本發(fā)明涉及生物技術(shù)及食品化工領(lǐng)域，尤其涉及蔗糖合成酶基因表達的畢赤酵母工程菌以及重組畢赤酵母在催化合成萊鮑迪苷a中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甜菊糖(steviolglycoside)是一種具有很多優(yōu)良特性的高甜度天然甜味劑，在食品、飲料、釀酒、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域均有著巨大的應(yīng)用價值。甜菊糖帶有后苦味和甘草異味，混合物組分復(fù)雜，難以對其質(zhì)量規(guī)格進行統(tǒng)一，限制其應(yīng)用。甜菊苷(stevioside)和萊鮑迪苷a(rebaudiosidea)是甜菊糖中含量最豐富的兩種成分，分別占干葉重的5-10％和2-4％。萊鮑迪苷a(ra)是一種無毒、安全、低熱能、高甜度的天然甜昧劑，其甜度是蔗糖的150-300倍，熱值僅為蔗糖的1/300，而且口味純正，沒有后苦味；因而具有巨大的應(yīng)用價值。目前制備高純度萊鮑迪苷a產(chǎn)品的方法有：培育高產(chǎn)萊鮑迪苷a的甜葉菊品種、樹脂吸附或重結(jié)晶提純?nèi)R鮑迪苷a、環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶等酶對甜菊糖進行改性。但都存在工藝繁瑣、成本高、效果不佳等缺點。因此，建立一種高效合成萊胞迪苷a的方法十分必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中不足，提供一種表達蔗糖合成酶sus1的重組畢赤酵母工程菌及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題還在于將共表達蔗糖合成酶sus1的重組畢赤酵母工程菌作為全細胞催化劑用于合成萊鮑迪苷a。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種重組畢赤酵母工程菌，所述重組畢赤酵母工程菌是通過將含有如下外源dna序列的表達載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母而獲得：

所述外源dna為編碼蔗糖合成酶sus1的dna序列，所述蔗糖合成酶sus1的氨基酸序列如seqno.1所示。所述外源dna序列如seqno.2所示。

其中，所述表達載體為將所述外源dna克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體ppicza，得到的胞內(nèi)表達載體ppicza-sus1。

優(yōu)選地，所述重組畢赤酵母工程菌是所述胞內(nèi)表達載體ppicza-sus1線性化后轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母而得。

另外，本發(fā)明還提供了一種全細胞催化劑，包含本發(fā)明的重組畢赤酵母工程菌。

優(yōu)選地，所述全細胞催化劑是通過如下步驟制備而成：

所述全細胞催化劑是通過如下步驟制備而成：

挑取重組畢赤酵母工程菌接種到bmgy培養(yǎng)基，30℃，250rpm培養(yǎng)至od600接近6.0，于6000rpm,4℃離心5min收集細胞，然后將收集的細胞重懸到bmmy培養(yǎng)基至起始od600接近1.0，于30℃，250rpm震蕩培養(yǎng)，每天補加終濃度1％甲醇；發(fā)酵3天后在6000rpm，4℃離心5min回收菌體；凍干后即為重組畢赤酵母全細胞催化劑。

另外，本發(fā)明還提供了一種萊鮑迪苷a的合成方法，該方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷為原料，以上述方案中的全細胞催化劑為催化劑合成萊鮑迪苷a。

優(yōu)選地，該方法包括如下步驟：

包括如下步驟：

(1)按如下組分及其濃度制備反應(yīng)體系；

50mmpbs緩沖液，

3mmmgcl2，

50mm蔗糖，

1mmudp，

10mg/ml甜菊苷；

(2)加入菌體量為30od重組畢赤酵母與30od菌體量的全細胞催化劑，于37℃進行反應(yīng)，反應(yīng)12h后停止反應(yīng)；

(3)將反應(yīng)液稀釋5倍后，用0.2um水系尼龍膜過濾后用液相色譜檢測ra的合成。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點在于：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點在于：構(gòu)建得到的重組畢赤酵母工程菌能實現(xiàn)sus1的胞內(nèi)表達；發(fā)酵獲得的全細胞催化劑可與表面展示ugt76g1菌株聯(lián)合催化合成ra，ra產(chǎn)量達到2.2mg/ml。不僅提高了萊鮑迪苷a(ra)的合成效率和原料使用率、節(jié)約生產(chǎn)成本，并為萊鮑迪苷a(ra)的生產(chǎn)加工開辟新的工業(yè)化途徑。

下面結(jié)合附圖和具體實施方式進一步詳細描述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實施方式，任何在本發(fā)明基本精神上的改進或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護的范圍。

附圖說明

圖1為重組畢赤酵母全細胞催化劑合成ra。a、b分別為反應(yīng)前后的液相色譜檢測結(jié)果。st和ra的出峰時間分別為10.1min和10.8min左右。

具體實施方式

下面結(jié)合具體制備實施例和應(yīng)用實施例，對本發(fā)明作進一步詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

基因sus1的合成

以ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的氨基酸序列為基礎(chǔ)，對序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進行優(yōu)化，得到密碼子優(yōu)化的sus1基因，其序列分別如seqno.2示，通過生物技術(shù)公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)進行全基因合成，合成的基因克隆在puc57質(zhì)粒(購自金斯瑞生物科技公司)上，得到質(zhì)粒puc57-sus1。

實施例2

胞內(nèi)表達載體ppicza-sus1的構(gòu)建

根據(jù)sus1基因序列設(shè)計正向引物sf(含ecori酶切位點)和反向引物sr(含noti酶切位點)。以實施例1中的質(zhì)粒puc57-sus1為模板，sf和sr為引物進行pcr擴增。將膠回收純化后的pcr產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶ecori和noti進行雙酶切，與同樣經(jīng)過ecori和noti雙酶切的質(zhì)粒ppicza用t4連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化e.colitop10(購自美國invitrogen英杰生命技術(shù)有限公司)，經(jīng)博萊霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒經(jīng)ecori和noti雙酶切鑒定正確后，得到胞內(nèi)表達載體ppicza-sus1。含有重組質(zhì)粒ppicza-sus1的克隆菌株e.colitop10/ppicza-sus1加15％甘油于-80℃保存。

實施例3

重組畢赤酵母工程菌gs115/9k/ppicza-sus1的構(gòu)建及全細胞催化劑的獲得

將空載體ppic9k經(jīng)mssi單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化并純化后電轉(zhuǎn)化pichiapastorisgs115(購自美國invitrogen英杰生命技術(shù)有限公司)感受態(tài)細胞，并在卡那霉素抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子；將胞內(nèi)表達載體ppicza-sus1經(jīng)mssi單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化并純化后電轉(zhuǎn)化上述重組畢赤酵母，并在博來霉素抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子；進而得到重組畢赤酵母工程菌gs115/9k/ppicza-sus1。

挑取上述重組畢赤酵母工程菌gs115/9k/ppicza-sus1接種至bmgy培養(yǎng)基，30℃，250rpm培養(yǎng)至od600接近6.0，于6000rpm,4℃離心5min收集細胞，然后將收集的細胞重懸到bmmy培養(yǎng)基至起始od600接近1.0，于30℃，250rpm震蕩培養(yǎng)，每天補加終濃度1％甲醇。發(fā)酵3天后在6000rpm，4℃離心5min回收菌體；菌體凍干后即得到重組畢赤酵母全細胞催化劑。

實施例4

重組畢赤酵母全細胞催化劑合成萊胞迪苷a

200ul反應(yīng)體系包含以下成分：50mmpbs緩沖液，3mmmgcl2，50mm蔗糖，1mmudp，10mg/mlst(甜菊苷)。加入菌體量為30od重組畢赤酵母與30od菌體量的全細胞催化劑，于37℃進行反應(yīng)，反應(yīng)12h后停止反應(yīng)。將反應(yīng)液稀釋5倍后，用0.2um水系尼龍膜過濾后用液相色譜檢測ra的合成。

甜菊苷(st)和萊鮑迪苷a(ra)的出峰時間為10.1min和10.8min左右。由圖1可知，反應(yīng)12h后st被消耗，同時生成ra。實驗表明sus1在重組酵母胞內(nèi)活性表達，反應(yīng)物蔗糖和udp進入細胞后在sus1的作用下生成udpg和果糖。生成的udpg從胞內(nèi)運出，在表面展示ugt76g1的畢赤酵母催化下與st反應(yīng)生成產(chǎn)物ra。ra產(chǎn)量達到2.2mg/ml。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>廣州康琳奈生物科技有限公司

<120>一種重組畢赤酵母工程菌、全細胞催化劑及萊鮑迪苷a的合成方法

<160>2

<210>1

<211>808

<212>prt

<400>1

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