參見附圖2，編號為trm20170601的菌種與其常見的鏈霉菌(streptomycessalilacus)成員菌具有鮮明的區別，具有明顯的分子水平差異性，確定為鏈霉菌為典型的新菌種，從其分類學角度，該菌株歸屬(streptomycessalilacus)的成員，暫命名為streptomycessalilacus。

實施例三：鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液的制備

(1)菌株的活化：將保存在甘油管中的菌株接種到高氏一號培養基平板上，28℃培養5d。

(2)種子液的制備：將活化好的菌株從高氏一號固體平板上挑取單菌落轉接到裝有150ml液體高氏培養基的500ml三角瓶中，恒溫搖床28℃，185r/min培養5-7d。

(3)初始發酵培養條件：將種子液按4％的接種量接種到液體高氏一號培養基中，恒溫搖床28℃，185r/min培養15d。

實施例四：不同ph值、溫度、有機試劑處理條件下鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)發酵液對抑制生物膜形成的影響

1、試驗方法

將菌液按1:100比例稀釋，發酵液經無菌濾膜過濾，將處理后的發酵液按不同濃度(10％～50％)與菌液進行混合，混合后吸取20μl至96孔板，每個梯度4孔，恒溫培養箱37℃靜置培養24h，測od590(需要核實是od590還是od590，下同)，流水緩慢洗板3次，以洗去未黏附細菌。放入烘箱，56℃，烘干1h，用0.5％結晶紫染色5min，流水沖洗，洗去多余的結晶紫染液，自然晾干，測od490。

相對生物膜形成能力＝(處理組od490/空白od490)×100。

2.不同溫度對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響

把溫度為-20℃設為未處理組，處理組溫度分別為：30℃、40℃、60℃、80℃、100℃將發酵液用不同溫度水浴處理30min后，結果如附圖3所示，當蛋白溫度為-20℃時相對生物膜形成能力為51.36％；溫度為30℃時相對生物膜形成能力為52.02％；溫度為40℃時相對生物膜形成能力為49.88％；溫度為60℃時相對生物膜形成能力為37.89％；溫度為80℃時相對生物膜形成能力為54.68％；溫度為100℃時相對生物膜形成能力為59.04％；溫度為60℃時發酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力最強。

3.不同ph值對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響

以ph值為7為未處理組，分別將發酵液調至不同ph值，測其對表皮葡萄球菌atcc35984相對生物膜形成能力的影響，結果如附圖4所示，當蛋白的ph值為3時相對生物膜形成能力為27.47％；ph值為5時相對生物膜形成能力為30.24％；ph值為7時相對生物膜形成能力為38.54％；ph值為9時相對生物膜形成能力為25.74％；ph值為11時相對生物膜形成能力為10.94％；當ph值為11時相對生物膜形成能力最弱，其生物膜抑制率最高。

4.不同有機試劑對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響

把未加有機試劑只加了發酵液的設為未處理組，以丙酮、氯仿、乙酸乙酯、乙醚設為處理組，結果如附圖4所示，經丙酮處理的其相對生物膜形成能力為14.47％；經氯仿處理的其相對生物膜形成能力為38.4％；經乙酸乙酯處理的其相對生物膜形成能力為11.21％；經乙醚處理的其相對生物膜形成能力為10.98％；未經有機試劑處理的其相對生物膜形成能力為45.27％；通過以上實驗表明發酵液經乙醚處理后生物膜形成能力最弱，發酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜活性最強。

實施例五：基于鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液制備的消毒劑對不同細菌殺滅效果

用無菌標準硬水將基于鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液制備的消毒劑稀釋成試驗濃度2倍的消毒劑，將消毒液于60℃±1℃水浴中恒溫10min。在無菌試管內加入1.0ml菌懸液與4.0ml消毒液(陽性對照組為稀釋液)混合，作用至預定時間。取1ml菌藥混合液，加于裝有10ml中和劑的試管中，混勻，中和作用15min。經充分混合，吸取1.0ml樣液作傾注接種培養，進行活菌計數，計算殺滅對數值。試驗重復2次，結果如表1所示。

表1：基于新菌種發酵液制備的消毒劑對不同細菌殺滅效果

基于鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液制備的消毒劑稀釋液作用5min，對菌懸液內表皮葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌平均殺滅對數值均＞5.00；對白色念珠菌作用5min，平均殺滅對數值為3.57。

以上實驗可知，將本發明提供的鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發酵液研制成消毒劑，在ph值11，溫度60℃，經乙醚處理的條件下，抑制生物膜形成的能力最強，可以使表皮葡萄球菌相對生物膜形成能力低至10.94％，并且在殺菌試驗時作用5min后對菌懸液內表皮葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌平均殺滅對數值均＞5.00，該菌種具有培養條件簡單，繁殖快，遺傳特性穩定，抑制生物膜形成能力較強的優點，獲得顯著突出的技術效果。

上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所延伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之中。

sequencelisting

<110>塔里木大學

<120>鹽湖鏈霉菌trm20170601及在消毒劑中的應用

<130>trm20170601

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1498

<212>dna

<213>trm20170601

<220>

<221>trm20170601

<222>(1)..(1498)

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