本公開涉及用于對單細胞或細胞核的核酸進行組合索引的方法。本公開進一步提供了用于產生此類索引核酸的文庫以及對此類索引核酸的文庫進行測序的方法。

背景技術：

1、對單細胞的核酸測序已成為用于分析一組細胞的遺傳異質性的有力工具。例如，對單細胞核酸進行測序可用于分析癌癥的進展，繪制患病及健康組織中的細胞異質性圖，了解免疫或自體免疫病癥的發展，并更好地了解自然生物方法。

2、單細胞測序通常包括將唯一條形碼添加到單細胞的核酸，以允許并行剖析許多單細胞。存在多種技術將條形碼添加到單細胞的核酸，并且通常包括使用多孔板或微流體裝置。然而，此類技術受限于板或微流體裝置的容量，以避免在多孔板的孔或由微流體裝置產生的液滴中加載一個以上的細胞，并且防止用相同的條形碼標記多細胞的核酸。因此，本領域需要用于對單細胞的核酸進行索引的改進的高通量方法。

技術實現思路

1、本公開提供了用于對單細胞的核酸進行組合索引的方法以及用于產生此類索引核酸的文庫和對此類索引核酸的文庫進行測序的方法。

2、在一個方面，本公開提供了用于對單細胞的核酸進行組合索引的方法。在某些實施例中，該方法包括(a)提供與包含第一索引序列的核酸締合或包含核酸的混合(pooled)細胞或細胞核，其中第一索引序列摻入到乳化液滴中的混合細胞或細胞核的核酸中；(b)將混合細胞或細胞核的子集分配到包括第二索引序列的多個隔室中；以及(c)將第二索引序列合并到每個隔室中的核酸中以產生雙重索引核酸。在某些實施例中，通過包括以下的方法將第一索引序列摻入到乳化液滴中的細胞或細胞核的核酸中：(i)使多個細胞或細胞核與包含第一索引序列的多個顆粒接觸；(ii)將單獨的顆粒和細胞或細胞核中的一個或多個劃分到乳化液滴中；(iii)將第一索引序列合并到細胞或細胞核的核酸中以產生索引核酸；以及(iv)將來自多個乳化液滴的與索引核酸締合或包含索引核酸的細胞或細胞核組合，以產生與包含第一索引序列的核酸締合或包含核酸的混合細胞或細胞核。

3、在某些實施例中，用于對單細胞的核酸進行組合索引的方法包括：(a)使多個細胞或從多個細胞分離的細胞核與包含第一索引序列的多個顆粒接觸；(b)將單獨的顆粒和細胞或細胞核中的一個或多個劃分到乳化液滴中；以及(c)將第一索引序列合并到細胞或細胞核的核酸中以產生索引核酸；(d)將來自多個乳化液滴的含有索引核酸或與索引核酸相關聯的細胞或細胞核組合以產生混合細胞或細胞核；(e)將混合細胞或細胞核的子集分配到包括第二索引序列的多個隔室中；以及(f)將第二索引序列合并到每個隔室中的索引核酸中以產生雙重索引核酸。

4、在另一方面，本公開提供了用于產生包含來自多個單細胞或細胞核的核酸的測序文庫的方法。例如，但不作為限制，用于產生測序文庫的方法可包括：(a)提供與包含第一索引序列的核酸締合或包含核酸的混合細胞或細胞核，其中第一索引序列摻入到乳化液滴中的混合細胞或細胞核的核酸中；(b)將混合細胞或細胞核的子集分配到包括第二索引序列的多個隔室中；(c)將第二索引序列合并到每個隔室中的核酸中以產生雙重索引核酸；以及(d)將雙重索引核酸的全部或子集組合以從多個細胞產生測序文庫。在某些實施例中，通過包括以下的方法將第一索引序列摻入到乳化液滴中的細胞或細胞核的核酸中：(i)使多個細胞或細胞核與包含第一索引序列的多個顆粒接觸；(ii)將單獨的顆粒和細胞或細胞核中的一個或多個劃分到乳化液滴中；(iii)將第一索引序列合并到細胞或細胞核的核酸中以產生索引核酸；以及(iv)將來自多個乳化液滴的與索引核酸締合或包含索引核酸的細胞或細胞核組合，以產生與包含第一索引序列的核酸締合或包含核酸的混合細胞或細胞核。

5、在某些實施例中，用于產生測序文庫的方法可包括：(a)使多個細胞或從多個細胞分離的細胞核與包含第一索引序列的多個顆粒接觸；(b)將單獨的顆粒和細胞或細胞核中的一個或多個劃分到乳化液滴中；(c)將第一索引序列合并到細胞或細胞核的核酸中以產生索引核酸；(d)將來自多個乳化液滴的含有索引核酸或與索引核酸相關聯的細胞或細胞核組合以產生混合細胞或細胞核；(e)將混合細胞或細胞核的子集分配到包括第二索引序列的多個隔室中；(f)將第二索引序列合并到每個隔室中的索引核酸中以產生雙重索引核酸；以及(g)將雙重索引核酸的全部或子集組合以從多個細胞產生測序文庫。

6、在另一方面，本公開進一步提供了對包含來自多個單細胞或細胞核的核酸的文庫進行測序的方法。例如，但不作為限制，用于對包含來自多個單細胞或細胞核的核酸的文庫進行測序的方法包括：(a)提供與包含第一索引序列的核酸締合或包含核酸的混合細胞或細胞核，其中第一索引序列摻入到乳化液滴中的混合細胞或細胞核的核酸中；(b)將混合細胞或細胞核的子集分配到包括第二索引序列的多個隔室中；(c)將第二索引序列合并到每個隔室中的核酸中以產生雙重索引核酸；(d)將所述雙重索引核酸的全部或子集組合以從多個細胞產生測序文庫；以及(e)對所述雙重索引核酸的全部或子集進行測序。在某些實施例中，通過包括以下的方法將第一索引序列摻入到乳化液滴中的細胞或細胞核的核酸中：(i)使多個細胞或細胞核與包含第一索引序列的多個顆粒接觸；(ii)將單獨的顆粒和細胞或細胞核中的一個或多個劃分到乳化液滴中；(iii)將第一索引序列合并到細胞或細胞核的核酸中以產生索引核酸；以及(iv)將來自多個乳化液滴的與索引核酸締合或包含索引核酸的細胞或細胞核組合，以產生與包含第一索引序列的核酸締合或包含核酸的混合細胞或細胞核。

7、在某些實施例中，用于對包含來自多個單細胞或細胞核的核酸的文庫進行測序的方法包括：(a)使多個細胞或從多個細胞分離的細胞核與包含第一索引序列的多個顆粒接觸；(b)將單獨的顆粒和細胞或細胞核中的一個或多個劃分到乳化液滴中；(c)將第一索引序列合并到細胞或細胞核的核酸中以產生索引核酸；(d)將來自多個乳化液滴的含有索引核酸或與索引核酸相關聯的細胞或細胞核組合以產生混合索引細胞或細胞核；(e)將混合細胞或細胞核的子集分配到包括第二索引序列的多個隔室中；(f)將第二索引序列合并到每個隔室中的索引核酸中以產生雙重索引核酸；(g)將雙重索引核酸的全部或子集組合以從多個細胞產生測序文庫；以及(h)對雙重索引核酸的全部或子集進行測序。

8、在某些實施例中，本公開的方法可進一步包括將第三索引序列合并到雙重索引核酸中以產生三重索引核酸。

9、在某些實施例中，顆粒為珠子，例如，凝膠微珠。

10、在某些實施例中，乳化液滴在乳化液滴產生裝置中或使用乳化液滴產生技術產生。

11、在某些實施例中，乳化液滴包含至少兩個或更多個細胞或細胞核。

12、在某些實施例中，每個顆粒或顆粒的子集的第一索引序列相對于其他顆粒的第一索引序列是唯一的。在某些實施例中，一個隔室或隔室的子集中的第二索引序列相對于其他隔室的第二索引序列是唯一的。

13、在某些實施例中，通過進行擴增方法、反轉錄方法或連接方法來將第一索引序列摻入到核酸中。在某些實施例中，通過進行擴增方法或連接方法來將第二索引序列摻入到索引核酸中。在某些實施例中，擴增方法是聚合酶鏈反應(pcr)或等溫擴增方法。

14、在某些實施例中，在使多個細胞或從多個細胞分離的細胞核與包含第一索引序列的復數個顆粒接觸的步驟之前或期間，用轉位酶，例如，在轉位體復合物中處理細胞或細胞核。在某些實施例中，轉位酶是tn5轉位酶或其突變體。在某些實施例中，在使多個細胞或從多個細胞分離的細胞核與包含第一索引序列的多個顆粒接觸的步驟之前，用固定劑處理細胞或細胞核。在某些實施例中，在使多個細胞或從多個細胞分離的細胞核與包含第一索引序列的多個顆粒接觸的步驟之前，該多個細胞被透化或溶解。在某些實施例中，在使多個細胞或從多個細胞分離的細胞核與包含第一索引序列的多個顆粒接觸的步驟之前或期間，用多重試劑處理細胞或細胞核。

15、在某些實施例中，多個隔室是多孔板。在某些實施例中，多個隔室不是乳化液滴。

16、在某些實施例中，使用所公開的方法索引的核酸包含rna，例如，mrna。在某些實施例中，使用所公開的方法索引的核酸包含dna，例如，基因組dna。

17、在某些實施例中，多個細胞包含至少約100,000個細胞。

18、在某些實施例中，多個細胞包含多能干細胞、胚胎干細胞、體細胞、免疫細胞、癌細胞或其組合。在某些實施例中，多個細胞包含用基因編輯系統修飾的細胞、生產抗體的細胞、不同發育狀態的細胞、不同疾病狀態的細胞和/或用藥劑(例如，治療劑)處理的細胞。

19、在某些實施例中，本公開的方法進一步包括執行譜系追蹤方法。在某些實施例中，本公開的方法進一步包括執行基因組篩選。例如，但不作為限制，基因組篩選是基于crispr的篩選，例如，基因編輯crispr篩選、crispri篩選或crispra篩選。

20、在某些實施例中，本公開的方法進一步包括執行細胞散列技術。在某些實施例中，多個細胞或從多個細胞分離的細胞核是通過偶聯至包含條形碼的寡核苷酸的蛋白質結合試劑來結合的。例如，但不作為限制，本公開的方法可進一步包括在(a)之前使多個細胞或從多個細胞分離的細胞核與偶聯至包含條形碼的寡核苷酸的多種蛋白質結合試劑接觸。在某些實施例中，蛋白質結合試劑與位于多個細胞中的至少一個細胞或從多個細胞分離的細胞核的表面上的蛋白質結合。在某些實施例中，蛋白質結合試劑為抗體或其片段。在某些實施例中，本公開的方法進一步包括確定被蛋白質結合試劑結合的一種或多種蛋白質的表現含量。

21、在某些實施例中，本公開進一步提供用于進行本公開的方法的試劑盒。例如，但不作為限制，本公開的試劑盒可包括容器，該容器包括包含第一索引序列的多個顆粒。在某些實施例中，試劑盒可進一步包括容器，例如，微量滴定板，該容器包含多個第二索引序列。在某些實施例中，本公開的試劑盒包括容器，該容器包含偶聯至包含條形碼的寡核苷酸的一種或多種蛋白質結合試劑。在某些實施例中，蛋白質結合試劑為抗體或其片段。