本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測馬脲氣球菌的引物組合、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、氣球菌屬(aerococcus)為草綠色溶血菌落特征、觸酶陰性的革蘭陽性球菌。目前該菌屬有11個菌種，分別為綠色氣球菌(aerococcus?viridans)、馬脲氣球菌(aerococcusurinaeequi)、脲氣球菌(aerococcus?urinae)、血氣球菌(aerococcus?sanguinicola)、柯氏氣球菌(aerococcus?christensenii)、陰道氣球菌(aerococcus?vaginalis)、豬氣球菌(aerococcussuis)，以及從脲氣球菌(aerococcus?urinae)中新分離出的3個菌種aerococcus?loyolae、aerococcus?mictus、aerococcus?tenax。該菌屬廣泛存在于空氣、土壤、植物、醫(yī)療環(huán)境中，是重要的機會性感染病原菌，可造成臨床尿路感染、血流感染、心內(nèi)膜炎、骨與關(guān)節(jié)感染。

2、氣球菌屬的馬脲氣球菌是一種革蘭陽性球菌，以二聯(lián)、四聯(lián)或成簇形式存在，研究表明馬脲氣球菌對動物具有致病性，在患足趾炎蛋雞、牛的凍乳、病死鴨肝臟和脾臟、患有尿道炎犬和豬的尿液中均能分離到馬脲氣球菌。此外2016年有學(xué)者從慢性腎病患者的腹水中分離出馬脲氣球菌，表明該菌對人類也具有致病性，因此開發(fā)出準(zhǔn)確高效的馬脲氣球菌的檢測方法對病原菌的治療與防控至關(guān)重要。

3、全基因組測序的方法已應(yīng)用于馬脲氣球菌的種屬鑒定，此方法雖高效且較準(zhǔn)確，但需一定的儀器設(shè)備和較高的費用。由于生化鑒定及質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫存在缺陷，尚無法實現(xiàn)對馬脲氣球菌的準(zhǔn)確鑒定。pcr技術(shù)因具有高效性和可靠性已在微生物檢測方面被廣泛應(yīng)用，在pcr檢測技術(shù)中，引物具有至關(guān)重要的作用，決定著pcr檢測的特異性和效率。目前開發(fā)的pcr方法由于引物和檢測條件存在缺陷，對馬脲氣球菌的檢測特異性不強，無法準(zhǔn)確鑒定出待測樣本是否為馬脲氣球菌，因此存在一定的局限性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種檢測馬脲氣球菌的引物組合、試劑盒及方法，利用本發(fā)明提供的引物組合、試劑盒或檢測方法，可以快速特異性的鑒定出馬脲氣球菌，對馬脲氣球菌和綠色氣球菌進(jìn)行區(qū)分。

2、本發(fā)明第一方面提供了一種檢測馬脲氣球菌的引物組合，所述引物組合包含上游引物和下游引物，具體序列為：

3、上游引物：5’-aaagcttacgaaaagcagca-3’，

4、下游引物：5’-ccaatttgtaagtgagcgc-3’。

5、本發(fā)明第二方面提供了一種檢測馬脲氣球菌的試劑盒，所述試劑盒包括上述所述的引物組合。

6、進(jìn)一步地，試劑盒還包括dntp、pcr穩(wěn)定劑、taq?dna聚合酶和pcr緩沖液。

7、本發(fā)明第三方面提供了一種上述引物組合或上述試劑盒在檢測馬脲氣球菌中的應(yīng)用。

8、進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為用于區(qū)分馬脲氣球菌與綠色氣球菌。

9、本發(fā)明第四方面提供了一種檢測馬脲氣球菌的方法，所述方法需利用本發(fā)明第一方面提供的引物組合或本發(fā)明第二方面提供的試劑盒對待測樣品進(jìn)行檢測。

10、進(jìn)一步地，所述檢測馬脲氣球菌的具體步驟如下：

11、提取待測樣品的dna；

12、用所述引物組合或所述試劑盒對提取的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；

13、將pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析；

14、當(dāng)所述擴(kuò)增產(chǎn)物含有401bp的片段表示待測樣品含有馬脲氣球菌基因。

15、進(jìn)一步地，所述pcr的擴(kuò)增體系為：待測樣品dna模板2～5μl、2～3μl、下游引物2～3μl、pcr?mix?25～27μl，無菌去離子水補足至50μl。

16、優(yōu)選地，所述pcr的擴(kuò)增體系為：待測樣品dna模板2μl、上游引物2μl、下游引物2μl、pcr?mix?25μl，無菌去離子水補足至50μl。

17、進(jìn)一步地，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序為：(1)預(yù)變性；(2)變性；退火：52～56℃，30s；延伸；共30～32個循環(huán)；(3)終末延伸。

18、優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序為：(1)預(yù)變性；(2)變性；退火：54℃，30s；延伸；共30個循環(huán)；(3)終末延伸。

19、綜上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點及效果：

20、(1)本發(fā)明提供了一種用于檢測馬脲氣球菌的引物組合，該引物組合具有較高的特異性，可以用于檢測馬脲氣球菌。本發(fā)明提供的pcr檢測方法操作簡單、成本低、特異性強、檢測速度快，對馬脲氣球菌的檢測及研究具有重要現(xiàn)實意義。

21、(2)馬脲氣球菌與綠色氣球菌同屬于氣球菌屬，但因馬脲氣球菌與綠色氣球菌的16s?rrna基因僅存在1～2個堿基差異，通過常規(guī)pcr方法和引物不能對馬脲氣球菌和綠色氣球菌進(jìn)行區(qū)分，利用本發(fā)明提供特異性的引物組合，可以對馬脲氣球菌進(jìn)行鑒定，區(qū)分馬脲氣球菌和綠色氣球菌。

技術(shù)特征：

1.一種檢測馬脲氣球菌的引物組合，其特征在于，所述引物組合包含上游引物和下游引物，具體序列為：

2.一種檢測馬脲氣球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物組合。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：dntp、pcr穩(wěn)定劑、taq?dna聚合酶和pcr緩沖液。

4.一種權(quán)利要求1所述引物組合或權(quán)利要求2所述試劑盒在檢測馬脲氣球菌中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為用于區(qū)分馬脲氣球菌與綠色氣球菌。

6.一種檢測馬脲氣球菌的方法，其特征在于，所述方法需利用權(quán)利要求1所述的引物組合或權(quán)利要求2所述的試劑盒對待測樣品進(jìn)行檢測。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法具體步驟如下：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述pcr的擴(kuò)增體系為：待測樣品dna模板2～5μl、上游引物2～3μl、下游引物2～3μl、pcrmix?25～27μl，無菌去離子水補足至50μl。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序為：(1)預(yù)變性；(2)變性；退火：52～56℃，30s；延伸；共30～32個循環(huán)；(3)終末延伸。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測馬脲氣球菌的引物組合、試劑盒及方法。所述引物組合包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。利用本發(fā)明提供的引物組合、試劑盒和PCR檢測方法可以對馬脲氣球菌和綠色氣球菌進(jìn)行區(qū)分，本發(fā)明提供的PCR檢測方法可以高效快速、特異性的檢測馬脲氣球菌。

技術(shù)研發(fā)人員：郭偉娜,王海龍,馬佳敏,賀紹君,李文超
受保護(hù)的技術(shù)使用者：安徽科技學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/3/10