本發明屬于脫鹵酶穩定性提高，具體涉及一種通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法。

背景技術：

1、為符合綠色消毒發展需求，通過生物催化的方式降解h類毒劑已逐漸成為軍事消毒領域的重要研究方向。烷基鹵脫鹵酶(haloalkane?dehalogenases，hld，ec?3.8.1.5)凍干粉可作為洗消h類毒劑的酶源，脫鹵酶對芥子氣(hd)具有催化水解和脫毒的作用，是目前催化降解hd效果最好的脫鹵酶之一。雖然目前國內外均有各類不同的酶基洗消劑用于化學毒劑的洗消，但是普遍存在同一種洗消劑無法兼顧多種底物、洗消效率低、環境耐受性差及催化過程中會產生有毒副產物的問題。為此，國內外軍方開始在脫鹵酶基因工程方面進行深入研究，期望從基因改造的角度，實現脫鹵酶穩定性的提高。

2、生物礦化是自然界中普遍存在的現象，可將有機物如蛋白質和無機物聯系起來。研究表明，在一些礦化蛋白中某些氨基酸序列構成的多肽是引導礦化發生的主要角色。因此，可以通過基因工程的手段將礦化多肽與目的蛋白融合，從而賦予它們良好的生物礦化能力，進而提高脫鹵酶的穩定性。

技術實現思路

1、(一)要解決的技術問題

2、本發明提出一種通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，以提高脫鹵酶對外界環境穩定性的技術問題。

3、(二)技術方案

4、為了解決上述技術問題，本發明提出一種通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，該方法包括如下步驟：

5、s1.構建表達重組脫鹵酶菌株

6、脫鹵酶的重組質粒轉化到感受態細胞中，過夜培養，得到重組菌株；挑取單菌落于培養基中，培養過夜；轉接到培養基中，培養至od600＝0.6～0.8；加入iptg誘導過夜；離心收集菌體，得到重組脫鹵酶；

7、s2.重組脫鹵酶的純化

8、將重組菌株單菌落于培養基中，培養過夜；轉接到培養基中，培養至od600＝0.6-0.8；加入iptg誘導過夜，收集菌體，利用超聲破碎法裂解菌體，高速離心收集破碎上清；純化破碎上清液中的目的蛋白，得到純化的重組脫鹵酶；

9、s3.進行脫鹵酶生物礦化

10、采用體外原位礦化的方法，在步驟s2得到的純化的重組脫鹵酶中加入cacl2溶液和磷酸鹽緩沖液，進行脫鹵酶生物礦化。

11、進一步地，步驟s1中，脫鹵酶的重組質粒轉化到感受態細胞中，涂板后倒置放在37℃烘箱里過夜培養，得到重組菌株；挑取單菌落于液體lb培養基中，37℃搖床內以150rpm的轉速振蕩培養過夜；第二天按1％(v/v)的比例轉接到液體lb培養基中，37℃搖床內以200rpm的轉速振蕩培養至od600＝0.6～0.8；加入終濃度為1mm的iptg誘導過夜；離心收集菌體，得到重組脫鹵酶。

12、進一步地，步驟s2中，將重組菌株單菌落于液體lb培養基中，37℃搖床內以150rpm的轉速振蕩培養過夜；第二天按1％(v/v)的比例轉接到液體lb培養基中，37℃搖床內以200rpm的轉速振蕩培養至od600＝0.6-0.8；加入終濃度為1mm的iptg誘導過夜，收集菌體，利用超聲破碎法裂解菌體，高速離心收集破碎上清；純化破碎上清液中的目的蛋白，得到純化的重組脫鹵酶。

13、進一步地，加入終濃度為1mm的iptg誘導過夜的溫度為18℃。

14、進一步地，步驟s2中，采用鎳柱親和層析法純化破碎上清液中的目的蛋白。

15、進一步地，步驟s3中，采用體外原位礦化的方法，在0.2mg重組脫鹵酶中加入cacl2溶液和磷酸鹽緩沖液，進行脫鹵酶生物礦化。

16、進一步地，步驟s3中，礦化時間為4小時。

17、進一步地，步驟s3中，cacl2溶液中鈣離子濃度為10mm。

18、進一步地，步驟s3中，蛋白濃度為0.1mg/ml。

19、(三)有益效果

20、本發明提出一種通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，包括構建表達重組脫鹵酶菌株，重組脫鹵酶的純化，以及進行脫鹵酶生物礦化。本發明通過基因工程，對脫鹵酶進行基因改造，使其與可誘導礦化的多肽共表達，得到帶有礦化肽的重組脫鹵酶，可以在溫和條件下形成礦化沉淀，本發明利用固定化策略，能夠顯著提高脫鹵酶的熱穩定性。

技術特征：

1.一種通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

2.如權利要求1所述的通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，其特征在于，步驟s1中，脫鹵酶的重組質粒轉化到感受態細胞中，涂板后倒置放在37℃烘箱里過夜培養，得到重組菌株；挑取單菌落于液體lb培養基中，37℃搖床內以150rpm的轉速振蕩培養過夜；第二天按1％(v/v)的比例轉接到液體lb培養基中，37℃搖床內以200rpm的轉速振蕩培養至od600＝0.6～0.8；加入終濃度為1mm的iptg誘導過夜；離心收集菌體，得到重組脫鹵酶。

3.如權利要求1所述的通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，其特征在于，步驟s2中，將重組菌株單菌落于液體lb培養基中，37℃搖床內以150rpm的轉速振蕩培養過夜；第二天按1％(v/v)的比例轉接到液體lb培養基中，37℃搖床內以200rpm的轉速振蕩培養至od600＝0.6-0.8；加入終濃度為1mm的iptg誘導過夜，收集菌體，利用超聲破碎法裂解菌體，高速離心收集破碎上清；純化破碎上清液中的目的蛋白，得到純化的重組脫鹵酶。

4.如權利要求3所述的通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，其特征在于，加入終濃度為1mm的iptg誘導過夜的溫度為18℃。

5.如權利要求1所述的通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，其特征在于，步驟s2中，采用鎳柱親和層析法純化破碎上清液中的目的蛋白。

6.如權利要求1所述的通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，其特征在于，步驟s3中，采用體外原位礦化的方法，在0.2mg重組脫鹵酶中加入cacl2溶液和磷酸鹽緩沖液，進行脫鹵酶生物礦化。

7.如權利要求1所述的通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，其特征在于，步驟s3中，礦化時間為4小時。

8.如權利要求1所述的通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，其特征在于，步驟s3中，cacl2溶液中鈣離子濃度為10mm。

9.如權利要求1所述的通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，其特征在于，步驟s3中，蛋白濃度為0.1mg/ml。

技術總結
本發明提出一種通過生物礦化技術提高脫鹵酶穩定性的方法，包括構建表達重組脫鹵酶菌株，重組脫鹵酶的純化，以及進行脫鹵酶生物礦化。本發明通過基因工程，對脫鹵酶進行基因改造，使其與可誘導礦化的多肽共表達，得到帶有礦化肽的重組脫鹵酶，可以在溫和條件下形成礦化沉淀，本發明利用固定化策略，能夠顯著提高脫鹵酶的熱穩定性。

技術研發人員：郭旋,侯文杰,劉洋,于瓊
受保護的技術使用者：中國人民解放軍軍事科學院防化研究院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24