本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于篩選長日照條件下玉米晚花性狀的功能性分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：功能標(biāo)記是根據(jù)功能基因內(nèi)部引起表型性狀變異的多態(tài)性基序開發(fā)出來的。一旦遺傳效應(yīng)被定位在特定的功能性基序上，基于這種相關(guān)性發(fā)展的功能標(biāo)記則不需要進(jìn)一步驗(yàn)證就可以在不同的遺傳背景下確定目標(biāo)等位基因的有無。在應(yīng)用上，功能標(biāo)記能夠避免由于重組交換而產(chǎn)生的選擇錯(cuò)誤，在群體的目標(biāo)基因檢測時(shí)更加有效；由于來源于基因內(nèi)部，直接反映目標(biāo)性狀的表現(xiàn)，可以準(zhǔn)確的檢測、跟蹤目標(biāo)基因，且其遺傳效應(yīng)值具有普適性，且可靠性高，對人工育種群體和自然群體均有效，在利用回交轉(zhuǎn)育開花期調(diào)控等性狀的轉(zhuǎn)移時(shí)，功能標(biāo)記的應(yīng)用可以更好的避免連鎖累贅，所以功能標(biāo)記的開發(fā)有助于推動育種中的分子標(biāo)記輔助選擇的應(yīng)用和關(guān)聯(lián)分析中基于候選基因策略的研究，而且有利于在種質(zhì)資源中發(fā)掘有利基因。玉米起源于中北美的熱帶地區(qū)，屬于典型短日照植物。玉米進(jìn)入溫帶地區(qū)廣泛種植是人工馴化的結(jié)果。玉米開花受光周期調(diào)控明顯，熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)引種到溫帶種植后，大多會出現(xiàn)開花期延遲，雌雄不協(xié)調(diào)，晚熟等問題，嚴(yán)重限制了上述種質(zhì)資源在溫帶玉米遺傳育種中的研究應(yīng)用。受光周期敏感性的影響，不同玉米自交系和品種間存在不同生態(tài)區(qū)適應(yīng)性，很多玉米品種無法跨地區(qū)推廣種植。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決春玉米主產(chǎn)區(qū)育種家在播種前無法預(yù)測獲得玉米種質(zhì)資源在溫帶長日照地區(qū)種植是否可以正常開花，在雜交和回交轉(zhuǎn)育中無法估算合適的間隔時(shí)期進(jìn)行開花期錯(cuò)期的技術(shù)問題，克服熱帶血緣玉米材料開花晚無法直接應(yīng)用到溫帶玉米材料生產(chǎn)中的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種用于篩選長日照條件下玉米晚花性狀的功能性分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明為解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：用于篩選長日照條件下玉米晚花性狀的功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3，其pcr引物序列為：正向引物：5′-agcctaagcatctccaaggg-3′，反向引物：5′-cgggtttgctcctttgttcg-3′。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，該功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3位于玉米開花期調(diào)控基因zmcol3啟動子區(qū)域。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述玉米開花期調(diào)控基因zmcol3屬于cct類轉(zhuǎn)錄因子，位于玉米第5染色體上。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，長日照條件下，正常開花玉米和晚開花玉米的zmcol3編碼基因啟動子區(qū)域存在特異性差異序列，所述特異性差異序列與玉米開花時(shí)間緊密連鎖，所述特異性差異序列位于zmcol3編碼基因起始密碼上游第261～811bp。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，長日照條件下，正常開花玉米中，所述特異性差異序列如序列表中的seqidno：1所示，晚開花玉米中，所述特異性差異序列如序列表中的seqidno：2所示。本發(fā)明還提供了一種利用上述的功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3區(qū)分正常開花玉米和晚開花玉米的方法。本發(fā)明還提供了上述的功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3在正常開花玉米和晚開花玉米新品種的分子標(biāo)記輔助選擇育種方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：長日照條件下，正常開花玉米和晚開花玉米的zmcol3編碼基因啟動子區(qū)域存在特異性差異序列，所說的特異性差異序列與玉米開花時(shí)間緊密連鎖，所說的特異性差異序列位于zmcol3編碼基因起始密碼(atg)上游第261～811bp。本發(fā)明根據(jù)上述特異性差異序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)用于在長日照條件下區(qū)分正常開花和晚開花玉米的特異性功能性分子標(biāo)記，該功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3有利于熱帶血緣玉米材料引入溫帶玉米材料產(chǎn)區(qū)遺傳育種。春玉米玉米產(chǎn)區(qū)(長日照條件)遺傳育種在引入熱帶血緣玉米種質(zhì)資源時(shí)，利用該功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3有目的的去除含有該基因晚花特征堿基序列，既保留了引入熱帶血緣玉米材料的優(yōu)異抗病等位基因，又改良了熱帶血緣玉米材料開花晚無法直接應(yīng)用到溫帶玉米材料生產(chǎn)中的缺點(diǎn)。本發(fā)明的功能性分子標(biāo)記的應(yīng)用有利于溫帶長日照地區(qū)，尤其是春玉米主產(chǎn)區(qū)育種研究人員快速對獲得的玉米種質(zhì)資源進(jìn)行開花期預(yù)測，對于雜交和回交轉(zhuǎn)育中花期錯(cuò)期具有重要指導(dǎo)意義。同時(shí)也方便育種家快速區(qū)分熱帶血緣材料和溫帶血緣材料(大部分熱帶血緣材料具有抗性好的農(nóng)藝性狀，但在溫帶長日照地區(qū)表現(xiàn)為開花推遲或不能正常開花的生物學(xué)特點(diǎn))；該篩選技術(shù)的推廣應(yīng)用對于加快熱帶血緣玉米種質(zhì)資源在溫帶玉米主產(chǎn)區(qū)育種的應(yīng)用速度，提高玉米品種廣適性，具有重要意義。附圖說明圖1為序列比對分析圖。圖2為長日照區(qū)域可以正常開花的代表性骨干自交系基因分型圖。圖中：m：dl2000marker；1：鄭58；2：7922；3：承351；4：吉853；5：吉v203；6：b73；7：ph6wc；8：四-144；9：四-287；10：ph4cv；11：吉a001；12：a6203；13：昌7-2；14：a188；15：8902；16：mo17；17：h99；18：哲461；19：丹598；20：法a。圖3為長日照區(qū)域市售商業(yè)化雜交種基因分型圖。圖中：m：dl2000marker；1：先玉335；2：先玉696；3：dk516；4：dk517；5：鄭單958；6：吉單27；7：吉單519；8：德美亞1號；9：德美亞2號；10：德美亞3號。圖4為西南和云南地區(qū)代表性自交系基因分型圖。圖中：m：dl2000marker；1：成自273；2：06s282；3：空；4：hf05-1；5：k959；6：wy8-1-2；7：q319；8：c128；9：c08；10：交51；11：fs08h；12：t497-2；13：空；14：hwz03；15：c319。具體實(shí)施方式本發(fā)明的一種用于篩選長日照條件下玉米晚花性狀的功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3，其pcr引物序列為：正向引物(indel-f)：5′-agcctaagcatctccaaggg-3′，反向引物(indel-r)：5′-cgggtttgctcctttgttcg-3′。玉米開花期調(diào)控基因zmcol3屬于cct類轉(zhuǎn)錄因子，位于玉米第5染色體上。本發(fā)明的功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3位于玉米開花期調(diào)控基因zmcol3啟動子區(qū)域。長日照條件下，正常開花玉米和晚開花玉米的zmcol3編碼基因啟動子區(qū)域存在特異性差異序列，所說的特異性差異序列與玉米開花時(shí)間緊密連鎖，所說的特異性差異序列位于zmcol3編碼基因起始密碼(atg)上游第261～811bp。長日照條件下，正常開花玉米中，所說的特異性差異序列如序列表中的seqidno：1所示，晚開花玉米中，所說的特異性差異序列被一個(gè)長度為217bp的堿基序列置換，如序列表中的seqidno：2所示。本發(fā)明還提供一種利用上述的功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3來區(qū)分正常開花玉米和晚開花玉米的方法。本發(fā)明的功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3還可以應(yīng)用于正常開花玉米和晚開花玉米新品種的分子標(biāo)記輔助選擇育種方面。控制玉米開花期特異轉(zhuǎn)錄因子zmcol3功能性分子標(biāo)記的開發(fā)，將有助于加快熱帶血緣玉米種質(zhì)資源在溫帶玉米遺傳育種中的應(yīng)用。本發(fā)明中，正常開花玉米雜交種材料指在長日照條件下，開花期不晚于或接近與吉林省區(qū)域試驗(yàn)參照品種先玉335，鄭單958開花期的玉米自交系或雜交種。晚開花玉米雜交種材料指相對參照品種開花時(shí)間推遲7天以上，甚至不開花的玉米材料。自交系材料以國際測序品種b73開花期為參考。實(shí)施例1玉米開花期調(diào)控基因zmcol3啟動子特異性差異序列的獲得1、實(shí)驗(yàn)材料長日照條件下正常開花玉米自交系：b73；長日照條件下晚開花玉米自交系：cml432。2、基因組dna的提取玉米苗期取葉片，對正常開花玉米自交系b73和晚開花玉米自交系cml432分別采用ctab法提取基因組dna。具體步驟如下：在液氮條件下，將玉米葉片大約0.5～1g迅速研磨成粉末后轉(zhuǎn)移至2ml離心管中，并加入65℃預(yù)熱的ctab緩沖液約800μl，充分混勻；將離心管置于65℃水浴中15min，然后取出來加10μlrnaase(rna酶，濃度為10mg/ml)，繼續(xù)水浴1～1.5h，水浴過程中溫和混勻幾次；取出離心管，每管加入等體積的氯仿與異戊醇的混合液體，該混合溶液中，氯仿與異戊醇溶液的體積比為v:v＝24:1，溫和混勻30min后，在8000rpm、離心20min；吸取上清液移入另一離心管中，每管加入等體積的氯仿與異戊醇的混合液體，該混合溶液中，氯仿與異戊醇溶液的體積比為v:v＝24:1，混勻后在8000rpm、離心20min(為了防止吸到兩層液體之間的蛋白，需要注意的是吸上清不可貪多，吸取上清的2/3體積即可，建議用剪了管口的槍頭，如有必要，可再重復(fù)此步驟一次)；將上清液移入另一1.5ml離心管中，加入等體積經(jīng)預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，-20℃條件下靜置20～30min，然后用剪去管口的槍頭吸取dna絮狀物，用70％乙醇浸泡2h(可以不更換離心管，吸取dna絮狀物后，將離心管內(nèi)的液體倒掉即可)；用70％乙醇沖洗2～3次，微型離心機(jī)瞬時(shí)離心10秒，倒去70％乙醇并晾干；加入100～200μl的l×te，56℃溶解dna半天(具體溶解時(shí)間視情況而定)；用nanodrop2000dna濃度測定儀檢測dna的濃度和純度，并取少量樣品通過0.8％的agarose膠電泳測定dna的質(zhì)量。3、pcr測序及測序分析以長日照條件下正常開花玉米自交系b73和長日照條件下晚開花玉米自交系cml432基因組核苷酸序列(maizegdb登錄號:grmzm2g021777)為模板，設(shè)計(jì)引物，pcr擴(kuò)增玉米自交系b73和玉米自交系cml432的基因組dna片段。采用軟件primer5.0設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用滅菌ddh2o稀釋到10μmol/l，-20℃保存?zhèn)溆谩?1)引物序列如下：a-551-類型啟動子引物序列：f：agccgagtgtttggtacgaatggtt；r：gttggtgcgtgtccgccgtg。p-217-類型啟動子引物序列：f：gctgatgtgtttggtacgggtgg；r：ccgggcggactgggttgc。(3)pcr擴(kuò)增體系(20μl體系)如下：(4)pcr擴(kuò)增程序如下：用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，用dna純化試劑盒純化后由上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)，長日照條件下正常開花玉米自交系b73和晚開花玉米自交系玉米cml432的zmcol3編碼基因啟動子區(qū)域存在特異性序列差異，如圖1所示。所說的啟動子特異性差異序列位于基因起始密碼(atg)上游第261～811bp。長日照條件下，正常開花玉米自交系b73中，所說的特異性差異序列如序列表中的seqidno：1所示，晚開花玉米自交系玉米cml432中，所說的特異性差異序列被一個(gè)長度為217bp的堿基序列置換，如序列表中的seqidno：2所示。實(shí)施例2一種用于篩選長日照條件下玉米晚花性狀的功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3的開發(fā)及其對熱帶和溫帶血緣玉米的基因型分析1、設(shè)計(jì)引物選取正常開花玉米自交系b73的zmcol3基因中缺失區(qū)段兩側(cè)的序列，根據(jù)其缺失區(qū)段位置兩側(cè)300～500bp范圍內(nèi)的堿基序列信息，利用軟件primer5.0設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用滅菌ddh2o稀釋到10μmol/l，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄腥缦拢赫蛞?indel-f)：5′-agcctaagcatctccaaggg-3′(seqidno：3)，反向引物(indel-r)：5′-cgggtttgctcctttgttcg-3′(seqidno：4)。2、實(shí)驗(yàn)材料及其開花期調(diào)查317份關(guān)聯(lián)分析遺傳群體，用來進(jìn)行基因分型和開花期表型測試。通過pcr測序發(fā)現(xiàn)，其中210份材料為a-551-類型，107份材料為p-217-類型。a-551-類型啟動子與吉林省、北京市兩個(gè)長日照條件下玉米開花期緊密連鎖。表1為snp標(biāo)記的兩種類型啟動子差異與開花期差異之間的顯著性分析。p-value<0.05代表顯著差異(0.0161、0.0332、0.0260、0.0289)，pvalue<0.01代表極顯著差異(0.0094、0.0016)。表1551/217dtdads2014jl0.01610.00940.03322012bj0.02600.02890.0016實(shí)施例3利用功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3對f2代群體進(jìn)行基因型分析和開花期性狀關(guān)聯(lián)分析為了進(jìn)一步明確p-217-類型和a-551-類型是否在遺傳群體中與玉米開花期緊密連鎖，利用熱帶血緣玉米材料cml189(p-217-類型)和溫帶血緣玉米材料mo17(a-551-類型)進(jìn)行雜交后，構(gòu)建f2代遺傳群體；分別種植在湖北、海南和吉林三種不同生態(tài)區(qū)域，并進(jìn)行抽雄、吐絲和散粉等開花期相關(guān)性狀調(diào)查。利用功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3對f2代遺傳群體1000多個(gè)單株進(jìn)行了基因型分析。研究發(fā)現(xiàn)純合的p-217-類型、雜合的a-551/p-217-類型和純合的a-551-類型，遺傳分離比約為1:2:1。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明吉林省和北京市長日照條件下p-217-類型啟動子與晚開花性狀緊密連鎖。長日照條件下(吉林省地區(qū))功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3能夠顯著區(qū)分出玉米抽雄、吐絲和散粉等開花性狀，p值<0.01，而短日照條件下不顯著。表2為三個(gè)不同地點(diǎn)f2代遺傳群體的基因型和表型分析。表2實(shí)施例4功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3對西南、黃淮海和東北春玉米區(qū)域玉米自交系和雜交種的基因型檢測利用功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3對玉米的標(biāo)記基因型分析，擴(kuò)增出2種帶型，晚開花的玉米為一種帶型(p-217-類型，大小363bp)，正常開花的玉米為另一種帶型(a-551-類型，大小697bp)。利用功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3對東北春玉米產(chǎn)區(qū)和黃淮海玉米產(chǎn)區(qū)(溫帶，長日照區(qū)域)代表性骨干自交系鄭58、昌7-2、ph6wc、ph4cv、四-287、四-144、a6202、哲461、b73、mo17、吉853等玉米自交系進(jìn)行檢測全部為a-551-類型基因型(條帶大小約700bp)，如圖2所示。利用功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3對東北春玉米和黃淮海區(qū)域(溫帶，長日照區(qū)域)代表性雜交種鄭單958、先玉335、先玉696、迪卡516、迪卡517、德美亞1號、德美亞2號、德美亞3號等玉米自交系進(jìn)行檢測全部為a-551-類型基因型(條帶大小約700bp)，如圖3所示。利用功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3對西南和云南地區(qū)代表性自交系成自273、698-3、hf05-1、k959、wy8-1-2、交51、c319、q319等玉米自交系進(jìn)行檢測，其中交51、c319、q319這3個(gè)玉米自交系在吉林省表現(xiàn)為開花期嚴(yán)重推遲，pcr擴(kuò)增檢測條帶大小約為350bp，鑒定為p-217-類型，除了上述3個(gè)玉米自交系其他的在吉林省并沒有表現(xiàn)出嚴(yán)重的花期延遲，可以正常結(jié)實(shí)，pcr擴(kuò)增檢測條帶大小約為700bp，鑒定為a-551-類型，如圖4所示。上述研究結(jié)果說明：長日照條件下p-217-類型分子標(biāo)記為晚開花玉米所特有，而a-551-類型分子標(biāo)記為正常開花玉米所特有。利用功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3可以很好地通過電泳條帶大小區(qū)分玉米材料在長日照條件下是正常開花，還是延遲開花。該功能性分子標(biāo)記indel-pzmcol3的應(yīng)用有利于在引入熱帶血緣玉米種質(zhì)資源基因背景進(jìn)行溫帶玉米遺傳育種中時(shí)，有目的去除延遲開花的基因位點(diǎn)，在保障了引入熱帶血緣的優(yōu)異抗病等位基因同時(shí)，又改良了熱帶血緣玉米開花晚無法直接應(yīng)用到溫帶玉米生產(chǎn)的缺點(diǎn)，加快在玉米生產(chǎn)上的應(yīng)用。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>用于篩選長日照條件下玉米晚花性狀的功能性分子標(biāo)記及其應(yīng)用<160>4<210>1<211>551<212>dna<213>人工<400>1ggctagctccaacaaggagctctaaagggtcctacaccctaaatttagaggataaagaca60tcctctactccctccagcagcgtcctctaaacggttctctaaatttagaggacgttgctg120gatcctctatatatagagtttctctaaacggttctctatccatttaaatactttaaacaa180ccggtttagtaaaactaaaatatgtacaatacattcgagagtatgacaaatacgtatgta240caaaaaattaaaaataaaaaatgtctttaatatatgtatttgcatatagaggacgtgatt300tagaggacgttgttggagaggaaggagatatagaggatgaaatcttttagagaagactgt360aaaggacggatatagaggatgttgctggagacagtctactctatatgtagcatctcactt420caacaaacttctatctagtttggctctagtgagagagctattttagatactccaatagct480tgacaagttagataaatagtctgttaaagaattattttgatgttgaatgactaaataact540agtctatggga551<210>2<211>217<212>dna<213>人工<400>2atattatatatgtagcatctcactctaacaaactatctatatagtttggctagtcaggat60aactatgtaagtttcgttagtgagagagctaatttagatactcaaatagcttgatgagtt120agataactaatctattaaagaatttatttttttattgaatagctaaaatttagctttacg180agtcgtttacctcgcctttcggagatggtacaagtac217<210>3<211>20<212>dna<213>人工<400>3indel-f：5′-agcctaagcatctccaaggg-3′<210>4<211>20<212>dna<213>人工<400>4indel-r：5′-cgggtttgctcctttgttcg-3′當(dāng)前第1頁12