油茶良種長林18號的分子特異性標記引物及鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及油茶良種長林18號的分子特異性標記引物及其鑒定方法。 (二）
【背景技術】
[0002]油茶是我國栽植面積最大、分布范圍較廣的木本油料樹種。大力發展油茶產業，對 保障糧油安全，促進農民增收，推進山區綜合開發和建設社會主義新農村，都具有十分重要 的意義。我國油茶產業方興未艾，發展潛力巨大。目前，我國油茶林總面積達4500多萬畝， 但產量很低，每畝產茶油僅4公斤左右。其根本原因是，絕大部分油茶林品種品質差或嚴重 退化，而大量的國家和省級審（認）定的優良品種又未推廣應用。同時，一些地方種苗質量 意識淡薄，經營管理粗放。為保障油茶產業又好又快發展，要充分認識油茶良種對發展油茶 產業的重要性，必須加快油茶優良種苗發展和強化質量管理。
[0003] 我國目前對油茶種苗質量的監督管理，主要依靠在管理層面制定的各項制度，而 在技術層面尚未取得關鍵性突破，特別是缺乏油茶良種的早期快速鑒別技術體系。目前通 過國家林木良種審定的12個長林品種系列分別為長林3號、長林4號、長林18號、長林21 號、長林23號、長林26號、長林27號、長林40號、長林53號、長林55號、長林56號、長林 166號。這些油茶良種具有早實豐產、穩產、出籽率高、含油量高、抗性強、適應性廣等特點。 對油茶種苗質量的監督管理要著力解決目前生產上油茶種苗的混亂局面，并首先從技術層 面上對長林油茶良種進行鑒別保護。
[0004] 目前對油茶品種的鑒別主要依據表觀特征，但由于許多形態性狀鑒定的周期 長、受環境影響大，并且品種數量不斷增多，使得品種鑒定愈來愈困難。自本世紀以來， 一些基于PCR的分子標記技術如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增 多態性DNA)、ISSR(Inter_Simple Sequence Repea，簡單序列重復區間擴增多態性）和 SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相關序列擴增多態性）相繼用于油茶 的種質資源遺傳多樣性、遺傳距離研宄，但對于分子標記與油茶性狀的連鎖、油茶品種間的 分子鑒別研宄很少，況且這些分子標記所采用的均為通用引物，其PCR擴增圖譜不僅復雜、 重復性差，而且特異性不高，因此并不適合用于品種鑒定，只有開發出某個品種穩定、特異 的DNA指紋標記才能真正用于該品種的準確快速鑒定。 (三）

【發明內容】

[0005] 本發明目的提供一對特異性高的油茶良種長林18號的分子特異性標記引物，以 及一種能對油茶良種長林18號進行快速鑒定的方法。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 油茶良種長林18號的分子特異性標記引物，所述引物序列如下：
[0008]上游引物：5，-AGCGGCCGCGTAATAAGTCTAAGC-3 '，
[0009]下游引物：5，-AGCGGCCGCGITGGATCA-3，。
[0010] 該引物對是采用PCR技術，經過大量篩選試驗獲得油茶良種長林18號的特異性 DNA片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎設計特異性引物，以該特異性 引物對油茶良種進行PCR擴增，僅長林18號可獲得549bp大小的特異性片段，其他油茶品 種均不能獲得特異性片段。需要說明的是，本發明分子特異性標記引物僅限于油茶良種的 鑒定（鑒定其是否為長林18號），即待測樣品僅限于油茶。
[0011] 本發明還涉及一種利用所述的分子特異性標記引物對油茶良種長林18號進行快 速鑒定的方法，所述方法為：提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子 特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現 549bp大小的DNA條帶，則待測油茶品種為油茶良種長林18號，反之則否；所述分子特異性 標記引物序列為：
[0012] 上游引物：5，-AGCGGCCGCGTAATAAGTCTAAGC-3'，
[0013] 下游引物：5，-AGCGGCCGCGITGGATCA-3，。
[0014] 本發明方法關鍵在于擴增引物的選擇、DNA提取、PCR反應體系及反應條件確定， 以及電泳檢測，均可按照本領域常規方法進行。
[0015] 優選的，本發明所述PCR反應體系組成如下：
[0016]
[0017] 余量為 ddlf。
【主權項】
1. 油茶良種長林18號的分子特異性標記引物，所述引物序列如下： 上游引物：5 ' -AGCGGCCGCGTAATAAGTCTAAGC-3'， 下游引物：5' -AGCGGCCGCGTTGGATCA-3'。
2. -種利用權利要求1所述的分子特異性標記引物對油茶良種長林18號進行快速鑒 定的方法，所述方法為：提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性 標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現549bp 的特異DNA條帶，則待測油茶品種為油茶良種長林18號，反之則否；所述分子特異性標記引 物序列為： 上游引物：5 ' -AGCGGCCGCGTAATAAGTCTAAGC-3'， 下游引物：5' -AGCGGCCGCGTTGGATCA-3'。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下：94°C預變性4min ; 94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸lmin，共30個循環；最后于72°C補平7min，終止溫 度為4°C。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： (1) 取待測油茶葉片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測油茶葉片的基因組DNA ; (2) 以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物， 進行PCR擴增： PCR反應體系每25 μ L組成如下：
CldH2O 補足至 25 μ L ; PCR反應條件如下： 94°〇預變性4!1^11;94°0變性4〇8,60°0退火4〇8,72°0延伸11^11，共30個循環 ；最后于 72°C補平7min，終止溫度為4°C ; (3) 取步驟（2)擴增產物5 μ L，與1 μ L 0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1. 5%的瓊 脂糖凝膠上，于IXTAB緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結束后EB染色，于自動凝膠圖像 分析儀上照相，若電泳結果出現549bp的特異DNA條帶，則待測油茶品種為長林18號，反之 則否。
【專利摘要】一對特異性高的油茶良種長林18號的分子特異性標記引物，以及一種能對油茶良種長林18號進行快速鑒定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCGTAATAAGTCTAAGC-3′，下游引物：5′-AGCGGCCGCGTTGGATCA-3′。本發明分子特異性標記引物可對油茶良種長林18號進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分子手段。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104673790
【申請號】CN201410849334
【發明人】李海波, 王麗玲, 徐梁, 魏海龍
【申請人】浙江省林業科學研究院
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2014年12月30日