本發(fā)明涉及一種桃葉片基因組dna的提取方法，具體涉及一種高通量桃葉片基因組dna的提取方法。
背景技術(shù)：
：桃[prunuspersica(l.)batsch]原產(chǎn)我國(guó)，是我國(guó)栽培面積較大的落葉果樹之一。由于其遺傳和生物學(xué)特征(基因組小、童期短、自交親和、質(zhì)量性狀多等)，是多年生果樹研究的模式植物。同時(shí)由于栽培品種多為二倍體，更易于遺傳規(guī)律分析、重要性狀定位、遺傳多樣性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究。桃全基因組序列測(cè)定的完成和在genomedatabaseforrosaceae(gdr)的數(shù)據(jù)釋放，為基于大量樣品dna進(jìn)行基因精細(xì)定位和分子輔助選種研究奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，特別是基于二代測(cè)序的標(biāo)記技術(shù)加速了作物經(jīng)濟(jì)性狀基因的挖掘和分子聚合育種體系的建立。其中，圖位克隆法仍是基因定位和克隆的常用和有效手段。這種方法首先在初步定位該基因的基礎(chǔ)上，通過尋找較為緊密的分子標(biāo)記，對(duì)該基因進(jìn)行精細(xì)定位，從而將該基因界定在一個(gè)較小的區(qū)域內(nèi)。許多重要的質(zhì)量和數(shù)量性狀已經(jīng)通過圖位克隆的方法被精細(xì)定位或克隆。但圖位克隆的前提是需要足夠量的雜交群體后代。同樣，應(yīng)用分子聚合育種需對(duì)雜交后代單株進(jìn)行分子鑒定和篩選，這些都需提取大量樣品dna，結(jié)合分子標(biāo)記開展相關(guān)的育種工作。目前，多年生果樹包括桃，存在葉片基因組dna提取步驟復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)、通量少等缺點(diǎn)。因此，如何快速、省時(shí)、高通量地提取葉片dna是亟需解決的問題之一，是開展后續(xù)工作的前提。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種高通量桃葉片基因組dna的提取方法，克服了傳統(tǒng)桃葉片基因組dna提取時(shí)間長(zhǎng)、通量少等缺點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種高通量桃葉片基因組dna的提取方法，包括以下步驟：步驟1：稱取桃葉片分別置于48組、每個(gè)離心管體積為1.2ml的八連排離心管中，在每個(gè)離心管中加入直徑4mm的研磨鋼珠，加入液氮冷凍后放入樣品研磨儀中研磨100s至桃葉片粉碎，研磨完成后在放入液氮中冷凍；步驟2：加入500μl、質(zhì)量濃度為2％的ctab，在60℃烘箱中放置30min，期間每隔10min輕輕搖勻；步驟3：采用臺(tái)式離心機(jī)，在轉(zhuǎn)速500r/min下離心5min，防止研磨物溢出導(dǎo)致樣品間污染；步驟4：用300ml量程的8通道移液器向八連排離心管中加入氯仿和異戊醇的混合液，直至1.2ml離心管的滿載線，然后輕輕上下晃動(dòng)搖勻5min；所述混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24:1；步驟5：放入冷凍離心機(jī)，在4℃、轉(zhuǎn)速4000r/min條件下離心10min，吸取上清液，將約150μl上清液轉(zhuǎn)入200μl的96孔pcr板，然后加入與上清液等體積的經(jīng)過預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕上下晃動(dòng)搖勻，在-20℃冰箱中放置1h；步驟6：將96孔pcr板放入冷凍離心機(jī)中，在4℃、轉(zhuǎn)速4000r/min條件下離心10min，棄上清液；步驟7：在帶有沉淀的96孔pcr板中加入200μl、質(zhì)量濃度為70％的乙醇，放入冷凍離心機(jī)，在轉(zhuǎn)速1000r/min下離心5min，然后用質(zhì)量濃度為70％的乙醇洗滌沉淀2次，再用無(wú)水乙醇洗滌沉淀1次，在室溫下自然晾干；步驟8：在室溫下自然晾干后，在96孔pcr板中加入150μl的0.1×te緩沖液溶解沉淀，同時(shí)加入0.5μl的rnasea，去除rna污染。進(jìn)一步地，步驟1中所述樣品研磨儀的振動(dòng)頻率為30hz。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明建立了一種快速、高通量提取桃葉片基因組dna的方法，精簡(jiǎn)了提取步驟和水浴方法，每人每天可提取1024個(gè)樣品dna，克服了傳統(tǒng)dna提取方法程序復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，為大規(guī)模提取桃葉片基因組dna提取奠定了基礎(chǔ)。該方法提取的基因組dna可用于ssr分析、基于hrm的snp分型擴(kuò)增、sanger測(cè)序以及其他分子標(biāo)記分析等后續(xù)研究。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例一中桃葉片加入1.2ml八連排離心管后的狀態(tài)示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例一中桃葉片經(jīng)研磨后狀態(tài)示意圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例一中桃葉片加入ctab后狀態(tài)示意圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例一中桃葉片加入氯仿和異戊醇后狀態(tài)示意圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例一中提取的桃葉片dna溶液示意圖。圖6為本發(fā)明提取dna的1％的瓊脂糖膠電泳結(jié)果。圖7為本發(fā)明提取dna的8％聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。圖8為本發(fā)明提取dna進(jìn)行hrm的snp基因分型結(jié)果。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)驗(yàn)器具和試劑：200ml、質(zhì)量濃度為2％的ctab溶液：含4g的十六烷基三甲基溴化銨(ctab)，16.364g的nacl，20ml、1mol/l、ph＝8.0的三羥甲基氨基甲烷，8ml、0.5mol/l的乙二胺四乙酸；te緩沖液：10mm/l的三羥甲基氨基甲烷，1mm/l、ph＝8.0的乙二胺四乙酸；氯仿，分析純；異戊醇，分析純；無(wú)水乙醇，分析純；質(zhì)量濃度為70％的乙醇；1.2ml的八連排離心管；100ml、300ml和10μl的8通道移液器(eppendorf)；尖頭鑷子、鋼珠(直徑4mm)；樣品碾磨儀(上海)；臺(tái)式離心機(jī)；冷凍離心機(jī)(eppendorf5810r)；96孔pcr板(axygen)；乳膠手套(光明)；液氮；pcr儀(eppendorf)；熒光定量pcr儀(rochelc480)、taq聚合酶、hrmmatermix(roche)、page膠電泳系統(tǒng)膠等。實(shí)施例中所用的04-1-112為桃品種97矮和鴛鴦垂枝的雜交后代單株，種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所桃育種圃內(nèi)。實(shí)施例一如圖1～5所示，一種高通量桃葉片基因組dna的提取方法，包括以下步驟：步驟1：挑選以桃中油8號(hào)(prunuspersica，cn8)為母本，04-1-112(prunuspersica)為父本雜交后代的單株384個(gè)，稱取每個(gè)單株的桃葉片300μg，分別置于48組、每個(gè)離心管體積為1.2ml的八連排離心管中，并對(duì)每個(gè)離心管和管蓋進(jìn)行位置和方向標(biāo)記，在每個(gè)排離心管中加入直徑4mm的研磨鋼珠，加入液氮冷凍后放入樣品研磨儀中研磨100s至桃葉片粉碎，研磨完成后在放入液氮中冷凍；所述樣品研磨儀的振動(dòng)頻率為30hz；步驟2：加入500μl、質(zhì)量濃度為2％的ctab，在60℃烘箱中放置30min，其間每隔10min輕輕搖勻；步驟3：采用臺(tái)式離心機(jī)，在轉(zhuǎn)速500r/min下離心5min，防止研磨物溢出導(dǎo)致樣品間污染；步驟4：用300ml量程的8通道移液器向八連排離心管中加入氯仿和異戊醇的混合液，直至1.2ml離心管的滿載線，然后輕輕上下晃動(dòng)搖勻5min；所述混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24:1；步驟5：放入冷凍離心機(jī)，在4℃、轉(zhuǎn)速4000r/min條件下離心10min，吸取上清液，將約150μl上清液轉(zhuǎn)入200μl的96孔pcr板，然后加入與上清液等體積的經(jīng)過預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕上下晃動(dòng)搖勻，在-20℃冰箱中放置1h；步驟6：將96孔pcr板放入冷凍離心機(jī)中，在4℃、轉(zhuǎn)速4000r/min條件下離心10min，棄上清液；步驟7：將帶有沉淀的96孔pcr板中加入200μl、質(zhì)量濃度為70％的乙醇，放入臺(tái)式離心機(jī)，在轉(zhuǎn)速1000r/min下離心5min，然后用質(zhì)量濃度為70％的乙醇洗滌沉淀2次，再用無(wú)水乙醇洗滌沉淀1次，在室溫下自然晾干；步驟8：在室溫下自然晾干后，在96孔pcr板中加入150μl的0.1×te緩沖液溶解沉淀，同時(shí)加入0.5μl的rnasea，去除rna污染，即可得到桃葉片基因組dna，將桃葉片基因組dna長(zhǎng)期保存于-20℃的冰箱中，或者短期保存于4℃冰箱。采用上述方法在3h內(nèi)可完成了384個(gè)樣品dna的提取，一天按8小時(shí)工作時(shí)間計(jì)，可提取1024個(gè)樣品dna，克服了傳統(tǒng)dna提取方法程序復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了高通量提取桃葉片dna。實(shí)施例二本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，不同之處在于：步驟1中采用的桃葉片為中油8號(hào)(prunuspersica，cn8)的桃葉片。實(shí)施例三本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，不同之處在于：步驟1中采用的桃葉片為04-1-112成年親本樹的桃葉片。實(shí)施例四dna的提取是分子生物學(xué)研究中非常重要的一步。因此，dna提取方法的適用性還需要下游實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。本實(shí)施例以實(shí)施例1～3所得的桃葉片基因組dna溶液為樣品，檢測(cè)樣品的純度、完整度、能否用于pcr擴(kuò)增結(jié)果及hrm的snp基因分型。由于一個(gè)完整提取過程所獲得的桃葉片dna溶液為384個(gè)，數(shù)量較大，故本實(shí)施例選取實(shí)施例1中的5個(gè)雜交單株、實(shí)施例2中的1個(gè)單株及實(shí)施例3中的1個(gè)單株的桃葉片得到的桃葉片dna溶液進(jìn)行上述檢測(cè)。采用nanodrop1000spectrophotometer(themo)分別測(cè)量上述三種提取dna溶液在230nm、260nm及280nm處的光吸收峰度值，結(jié)果如表1所示。采用1％的瓊脂糖膠對(duì)提取的桃葉片dna溶液進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。參考表1和圖6，采用本發(fā)明方法從桃葉片中提取的dna純度符合要求。表1本發(fā)明方法提取3種dna的質(zhì)量比較植物名濃度(ng/μl)od260/od230od260/od280雜交后代單株1136.21.851.89雜交后代單株2105.81.801.75雜交后代單株3130.61.781.69雜交后代單株4124.51.791.75雜交后代單株5151.01.651.69中油桃8號(hào)102.31.561.6504-1-112112.01.711.77通過pcr擴(kuò)增進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明提取方法所獲得dna的質(zhì)量。以提取的桃葉片dna溶液為pcr反應(yīng)模板分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增采用的通用引物對(duì)為：lu-tssd11(5‘-gtgaagtcccaccagtgcag-3’和5‘-tggagtcagagaggatcgtcaa-3’)和lu-tssd7(5’-agccctgtattggttccatcct-3’和5’-agaaggtagcgactccttttcct-3’)。20μlpcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：13.27μl的ddh2o、2μl的10×buffer(包含mg2+)、1.6μl(2.5mmeach)的dntp、0.13μl(5u/μl)的taq酶、1μl的模板dna。pcr擴(kuò)增反應(yīng)在pcr儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃90s，34個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃冷卻。聚丙烯酰胺凝膠電泳采用8％的聚丙烯酰胺膠200v電泳1.5h，1％硝酸銀染8min后，500mlnaoh(10gnaoh加8ml甲醛)顯色后用na2co3終止染色后照相(具體參考魯振華等.桃srap_pcr反應(yīng)體系建立及與半矮生型相關(guān)標(biāo)記的研究[j].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,3:52～55)，結(jié)果如圖7所示。用于hrm的基因分型的pcr擴(kuò)增程序?yàn)?5℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃20s，45個(gè)循環(huán)；72℃10min。hrm分析程序?yàn)?5℃1min，40℃1min，65℃～95℃讀取熔解曲線，溫度分辨率0.02℃(具體參考：魯振華等.基于hrm獲得與桃tssd緊密連鎖的snp標(biāo)記[j].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,50(8):1505-1513)。高分辨率熔解曲線分析采用genescanning軟件(version1.5)，結(jié)果如圖8所示。參考圖7和圖8可知，采用本發(fā)明方法提取的dna的擴(kuò)增條帶明顯、snp基因分型良好，可用于后續(xù)研究。以上所述之實(shí)施例，只是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，僅僅用以解釋本發(fā)明，并非限制本發(fā)明實(shí)施范圍，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，當(dāng)然可根據(jù)本說(shuō)明書中所公開的技術(shù)內(nèi)容，通過置換或改變的方式輕易做出其它的實(shí)施方式，故凡在本發(fā)明的原理及工藝條件所做的變化和改進(jìn)等，均應(yīng)包括于本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12