本發(fā)明涉及黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶及在重組解脂亞洛酵母中應(yīng)用，屬于基因工程及生物工程。

背景技術(shù)：

1、橙皮素是一種天然存在的o-甲基化黃酮類化合物，在水果、花朵和各種植物的其他部位中富含。它具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和抗衰老等多種生物活性，在醫(yī)學(xué)、膳食補(bǔ)充劑和食品添加劑方面具有重要的應(yīng)用潛力。橙皮素主要通過(guò)化學(xué)合成和植物提取生產(chǎn)。這兩種方法都有缺點(diǎn)。植物提取需要大量的植物原料，并受到季節(jié)性生長(zhǎng)和地理可用性的限制。化學(xué)合成需要復(fù)雜的程序，產(chǎn)率低，依賴于有毒試劑和嚴(yán)格的極性反應(yīng)條件。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展和對(duì)橙皮素生物合成途徑的分析，微生物生物合成因其操作簡(jiǎn)單、環(huán)保、高產(chǎn)、低成本的優(yōu)點(diǎn)，成為一種有前景的橙皮素生產(chǎn)策略，為傳統(tǒng)方法提供了一種可持續(xù)的替代方案。

2、盡管在微生物合成橙皮素的研究取得了一些進(jìn)展，但是從頭合成的滴度仍然相對(duì)較低。這一限制主要源于黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性較弱，它優(yōu)先催化柚皮素轉(zhuǎn)化為異櫻花素，而不是催化圣草酚轉(zhuǎn)化為橙皮素。因此，至關(guān)重要的是鑒定或設(shè)計(jì)一種對(duì)底物圣草酚具有更強(qiáng)催化特異性的黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶。茶枝柑和化州柚中富含甲基黃酮包括橙皮素，所以從這兩種植物基因組中挖掘新的黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶也為提高從頭合成橙皮素的滴度提供了思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶，具有seq?id?no.1或seq?id?no.2所示的氨基酸序列。

2、本發(fā)明還提供了編碼所述黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因。

3、在一種實(shí)施方式中，所述基因具有seq?id?no.7或seq?id?no.10所示的核苷酸序列。

4、本發(fā)明還提供了所述黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶在催化柚皮素和/或圣草酚合成橙皮素方面的應(yīng)用。

5、本發(fā)明還提供了表達(dá)所述黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的重組微生物。

6、在一種實(shí)施方式中，所述微生物包括但不限于解脂亞洛酵母。

7、本發(fā)明提供了表達(dá)所述黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的解脂亞洛酵母工程菌。

8、在一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)包括但不限于整合表達(dá)。

9、在一種實(shí)施方式中，所述黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因整合在rdna和/或zeta位點(diǎn)。

10、在一種實(shí)施方式中，所述黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因crcomt-2分別整合在rdna和zeta位點(diǎn)。

11、在一種實(shí)施方式中，所述黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因cgtomt-3分別整合在rdna和zeta位點(diǎn)。

12、在一種實(shí)施方式中，所述黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶由啟動(dòng)子ptef起始轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子ptef的核苷酸序列如seq?id?no.11所示。

13、在一種實(shí)施方式中，所述解脂亞洛酵母ye26是在解脂亞洛酵母po1f的基礎(chǔ)上具有d17::ptef-fjtal-txpr2-ptef-at4cl1-txpr2-php4d-phchs-txpr2-ptef-mschi-txpr2；axp::ptef-ghf3′h-txpr2-ptef-smcpr-txpr2；f1-3::ptef-aro1-txpr2-ptef-aro2-txpr2-ptef-aro4k221l-txpr2-ptef-aro7g139s-txpr2；a3::ptef-zmtyrc-txpr2所示改進(jìn)的菌株；所述解脂亞洛酵母ye26已公開(kāi)于論文《high-level?de?novo?production?of(2s)-eriodictyol?in?yarrowialipolytica?by?metabolic?pathway?and?nadph?regeneration?engineering》中。

14、本發(fā)明還提供了所述解脂亞洛酵母工程菌在生產(chǎn)橙皮素中的應(yīng)用。

15、在一種實(shí)施方式中，將所述解脂亞洛酵母工程菌在培養(yǎng)基中，于28～30℃發(fā)酵至少120h。

16、在一種實(shí)施方式中，發(fā)酵過(guò)程中還進(jìn)行補(bǔ)料。

17、在一種實(shí)施方式中，所述補(bǔ)料包括但不限于補(bǔ)充葡萄糖，以控制發(fā)酵體系中葡萄糖濃度為0.3～1g/l。

18、本發(fā)明還提供了所述黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶，或所述基因，或所述重組微生物，或所述解脂亞洛酵母工程菌，或所述方法在制備橙皮素或含橙皮素的產(chǎn)品方面的應(yīng)用。

19、在一種實(shí)施方式中，所述產(chǎn)品包括但不限于食品、藥物或保健品。

20、有益效果：

21、本發(fā)明篩選并鑒定了來(lái)源于茶枝柑和化州柚的新的黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶；將篩選獲得的黃酮4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶crcomt-2和cgtomt-3分別在解脂亞洛酵母ye26基因組上多拷貝位點(diǎn)rdna和zeta位點(diǎn)整合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了橙皮素的從頭合成。本發(fā)明構(gòu)建的解脂亞洛酵母z02在5l發(fā)酵罐上實(shí)現(xiàn)了130.2mg/l橙皮素的從頭合成，這也是已報(bào)道的橙皮素在微生物中從頭合成的最高產(chǎn)量，為后續(xù)的黃酮類化合物生物合成奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.黃酮4'-o-甲基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，具有seq?id?no.1或seq?id?no.2所示的氨基酸序列。

2.編碼權(quán)利要求1所述黃酮4'-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因。

3.表達(dá)權(quán)利要求1所述黃酮4'-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的重組微生物。

4.解脂亞洛酵母工程菌，其特征在于，表達(dá)權(quán)利要求1所述的黃酮4'-o-甲基轉(zhuǎn)移酶或權(quán)利要求2所述的基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的解脂亞洛酵母工程菌，其特征在于，在基因組上rdna和/或zeta位點(diǎn)整合權(quán)利要求2所述的基因。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的解脂亞洛酵母工程菌，其特征在于，所述黃酮4'-o-甲基轉(zhuǎn)移酶由啟動(dòng)子ptef調(diào)控表達(dá)。

7.權(quán)利要求1所述的黃酮4'-o-甲基轉(zhuǎn)移酶在催化柚皮素和/或圣草酚合成橙皮素方面的應(yīng)用。

8.一種制備橙皮素的方法，其特征在于，將權(quán)利要求4～6任一所述的解脂亞洛酵母工程菌在培養(yǎng)基中，于28～30℃發(fā)酵。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，發(fā)酵過(guò)程中還進(jìn)行補(bǔ)料，所述補(bǔ)料包括但不限于補(bǔ)充葡萄糖。

10.權(quán)利要求1所述的黃酮4'-o-甲基轉(zhuǎn)移酶，或權(quán)利要求2所述的基因，或權(quán)利要求3所述的重組微生物，或權(quán)利要求4～6任一所述的解脂亞洛酵母工程菌，或權(quán)利要求8～9任一所述方法在制備橙皮素或含橙皮素的產(chǎn)品方面的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了黃酮4'?O?甲基轉(zhuǎn)移酶及在生產(chǎn)橙皮素中應(yīng)用，屬于基因工程和生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明篩選并鑒定了來(lái)源于茶枝柑和化州柚的新的黃酮4'?O?甲基轉(zhuǎn)移酶；將篩選獲得的黃酮4'?O?甲基轉(zhuǎn)移酶CrcOMT?2和CgtOMT?3分別在解脂亞洛酵母YE26基因組上多拷貝位點(diǎn)rDNA和ZETA位點(diǎn)整合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了橙皮素的從頭合成。本發(fā)明構(gòu)建的解脂亞洛酵母Z02在5L發(fā)酵罐上實(shí)現(xiàn)了130.2mg/L橙皮素的從頭合成，這也是已報(bào)道的橙皮素在微生物中從頭合成的最高產(chǎn)量，為后續(xù)的黃酮類化合物生物合成奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：周景文,唐斌,王熠赟,黃瑞球,黃東亮,徐沙,曾偉主
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24