本發(fā)明屬于核酸檢測，具體涉及一種定量檢測人巨細(xì)胞病毒核酸的引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、人巨細(xì)胞病毒（human?cytomegaloviyns，hcmv）即人類皰疹病毒5型（hhv-5），為皰疹科β屬的雙鏈dna病毒。hcmv在人群中感染廣泛，不同地區(qū)感染率從40%到90%不等,中國成人感染率達(dá)80%～97%。hcmv是出生前感染和圍產(chǎn)期感染的常見病原體，造成孕婦的宮內(nèi)感染并引起母嬰間的傳播感染，導(dǎo)致胎兒的流產(chǎn)、畸形、死胎、早產(chǎn)、智商降低、聽力減退、新生兒巨細(xì)胞病毒性肝炎等嚴(yán)重后果。成人多為隱性感染，免疫功能低下時(shí)，如艾滋病患者、放射損傷、器官移植或造血干細(xì)胞移植、多次輸血和惡性腫瘤等，體內(nèi)潛伏病毒易被激活，出現(xiàn)活動(dòng)性hcmv?感染,引起嚴(yán)重并發(fā)感染,?甚至死亡，是器官移植失敗和艾滋病患者并發(fā)感染死亡的主要原因之一。hcmv主要通過接觸傳播感染，常潛伏在腎、唾液腺、乳腺及其他腺體中，感染者可長期或間隙地經(jīng)口腔、生殖道、胎盤、輸血或器官移植等多途徑，由唾液、乳汁、血液、尿液、精液、子宮分泌物等多種介質(zhì)攜帶排出病毒進(jìn)行傳播。

2、實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要有病毒分離培養(yǎng)、病毒抗原血癥檢測、血清學(xué)檢測、病毒核酸檢測等，病毒分離培養(yǎng)與血清學(xué)檢測耗時(shí)長、靈敏度低、培養(yǎng)要求高且容易出現(xiàn)假陰性，病毒抗原血癥檢測僅適合于血標(biāo)本、標(biāo)本延遲處理影響檢測結(jié)果、不適用于骨髓移植術(shù)后早期或使用抗病毒藥物的患者。hcmv核酸檢測可用于臨床上各種標(biāo)本，標(biāo)本需要量少且可以儲(chǔ)存，特異性強(qiáng),?敏感性高，快速簡便，可自動(dòng)化檢測。

3、鑒于此，本發(fā)明提出了一種定量檢測人巨細(xì)胞病毒核酸的引物、探針、試劑盒及方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測人巨細(xì)胞病毒核酸的引物、探針、試劑盒及方法。本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)，以hcmv的保守區(qū)為靶區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，實(shí)現(xiàn)人巨細(xì)胞病毒核酸的定量檢測。本發(fā)明設(shè)置特定的外源性內(nèi)標(biāo)，對(duì)待測樣本dna提取及pcr反應(yīng)擴(kuò)增效率等過程進(jìn)行全程監(jiān)控，避免因樣本中存在抑制物或操作失誤所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。本發(fā)明所述試劑盒的靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性范圍廣，能夠用于人巨細(xì)胞病毒的快速診斷、評(píng)估藥物的治療效果，為臨床巨細(xì)胞病毒感染的檢測、療效、預(yù)后判斷提供更好的診斷方法。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種定量檢測人巨細(xì)胞病毒核酸的引物和探針組合，所述引物包括如下序列：

4、擴(kuò)增hcmv保守區(qū)的引物序列如seq?id?no.1-2所示，具體序列包括：

5、seq?id?no.1：atcagccatgtatggatgcca；

6、seq?id?no.2：gttctgacgagacgtgaggtaa；

7、擴(kuò)增外源性內(nèi)標(biāo)的引物序列如seq?id?no.3-4所示，具體序列包括：

8、seq?id?no.3：tgtagctacgagcctaagttg；

9、seq?id?no.4：ctgagtattgtccattgagaacgg；

10、所述探針包括如下序列：

11、擴(kuò)增hcmv保守區(qū)的探針序列如seq?id?no.5所示，具體序列包括：

12、seq?id?no.5：caatgttaacatcagctgccgcg；

13、擴(kuò)增外源性內(nèi)標(biāo)的探針序列如seq?id?no.6所示，具體序列包括：

14、seq?id?no.6：cagcgcacattctgcgccacg。

15、本發(fā)明所述引物和探針組合用于定量檢測hcmv及外源性內(nèi)標(biāo)；其中，hcmv保守區(qū)（靶區(qū)域）為ul18保守區(qū)。外源性內(nèi)標(biāo)包括對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒、對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病毒、對(duì)蝦黃頭病病毒中的一種或幾種。在一些實(shí)施例中，所述外源性內(nèi)標(biāo)為對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒。

16、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述探針的5’和?3’端分別帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，其中熒光基團(tuán)選自fam、hex、vic、tet、tamra、rox、cy3.5、cy5中的任意一種或幾種；淬滅基團(tuán)選自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、mgb中的任意一種或幾種。

17、第二方面，本發(fā)明提供一種所述引物和探針組合在制備定量檢測人巨細(xì)胞病毒核酸的試劑盒中的應(yīng)用。

18、第三方面，本發(fā)明提供一種定量檢測人巨細(xì)胞病毒核酸的試劑盒，所述試劑盒包括人巨細(xì)胞病毒反應(yīng)液、核酸擴(kuò)增反應(yīng)液、內(nèi)標(biāo)對(duì)照、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照、人巨細(xì)胞病毒定量參考品q1-q4；其中，所述人巨細(xì)胞病毒反應(yīng)液包括所述引物和探針組合；其中，各引物濃度為0.1～0.5μm/l，各探針濃度為0.05～0.3μm/l。

19、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述人巨細(xì)胞病毒反應(yīng)液還包括1:500～1:1200（v/v）rox?reference?dye、10～50mm?tris-hcl（ph?8.0）、0.01～0.5mm?edta、去rna酶水。

20、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)液包括10～50mm?tris-hcl（ph8.0）、50～500mm?kcl、2～4mm?mgcl2、0.05～0.5mm?dntps（datp：dttp：dgtp：dctp：dutp?=1:1:1:1:1）、1～2u?taq?dna聚合酶、0.05～0.1u?ung酶、去rna酶水。采用ung酶防污染措施，避免可能由于產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。

21、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述內(nèi)標(biāo)對(duì)照為（人工構(gòu)建的）內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒。

22、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述陰性對(duì)照為人陰性血清。

23、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述陽性對(duì)照和臨界陽性對(duì)照均為（含有適量的）人巨細(xì)胞病毒重組質(zhì)粒，其中陽性對(duì)照濃度（經(jīng)國際參考品溯源）為1×106～1×107iu/ml，臨界陽性對(duì)照濃度（經(jīng)國際參考品溯源）為1×103～1×104iu/ml。

24、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述人巨細(xì)胞病毒定量參考品q1-q4為（定值的）人巨細(xì)胞病毒重組質(zhì)粒，其濃度（經(jīng)國際參考品溯源）依次為2～8×108iu/ml、2～8×107iu/ml、2～8×106iu/ml、2～8×105iu/ml。

25、第四方面，本發(fā)明提供一種基于非診斷目的利用所述試劑盒定量檢測人巨細(xì)胞病毒核酸的方法，包括以下步驟：

26、s1、配制pcr反應(yīng)液：將核酸擴(kuò)增反應(yīng)液、人巨細(xì)胞病毒反應(yīng)液混合，分裝至pcr反應(yīng)管；

27、s2、核酸提取：向待測樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照和人巨細(xì)胞病毒定量參考品q1-q4中分別加入內(nèi)標(biāo)對(duì)照，進(jìn)行核酸提?。?/p>

28、s3、加樣：將步驟s2中提取的核酸分別加入到步驟s1中各pcr反應(yīng)管中；

29、s4、熒光pcr擴(kuò)增：將步驟s3獲得的pcr反應(yīng)管放入熒光定量pcr儀中，進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增；

30、s5、結(jié)果判讀。

31、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，步驟s1中，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的加量為25μl/人份，所述人巨細(xì)胞病毒反應(yīng)液的加量為5μl/人份。按30μl/管分裝至pcr反應(yīng)管中。

32、本發(fā)明步驟s2中，樣本核酸提取采用江蘇碩世生物科技股份有限公司的核酸提取或純化試劑盒（備案編號(hào)：蘇泰械備20140001號(hào)、蘇泰械備20150256號(hào)），待測樣本與陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照和定量參考品各取200μl同步進(jìn)行核酸提取，核酸提取時(shí)均先分別加入10μl內(nèi)標(biāo)對(duì)照，提取的核酸溶液保存?zhèn)溆?。樣本核酸提取還包括采用qiagen公司的qiaamp??dna?mini?kit（貨號(hào)：51304）和roche公司的high?pure?viral?nucleic?acidkit提取試劑盒（貨號(hào)：11858874001），操作方法按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

33、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，步驟s3中，各pcr反應(yīng)管中核酸的加入量為20μl，終體積為50μl/管。加樣后蓋緊管蓋，瞬時(shí)離心。

34、本發(fā)明步驟s4中，將pcr反應(yīng)管放入熒光定量pcr儀中，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照、定量參考品q1~q4以及待測樣本，并設(shè)置樣本名稱及定量參考品濃度。

35、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，步驟s4中，所述熒光定量pcr儀包括abi?7500?熒光定量pcr儀、roche?lightcycler??480?ii?熒光定量pcr儀、上海宏石slan-96p/s?熒光定量pcr儀中的任意一種；其中，abi?7500熒光定量pcr儀參比熒光（passive?reference）設(shè)置為rox，淬滅基團(tuán)選none。上述熒光定量pcr儀反應(yīng)結(jié)束自動(dòng)保存結(jié)果，自動(dòng)或手動(dòng)設(shè)置熒光基線與閾值后，對(duì)樣品進(jìn)行結(jié)果分析。

36、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，步驟s4中，熒光pcr擴(kuò)增按照以下程序進(jìn)行：37℃5min；95℃?10min；95℃?10s，58℃?40s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

37、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，步驟s5中，所述結(jié)果判讀包括：

38、質(zhì)量控制：陰性對(duì)照的fam通道無明顯s型擴(kuò)增曲線或undet，vic通道的ct值≤36.0；陽性對(duì)照和臨界陽性對(duì)照的fam通道為陽性、呈明顯s型擴(kuò)增曲線且檢測濃度位于上述允許范圍內(nèi)，vic通道的ct值≤36.0；人巨細(xì)胞病毒定量參考品q1~q4的檢測結(jié)果均為陽性、呈明顯s型擴(kuò)增曲線且標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)|r|≥0.980，vic通道的ct值≤36.0。

39、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照和人巨細(xì)胞病毒定量參考品q1~q4需要同時(shí)滿足上述質(zhì)量控制要求，才可以進(jìn)行樣本的檢測結(jié)果判讀。

40、定性結(jié)果判讀：fam通道檢測結(jié)果ct值＞42.0或無數(shù)值，且內(nèi)標(biāo)對(duì)照ct值≤36.0，表示該樣本為hcmv?dna陰性或該樣本低于試劑盒最低檢出限；fam通道檢測結(jié)果ct值≤42.0，表示該樣本為hcmv?dna陽性。

41、定量結(jié)果判讀：fam通道的hcmv?dna檢測值為5×102~5×109iu/ml，且vic通道的內(nèi)標(biāo)ct值≤36.0，表示被測樣本中hcmv?dna的定量值，報(bào)告hcmv?dna=檢測值iu/ml；fam通道的hcmv?dna檢測值＞5×109iu/ml，且vic通道的內(nèi)標(biāo)ct值無要求，表示被測樣本中hcmvdna的定量值大于5×109iu/ml，報(bào)告注明>5×109iu/ml，報(bào)告hcmv?dna＞5×109iu/ml，如果需精確定量，可根據(jù)結(jié)果將樣本稀釋至試劑盒定量檢測線性范圍內(nèi)重新測定，測定結(jié)果以稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正；fam通道的hcmv?dna檢測值＜5×102iu/ml，且vic通道的內(nèi)標(biāo)ct值≤36.0，表示被測樣本中hcmv?dna的濃度低于試劑盒定量線性范圍，定量值僅供參考，報(bào)告hcmv?dna＜5×102iu/ml；fam通道的hcmv?dna檢測值無數(shù)值，且vic通道的內(nèi)標(biāo)ct值≤36.0，表示被測樣本中無hcmv?dna或濃度低于該試劑盒最低檢出限，報(bào)告hcmv?dna無數(shù)值或ct值為undet。

42、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

43、1、本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)，以hcmv和內(nèi)標(biāo)的保守區(qū)為靶區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，分別通過fam和vic標(biāo)記的探針，實(shí)現(xiàn)人巨細(xì)胞病毒的核酸定量檢測，最低檢出限為100iu/ml（即67?copies/ml）、線性范圍為5.0×102iu/ml～5.0×109iu/ml（即3.35×102copies/ml～3.35×109copies/ml）。

44、2、本發(fā)明設(shè)置了外源性內(nèi)標(biāo)，有效避免內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)造成的人源性污染及對(duì)靶標(biāo)病毒基因的競爭性抑制，可以有效鑒別由pcr抑制所致的假陰性。采用ung酶防污染措施，避免可能由于產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。使用rox?reference?dye以減少定量pcr管與管之間的差異，增加hcmv載量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

45、3、本發(fā)明可配套全自動(dòng)核酸提取儀，檢測96個(gè)樣本（從樣本處理開始）僅需2小時(shí)。另外，本發(fā)明采用國際單位iu/ml作為定量單位，可溯源至英國國家生物制品檢定所hcmv國際標(biāo)準(zhǔn)品（nibsc?code:?09/162），并得出iu/ml和copies/ml的換算關(guān)系，實(shí)現(xiàn)hcmv定量的標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)一化。

46、4、本發(fā)明具有靈敏度高、線性范圍寬、準(zhǔn)確度高、特異性和重復(fù)性好、操作簡便、檢測時(shí)間短、有效防污染體系及獨(dú)特內(nèi)標(biāo)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛推廣到臨床使用。