本發明涉及動物遺傳工程領域，特別是涉及一種靶向敲除app基因的sgrna及其應用。

背景技術：

1、非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、熱性、高接觸性傳染病，已被證明對全球豬肉行業造成破壞性影響；通常表現為全身出血、神經癥狀和呼吸困難等臨床癥狀，且發病時間短，致死率高。非洲豬瘟病毒（african?swine?fever?virus，asfv）是非洲豬瘟病毒科（asfarviridae）和非洲豬瘟病毒屬（asfivirus）的唯一成員，是一種大型雙鏈dna蟲媒病毒。非洲豬瘟的主要傳染源是感染豬和帶毒豬，受感染的組織、血液、豬的分泌物和排泄物中都含有病毒，病毒可附著在飼料、運輸車等物體進行傳播，除直接接觸傳播外，asfv還能通過蜱蟲進行傳播。

2、目前認為asfv的入侵途徑主要有網格蛋白介導的內吞途徑(cme)和巨胞飲途徑。有報道指出cd163是asfv入侵的受體。但popescu等的研究表明該受體在某些情況下對于asfv感染不是必需的。因此參與病毒進入細胞的受體身份目前仍未知的，對抗病育種的開展造成極大的困擾。

3、病毒蛋白pe248r位于病毒內膜，其參與asfv進入早期進程。asfv通過cme或巨胞飲途徑進入到細胞，需要從內吞途徑形成的內體中脫膜并被釋放到胞質中。asfv脫膜涉及多囊泡晚期內體中病毒體外層（外膜和蛋白衣殼）的損失，以及內膜與內體的后期融合，從而將裸核釋放到細胞質中。其中pe248r與病毒的脫膜密切相關。rodríguez等使用pe248r缺陷病毒顆粒進行研究，其發現pe248r缺陷病毒的感染力至少降低了100倍，而pe248r蛋白的缺失既不影響病毒的結合，也不影響病毒的內化，但沒有引起細胞病變，并能使早期和晚期的基因表達受到損害，這表明該蛋白對于病毒的感染和早期進入是必需的。而近期的研究也指出該蛋白參與內膜與多囊泡內體膜的融合，是核釋放關鍵因素。

4、app基因常報道為阿爾茲海默癥治療的關鍵基因，但也有研究發現app基因常與巨噬細胞的內吞作用相關，且在豬肺泡巨噬細胞上高表達。因此，app基因的研究可以為非洲豬瘟病毒感染相關研究提供理論依據，而app基因敲除的研究將為進一步研究app受體在asfv感染過程中發揮的具體作用奠定基礎。目前app基因敲除的克隆豬尚未見報道。

技術實現思路

1、本發明的目的是提供一種靶向敲除app基因的sgrna及其應用，以解決上述現有技術存在的問題，利用sgrna構建的非洲豬瘟病毒受體app敲除豬，豬體內app基因不表達，以此獲得非洲豬瘟病毒抗性豬，這為抗非洲豬瘟育種研究奠定基礎。

2、為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

3、本發明提供一種靶向敲除app基因的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seq?idno.1-2所示或者seq?id?no.3-4所示。

4、本發明還提供用于編碼所述的sgrna的dna分子。

5、本發明還提供含有所述的sgrna的重組載體。

6、本發明還提供一種含有所述的重組載體的轉基因細胞。

7、本發明還提供一種敲除app基因的細胞系的構建方法，包括利用crispr/cas9系統敲除細胞系中的app基因步驟，所述crispr/cas9系統的sgrna的核苷酸序列如seq?idno.1-2所示或者seq?id?no.3-4所示。

8、可選的是，所述細胞系包括豬成纖維細胞和豬肺泡巨噬細胞。

9、本發明還提供一種敲除app基因的細胞系，其由所述的構建方法制得。

10、本發明還提供所述的sgrna在構建app基因敲除的細胞系中的應用。

11、本發明還提供所述的細胞系在以下任一項中的應用：

12、（1）在制備app基因功能研究模型中的應用；

13、（2）在抗非洲豬瘟轉基因豬的制備中的應用；

14、（3）在抗非洲豬瘟育種中的應用。

15、本發明還提供一種抗非洲豬瘟轉基因豬的制備方法，包括以下步驟：

16、利用所述的構建方法構建的細胞系，篩選陽性細胞克隆，再以陽性細胞克隆為核移植供體細胞，卵母細胞為核移植受體細胞獲取克隆胚胎；將所述克隆胚胎移入豬子宮內妊娠，獲得基因敲除后的抗非洲豬瘟轉基因豬。

17、本發明公開了以下技術效果：

18、本發明通過crispr/cas9技術敲除非洲豬瘟受體app基因，構建app敲除的豬成纖維細胞系，并經過篩選陽性克隆，作為核移植供體細胞，卵母細胞為核移植受體細胞；將克隆胚胎移入豬子宮內妊娠，獲得基因敲除后的抗非洲豬瘟克隆豬。經試驗，對app基因敲除細胞系和基因敲除豬進行鑒定，發現豬體內app基因不表達，該豬感染非洲豬瘟后不死亡。說明app敲除后對非洲豬瘟病毒具有抗性，這為抗非洲豬瘟育種研究奠定基礎。

技術特征：

1.一種靶向敲除app基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq?idno.1-2所示或者seq?id?no.3-4所示。

2.用于編碼權利要求1所述的sgrna的dna分子。

3.含有權利要求1所述的sgrna的重組載體。

4.一種含有權利要求3所述的重組載體的轉基因細胞。

5.一種敲除app基因的細胞系的構建方法，其特征在于，包括利用crispr/cas9系統敲除細胞系中的app基因的步驟，所述crispr/cas9系統的sgrna的核苷酸序列如seq?idno.1-2所示或者seq?id?no.3-4所示。

6.如權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述細胞系包括豬成纖維細胞和豬肺泡巨噬細胞。

7.一種敲除app基因的細胞系，其特征在于，其由權利要求5或6所述的構建方法制得。

8.如權利要求1所述的sgrna在構建app基因敲除的細胞系中的應用。

9.如權利要求7所述的細胞系在以下任一項中的應用：

10.一種抗非洲豬瘟轉基因豬的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

技術總結
本發明公開了一種靶向敲除APP基因的sgRNA及其應用，屬于動物遺傳工程領域。本發明利用CRISPR/Cas9基因敲除技術，通過sgRNA序列鏈接至PX459載體中，將PX459?APP打靶載體轉入豬成纖維細胞中，通過抗性篩選和PCR測序鑒定后獲得陽性細胞克隆，再通過體細胞核移植技術獲得克隆胚胎；將克隆胚胎移入豬子宮內妊娠獲得克隆豬。本發明首次構建APP基因敲除豬，并使APP基因不表達而獲得ASFV抗性，為抗非洲豬瘟育種研究奠定基礎。

技術研發人員：巨向紅,楊鑫,雍艷紅,張文輝,李曉文
受保護的技術使用者：廣東海洋大學深圳研究院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24