在極端井況下水解瓜爾膠壓裂流體的纖維素酶的編碼基因的制作方法
【專利說明】在極端井況下水解瓜爾膠壓裂流體的纖維素酶的編碼基因
[0001] 相關申請
[0002] 本申請根據35U.S.C. § 119(e)規定要求2012年3月30日提交的美國臨時申請 61/618, 610和2012年6月15日提交的美國臨時申請61/660, 556的優先權，其全部內容均 被引入本文作為參考。 發明領域
[0003] 提供編碼纖維素酶的多核苷酸序列。具體地，提供的序列可提供特異性的、熱穩定 的、耐熱的、壓力穩定的纖維素酶，如用于在極端井況下水解瓜爾膠壓裂流體的纖維素酶的 表達增加。
[0004] 序列表
[0005] 本申請通過在MPEP § 502. 05中授權和提出的USPTO EFS-WEB服務器進行電子提 交，并且該電子提交包括電子提交的序列表；該序列表的全部內容被引入本申請的說明書 作為參考。序列表在電子提交的ASCII (.txt)文檔上被確定，如下：
[0006]
【主權項】
LSEQ ID NO: 1的核苷酸序列。
2. 權利要求1所述的核苷酸序列，其中所述序列編碼蛋白質。
3. 核苷酸序列，編碼衍生自海棲熱袍菌（Thermotoga maritima)的纖維素酶，其包括 選自下列的至少 1 個突變：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、 T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、 G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、 或其任意組合。 4. SEQ ID N0:3的核苷酸序列，包括選自下列的至少1個突變：T6C、T9C、T15G、A22C、 G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、 T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、 G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、或其任意組合。
5. 權利要求3或4所述的核苷酸序列，其中至少1個突變是沉默的。
6. 權利要求3或4所述的核苷酸序列，其中至少1個突變導致具有至少1個突變的所 述核苷酸序列指導所述纖維素酶以高于缺少至少1個突變并且不以其他方式區別于權利 要求3或4所述的核苷酸序列的核苷酸序列的水平表達。
7. 來自海棲熱袍菌的核苷酸序列，具有至少1個突變，所述至少1個突變使由所述核苷 酸序列編碼的蛋白質的表達水平與海棲熱袍菌基因組序列相比增加。
8. 權利要求7所述的核苷酸序列，其中所述突變是沉默的。
9. 第一核苷酸序列，編碼SEQ ID N0:2的多肽，其中所述核苷酸序列已相對于編碼SEQ ID N0:2的第二序列被突變，使得所述蛋白質的表達水平相對于由所述第二核苷酸序列編 碼的所述蛋白質增加。
10. 核苷酸序列，編碼與 SEQ ID NO: 2 具有至少 50%，60%，70%，80%，90%，95%， 97%，98%，99%或100%同一性的蛋白質，或其片段，其中所述核苷酸序列包括選自下列的 至少 1 個突變：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、 A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、 G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、或其任意組 合。
11. 權利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10所述的核苷酸序列，其編碼具有纖維素酶活性 的多肽，其中所述多肽在重組的細菌表達系統中生成。
12. 權利要求11所述的核苷酸序列，其中所述細菌表達系統是革蘭氏陰性細菌表達系 統。
13. 權利要求12所述的革蘭氏陰性細菌表達系統，其中所述革蘭氏陰性細菌是假單胞 菌（Pseudomonas)、大腸桿菌（E. coli)、青枯菌（Ralstonia)、或柄桿菌（Caulobacter)表達 系統。
14. 權利要求12所述的革蘭氏陰性細菌表達系統，其中所述假單胞菌表達系統是熒光 假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)表達系統。
15. 權利要求12所述的表達系統，其中所述纖維素酶生成至少I. 0g/L、2. 0g/L、3. Og/ L、4. 0g/L、5. 0g/L、6. 0g/L、7. 0g/L、8. 0g/L、9. 0g/L、10.0 g/L、ll. 0g/L、12. 0g/L、13. Og/ L、14.0g/L、15.0g/L、16.0g/L、17.0g/L、18. 0g/L、19. 0g/L、20. 0g/L、21. 0g/L、22. Og/L、 23.0g/L、24.0g/L、25. 0、g/L、26.0g/L、27. 0g/L、28. 0g/L、29. 0g/L、30. 0g/L、31. Og/L、 32. 0g/L、33. 0g/L、34. Og/L、或 35. Og/L。 16. SEQ ID N0:2的多肽，其中所述氨基酸序列不包含信號序列、前蛋白序列、啟動子序 列、或其任意組合。 17. SEQ ID N0:2的多肽，其中所述序列進一步包括異源序列。
18. 權利要求17所述的多肽，其中所述異源序列選自：信號序列、標簽、表位、啟動子序 列、N端延伸、C端延伸、和其任意組合。
19. 組合物，包含SEQ ID NO:2的多肽，并且進一步包括第二酶。
20. 權利要求所述19的組合物，其中所述第二酶選自：乳糖酶、脂酶、蛋白酶、過氧化氫 酶、木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、酰胺酶、環氧化物水解酶、酯酶、磷 脂酶、轉氨酶、胺氧化酶、纖維二糖水解酶、氨裂解酶、或其任意組合。
21. 分離的、重組的或合成的核苷酸，具有包含SEQ ID NO: 1的核酸序列，其中所述核酸 序列編碼具有纖維素酶活性的多肽。
22. 分離的、重組的或合成的核苷酸，包含SEQ ID NO: 1的核酸序列，其中所述核酸序列 編碼具有纖維素酶活性的多肽，并且所述多肽包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列、或其酶活性 片段。
23. 分離的、重組的或合成的核酸序列，包含SEQ ID N0:1，其編碼具有纖維素酶活性的 多肽，其中所述多肽包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列，并且所述多肽在重組熒光假單胞菌表 達系統中生成。
24. 組合物，包括聚合物增粘劑、表面活性劑、熱穩定劑和酶分解劑，所述酶分解劑包括 衍生自超嗜熱細菌的野生型纖維素酶或其突變變體。
25. 權利要求24所述的組合物，其中所述增粘劑是瓜爾膠，包括線性瓜爾膠、交聯瓜爾 膠、或其混合物。
26. 權利要求25所述的組合物，其中所述酶分解劑特異性地水解所述瓜爾膠中的 0-1，4糖苷鍵。
27. 權利要求25所述的組合物，其中所述酶分解劑不特異性地水解所述瓜爾膠中的 a-1，6糖苷鍵。
28. 權利要求24-27中任一項所述的組合物，其中所述酶分解劑在上至約275 °F溫度下 保持其水解所述瓜爾膠中的0 -1，4糖苷鍵的能力。
29. 權利要求24-28中任一項所述的組合物，其中所述酶分解劑在上至約11的pH下保 持其水解所述瓜爾膠中的0-1，4糖苷鍵的能力。
30. 權利要求24-29中任一項所述的組合物，其中所述酶分解劑是包括相對于所述野 生型纖維素酶的12個突變的突變變體。
31. 權利要求30所述的組合物，其中所述12個突變選自F38Y、Y61Q、M69E、D70P、R71S、 I94Q、I166V、S183R、S191A、E212P、L231V、M276A、E277S、R280G、T297P 和 T301Q。
32. 權利要求24所述的組合物，其中所述酶分解劑具有SEQ ID. NO. 2。
33. 權利要求24所述的組合物，其中所述酶分解劑由具有SEQ ID. NO. 1的多核苷酸編 碼。
34. 權利要求24-29中任一項所述的組合物，其中所述酶分解劑是所述野生型纖維素 酶的突變變體，并且具有如下熔融溫度：在約pH 6. 5下高于所述野生型纖維素酶的熔融溫 度至少20°F，和在約pH 10. 5下高于所述野生型纖維素酶的熔融溫度至少KTF。
35. 權利要求24所述的組合物，其中所述酶分解劑是由SEQ ID NO:3編碼的纖維素酶 的突變變體。
36. 降低包含0-1，4糖苷鍵的多糖凝膠的粘度的方法，所述方法包括使所述多糖凝膠 在允許條件下接觸纖維素酶變體，并且接觸時間足以使所述纖維素酶水解所述多糖凝膠中 的0 -1，4糖苷鍵，從而降低所述瓜爾膠的粘度，其中所述纖維素酶變體與衍生自超嗜熱細 菌的野生型纖維素酶相比包含至少12個突變，并且其中所述纖維素酶變體呈現與所述野 生型纖維素酶相比增加的溫度和pH耐受性。
37. 權利要求36所述的方法，其中至少12個突變通過基因位點飽和誘變生成，所述基 因位點飽和誘變包括還原性重配、重組和選擇的重復循環。
38. 權利要求36所述的方法，其中所述多糖凝膠包括線性瓜爾膠、交聯瓜爾膠、或其混 合物。
39. 權利要求36所述的方法，其中所述纖維素酶變體具有SEQ ID NO: 2。
40. 權利要求36所述的方法，其中所述纖維素酶變體由具有SEQ ID. NO. 1的多核苷酸 編碼。
41. 權利要求36所述的方法，其中允許條件包括約180°F至約275 °F的溫度范圍。
42. 權利要求36所述的方法，其中允許條件包括約9至約11的pH范圍。
43. 處理地下地層的方法，包括： 向所述地下地層引入壓裂流體，所述壓裂流體包括多糖凝膠和纖維素酶變體；和使所 述凝膠和所述纖維素酶變體在允許條件下反應，并且反應時間足以使所述纖維素酶變體水 解所述凝膠中的至少一些0-1，4糖苷鍵，而不水解a-1，6糖苷鍵，從而生成粘度降低的壓 裂流體；其中所述纖維素酶變體與衍生自超嗜熱細菌的親本野生型纖維素酶相比包括至少 12個突變，并且其中所述纖維素酶變體呈現與所述野生型纖維素酶相比增加的溫度和pH 耐受性。
44. 權利要求36所述的方法，其中通過所述纖維素酶變體生成的所述粘度降低的壓裂 流體，相對于通過化學分解劑生成的相當的粘度降低壓裂流體，包括較少殘留物，其中纖維 素酶變體和化學分解劑的劑量提供基本上相同的粘度降低。
【專利摘要】提供編碼熱穩定的纖維素酶并導致其表達增加的多核苷酸序列，和包括這種熱穩定的纖維素酶的水力壓裂組合物。公開的組合物包括聚合物增粘劑、表面活性劑、熱穩定劑和酶分解劑，所述酶分解劑包括衍生自超嗜熱細菌的野生型纖維素酶或其突變變體。在一些實施方式中，增粘劑是瓜爾膠，包括線性瓜爾膠、交聯瓜爾膠或其混合物。在一些實施方式中，酶分解劑特異性地水解所述瓜爾膠中的β-1,4糖苷鍵。在一些實施方式中，酶分解劑不特異性地水解所述瓜爾膠中的α-1,6糖苷鍵。在一些實施方式中，酶分解劑在上至約275℉溫度下保持其水解所述瓜爾膠中的β-1,4糖苷鍵的能力。
【IPC分類】C12N9-42
【公開號】CN104736701
【申請號】CN201380028620
【發明人】X·譚, K·E·巴雷特, A·H·達文波特, L·E·惠普爾, H·D·厄比納, B·張, M·A·沃爾
【申請人】巴斯夫酶有限責任公司(美國)
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2013年3月12日
【公告號】CA2869024A1, EP2831257A2, US20150087029, WO2013148167A2, WO2013148167A3