本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，特別是涉及一種copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、慢性阻塞性肺疾病（copd）是一種異質(zhì)性強(qiáng)的慢性呼吸道疾病，疾病特征主要是出現(xiàn)慢性呼吸道癥狀(呼吸困難、咳嗽、排痰)，這是由于呼吸道重塑、炎癥和/或肺泡異常引起的進(jìn)行性不可逆氣流阻塞而導(dǎo)致的。由于目前copd診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是肺活量測(cè)定法，因此動(dòng)物模型仍是研究copd的主要載體。然而不同物種之間存在種屬差異，使用動(dòng)物模型得到的研究結(jié)果對(duì)研究人類(lèi)copd的幫助有限。

2、長(zhǎng)期以來(lái)，copd體外研究主要使用各種肺永生化細(xì)胞系，雖然這些細(xì)胞系保留了原始細(xì)胞類(lèi)型的許多表型特征，但由于結(jié)構(gòu)成分單一，其是否可以有效展示疾病特異性過(guò)程受到廣泛研究人員的質(zhì)疑。與細(xì)胞系相比，肺類(lèi)器官在體外重現(xiàn)肺的三維組織結(jié)構(gòu)如肺泡、氣道等及其功能，已被用于研究多種肺部疾病。研究表明，遠(yuǎn)端氣道是copd早期及主要病變的部位，然而目前已有的copd來(lái)源氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法還存在以下問(wèn)題：

3、（1）流程復(fù)雜，構(gòu)建周期長(zhǎng)，不利用普及；

4、（2）現(xiàn)有的copd來(lái)源氣道類(lèi)器官主要是近端大氣道的支氣管類(lèi)器官或沒(méi)有明確定位，不適用于體外研究copd在遠(yuǎn)端氣道的病變和疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法及應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)流程復(fù)雜、構(gòu)建周期長(zhǎng)、不適用于體外研究copd在遠(yuǎn)端氣道的病變和疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的問(wèn)題。

2、本發(fā)明的一方面提供一種copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，包括：

3、步驟s1，將copd來(lái)源遠(yuǎn)端肺組織浸泡于消化液中，37℃消化30-45min，使用溫和的樣本緩沖液終止消化，將組織切成碎塊，通過(guò)反復(fù)吹打獲得單細(xì)胞懸液，離心后獲得copd來(lái)源肺組織單細(xì)胞a；

4、步驟s2，將單細(xì)胞a用細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾收集copd來(lái)源肺組織單細(xì)胞b，離心后去除上清液，使用清洗液清洗1-2次后獲得copd來(lái)源肺組織單細(xì)胞c；

5、步驟s3，觀察單細(xì)胞c是否出現(xiàn)紅色團(tuán)塊，若未見(jiàn)紅色團(tuán)塊，則直接執(zhí)行步驟s4；若可見(jiàn)紅色團(tuán)塊，則加入1?ml紅細(xì)胞裂解液于室溫下裂解3分鐘，然后以300g的速度進(jìn)行分離，棄上清，得到copd來(lái)源肺組織單細(xì)胞d；

6、步驟s4，將單細(xì)胞c或單細(xì)胞d與基質(zhì)膠混勻后進(jìn)行種板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中倒扣靜置，待膠凝固后，加入類(lèi)器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔3-4天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到元代copd來(lái)源肺類(lèi)器官；

7、步驟s5，將元代copd來(lái)源肺類(lèi)器官酶解后，與基質(zhì)膠混勻后進(jìn)行種板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中倒扣靜置，待膠凝固后，加入類(lèi)器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)7-10天更換類(lèi)器官分化培養(yǎng)基，每間隔3-4天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)11-14天即得copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官。

8、上述copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其中，步驟s1中，消化液為含有10-50mm?edta的tryple消化液。

9、上述copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其中，步驟s1中，溫和的樣本緩沖液為：含有1-3%?bsa、且不含鈣鎂離子的pbs緩沖液。

10、上述copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其中，步驟s2中，清洗液的成分及含量為：兩性霉素b，1-3ug/ml；primocin，10-1000μg/ml；慶大霉素，100-500μg/ml。

11、上述copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其中，步驟s1、步驟s2中離心的條件均為：離心轉(zhuǎn)速300-500g，溫度4℃，離心時(shí)間5-10min。

12、上述copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其中，步驟s4、步驟s5中，類(lèi)器官擴(kuò)增培養(yǎng)基的成分及含量為：advanced?dmem/f12，1x；r-spondin?1，500ng/ml；fgf?7，25ng/ml；fgf?10，100ng/ml；noggin，100ng/ml；a83-01，500nm；y-27632，5μm；sb202190，500μm；b27補(bǔ)充液，1x；n-acetylcysteine，1.25mm；nicotinamide，5mm；glutamax?100x，1x；hepes，10mm；penicillin/streptomycin,?100μg/ml；primocin，50μg/ml。

13、上述copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其中，步驟s5中，所述類(lèi)器官分化培養(yǎng)基的成分及含量為：advanced?dmem/f12，1x；noggin，100ng/ml；a83-01，500nm；y-27632，5μm；sb202190，500μm；b27?補(bǔ)充液，1x；n-acetylcysteine，1.25mm；nicotinamide，5mm；glutamax?100x，1x；hepes，10mm；penicillin/streptomycin,?100μg/ml；primocin，50μg/ml；dapt，10μm。

14、本發(fā)明的另一方面提供了上述構(gòu)建方法得到的copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官在非治療目的的纖毛搏動(dòng)功能檢測(cè)中的應(yīng)用。

15、有益效果：

16、（1）本發(fā)明流程簡(jiǎn)單，在提取組織單細(xì)胞后只需要增殖和分化兩個(gè)步驟即可完成相關(guān)培養(yǎng)，使得該方法更容易普及。本發(fā)明縮短了培養(yǎng)天數(shù)，最短只需要18天即可完成相關(guān)類(lèi)器官的培養(yǎng)，大幅提高實(shí)驗(yàn)效率。同時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，通過(guò)本發(fā)明的方法培養(yǎng)出來(lái)的類(lèi)器官在轉(zhuǎn)錄水平上與原位組織（遠(yuǎn)端氣道）高度相似，在蛋白表達(dá)水平和功能水平上較好地還原了copd的病理特征，適用于體外研究copd在遠(yuǎn)端氣道的病變和疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

17、（2）本發(fā)明獲得的copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官可用于臨床copd患者藥物有效性和潛在靶點(diǎn)藥物的檢測(cè)和應(yīng)用，在臨床指導(dǎo)用藥方面，該類(lèi)器官藥篩結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道治療效果顯示出了一致的符合度，為copd病人的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了數(shù)據(jù)支持和可能性。

技術(shù)特征：

1.一種copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1中，消化液為含有10-50mm?edta的tryple消化液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1中，溫和的樣本緩沖液為：含有1-3%?bsa、且不含鈣鎂離子的pbs緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s2中，清洗液的成分及含量為：兩性霉素b，1-3ug/ml；primocin，10-1000μg/ml；慶大霉素，100-500μg/ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1、步驟s2中離心的條件均為：離心轉(zhuǎn)速300-500g，溫度4℃，離心時(shí)間5-10min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s4、步驟s5中，類(lèi)器官擴(kuò)增培養(yǎng)基的成分及含量為：advanced?dmem/f12，1x；r-spondin?1，500ng/ml；fgf?7，25ng/ml；fgf?10，100ng/ml；noggin，100ng/ml；a83-01，500nm；y-27632，5μm；sb202190，500μm；b27?補(bǔ)充液，1x；n-acetylcysteine，1.25mm；nicotinamide，5mm；glutamax?100x，1x；hepes，10mm；penicillin/streptomycin,?100μg/ml；primocin，50μg/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s5中，所述類(lèi)器官分化培養(yǎng)基的成分及含量為：advanced?dmem/f12，1x；noggin，100ng/ml；a83-01，500nm；y-27632，5μm；sb202190，500μm；b27?補(bǔ)充液，1x；n-acetylcysteine，1.25mm；nicotinamide，5mm；glutamax?100x，1x；hepes，10mm；penicillin/streptomycin,100μg/ml；primocin，50μg/ml；dapt，10μm。

8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法得到的copd來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官在非治療目的的纖毛搏動(dòng)功能檢測(cè)中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種COPD來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官的構(gòu)建方法及應(yīng)用，該方法流程簡(jiǎn)單，在提取組織單細(xì)胞后只需要增殖和分化兩個(gè)步驟即可完成相關(guān)培養(yǎng)，使得該方法更容易普及。本發(fā)明縮短了培養(yǎng)天數(shù)，最短只需要18天即可完成相關(guān)類(lèi)器官的培養(yǎng)，大幅提高實(shí)驗(yàn)效率。同時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，通過(guò)本發(fā)明的方法培養(yǎng)出來(lái)的類(lèi)器官在轉(zhuǎn)錄水平上與原位組織（遠(yuǎn)端氣道）高度相似，在蛋白表達(dá)水平和功能水平上較好地還原了COPD的病理特征，適用于體外研究COPD在遠(yuǎn)端氣道的病變和疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制。該構(gòu)建方法得到的COPD來(lái)源遠(yuǎn)端氣道類(lèi)器官可用于非治療目的的纖毛搏動(dòng)功能檢測(cè)。

技術(shù)研發(fā)人員：陳曄光,熊敬維,宋春暉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南昌大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24