利用人工合成mv4序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種培育甘蔗抗病品種的方法，具體涉及一種利用人工合成MV4序列 培育抗花葉病甘蔗品種的方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 甘蔗花葉病又名甘蔗嵌紋病，是世界上各產蔗國普遍發生的一類病毒病，此病在 許多國家被列為重要病害，甘蔗感病后一般減產10%~40%，同時如出汁率、還原糖、蔗 糖分等一些工藝性狀也受到不同程度的影響。目前，已明確引起甘蔗花葉病的病原至少 有3種：甘鹿花葉病毒（Sugarcane Mosaic Virus，ScMV)、高梁花葉病毒（Sorghum Mosaic Virus，SrMV)和甘蔗線條花葉病毒。其中甘蔗花葉病毒和高粱花葉病毒在我國蔗區普遍分 布，這兩種病毒屬馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus)成員，為單鏈正義RNA病毒，基因組結構簡 單，編碼10個成熟蛋白，分別為？1、11(：11'〇、？3、61(1、(：1、61(2、￥? 8、肌&、附13和0?。目前，世 界蔗區至少存在有7個ScMV和SrMV病毒株系，包括屬于ScMV的株系ScMV-A，B，D，E和屬 于SrMV的株系SrMV-H，I，M。研宄者先后將單一的CP及HC全序列基因導入到甘蔗中，并獲 得了對甘蔗花葉病的抗性明顯提高的轉基因甘蔗。但研宄表明，蔗區中花葉病毒的優勢株 系在自然條件下也會發生變化，并產生新的株系。因此，僅以單一株系的花葉病毒的單一基 因為靶標的轉基因改良顯然無法應對蔗區病原株系多樣化、復雜化以及優勢株系的變化。
[0003] RNA干擾（RNA interference，RNAi)是一種轉錄后基因表達沉默機制，構建可轉 錄為雙鏈RNA(dsRNA)的植物表達載體并轉化植物，可實現植物目標基因的可遺傳的基因 沉默，而且，引發RNAi的片段并不需要完整的基因序列，還可以是多個病毒的不同基因片 段的嵌合體，為此，我們將收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸 序列分別進行多序列比對，從中各選取1條100%同源的序列區段，采用人工合成的方式串 聯在一起，作為RNAi (RNA interference)片段，構建反向重復序列，得到一個RNAi載體。通 過基因槍轟擊法遺傳轉化甘蔗，獲得具有沉默病毒基因表達效果的轉基因甘蔗。
[0004] 專利號為ZL20071009226. 8的發明專利"利用SrMV-Pl基因培育抗花葉病甘蔗品 種的方法"，介紹了一種利用SrMV-Pi基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花葉病甘蔗轉Pi基因植物表達載體的構建、抗甘蔗花葉病轉P :基因材料的培育 以及抗病高產高糖轉基因甘蔗新材料的篩選鑒定。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種利用人工合成序列MV4培育抗花葉病甘蔗品種的方法。 針對現有蔗區甘蔗花葉病嚴重的問題，人工合成可同時沉默甘蔗花葉病毒和高粱花葉病毒 的新型核酸序列，構建RNAi載體，通過基因槍轟擊法進行遺傳轉化，獲得對花葉病高抗的 轉基因甘蔗。
[0006] 本發明的目的是通過以下方法實現的。
[0007] 本發明的利用人工合成MV4序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MV4序列的 人工合成、RNAi載體構建、抗花葉病轉基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定；其特征在于： [0008] (1)MV4序列的人工合成：
[0009] 從ScMV和SrMV核酸序列中各選取一段串聯在一起，獲得MV4序列，同時在正義鏈 5'端加入Xba I和Xho I酶切位點，反義鏈5'端加入Cla I和Kpn I酶切位點，采用人工 合成的方式，獲得目的片段A，其序列如下：
[0010] GATCTAGACT CGAGATGAGC GGACTAATGG TATGGTGCAT AGAAAATGGT TGCTCACCGA
[0011] ACATCAATGG TGTTTGGACC ATGATGGATG GAGAAGAACA AAGAACATTT CCTTTAAAGC
[0012] CAATAATTGA AAATGCTTCT CCAACATTTA GGCAGATTAT GCATCACTTT AGTGATGCAG
[0013] CTGAAGCGTA TATAGAATAC CGTAACTCAA CGGAACGCTA CATGCCAAGA TACGGACTTC
[0014] AGCGAAACTT GACCGACTGA GCGATACATG CCAAGATACG GTCTTCAGCG AAATCTCACC
[0015] GACTATAGCT TAGCGCGGTA TGCTTTCGAT TTCTATGAAA TGACTTCGCG CACACCAGCT
[0016] AGAGCTAAGG AAGCCCACAT GCAGATGAAA GCCGCAGCAG TTCGTGGTTC AAACACACGT
[0017] CTGTTCGGTC TGGACGGAAA TGTCGGCGAG ACTCAGGAGA ATACAGAGAG ACACACAGCT
[0018] GGCGACGTTA GTCGCAACAT GCACTCTCTG TTGGGAGTGC AGCAGCACCA CTAGGGTACC
[0019] ATCGATAG
[0020] 所述從ScMV和SrMV核酸序列中各選取一段串聯在一起，指將收集到的ScMV各病 毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進行多序列比對，從中各選取1條 100%同源的序列區段串聯在一起，共520bp，為目標RNAi干擾序列。
[0021] (2) RNAi 載體構建：
[0022] (a)目的片段I的獲得：利用限制性內切酶Xho I和Kpn I將目的片段A進行酶 切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段I;目的片段I的序列為序列 表中SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；
[0023] (b)目的片段II的獲得：將pHANNIBAL載體質粒DNA用限制性內切酶Xho I和Kpn I進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段II，目的片段II的序 列為序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列；
[0024] (c)中間載體B的獲得：將回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA連接酶進行 連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽性克隆驗證，獲得中間載體B ;所述中 間載體B是指將目的片段I插入到pHANNIBAL載體后獲得的載體；
[0025] ⑷目的片段III的獲得：提取中間載體B的質粒DNA，并用限制性內切酶ClaI和 XbaI進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段III;目的片段III 的序列為序列表中SEQIDN0:4所示的核苷酸序列；
[0026] (e)目的片段IV的獲得：將目的片段A用限制性內切酶ClaI和XbaI進行酶切， 將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段IV;目的片段IV的序列為序列表 中SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；
[0027] (f)中間載體C的獲得：將回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA連接酶進行 連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆驗證，獲得中間載體C;所述中 間載體C是指將目的片段IV插入到中間載體B后獲得的載體；
[0028](g)目的片段V的獲得：提取中間載體C的質粒DNA，并用限制性內切酶NotI進 行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段V;目的片段V的序列為 序列表中SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
[0029] (h)目的片段VI的獲得：將植物表達載體pGreenII0229質粒DNA用限制性內切酶 Not I進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段VI ;目的片段VI 的序列為序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；
[0030] ⑴抗甘蔗花葉RNAi載體pG0229i-MV4的獲得：將回收的目的片段V和目的片段 VI用T4-DNA連接酶進行連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽性克隆驗證， 獲得可用于遺傳轉化甘蔗受體材料的RNAi載體pG0229i-MV4 ;
[0031] (3)抗花葉病轉基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定：提取構建完成的RNAi載體 pG0229i-MV4質粒DNA，用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，并將其定量至1 y g/ y 1，基 因槍轟擊法遺傳轉化甘蔗，分子檢測獲得陽性轉基因植株，并進行抗病轉基因甘蔗的抗病 性鑒定。
[0032]所述pHANNIBAL載體、pGreenII0229載體、大腸桿菌DH5a，均由商業購買獲得。
[0033] 利用本發明的人工合成MV4序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，在人工接種條件 下，分別接種了屬于ScMV株系的ScMV-A，E和屬于SrMV株系的SrMV-H，M共4個株系，對照 發病率分別達到了 83. 7%、89. 1 %、85. 2%和87. 3%，而轉基因甘蔗均無發病，說明轉入人 工合成的MV4基因后提高了甘蔗抗多種花葉病毒的能力。采用本發明的方法篩選獲得的轉 基因植株，都具有抗性廣譜、抗病性好、抗性持久及生物安全性高的特點。
[0034] 本發明的優點和有益效果：
[0035] 1.本發明獲得的植物表達載體采用了 RNAi技術，使得甘蔗抗病毒育種擺脫了對 抗源基因的依賴。
[0036] 2.本發明人工合成的核酸序列包含了與ScMV各病毒株系核酸序列100%同源和 與SrMV各病毒株系核酸序列100 %同源的序列區段，作為RNAi序列，獲得的轉基因植株，具 有抗性廣譜、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特點。
[0037] 3.本發明獲得的RNAi載體用于轉基因甘蔗，可以有效地縮短甘蔗抗花葉病育種 周期。
【附圖說明】 [0038] 圖1為構建完成的pG0229i-MV4質粒圖譜。
【具體實施方式】 [0039] 為了進一步闡明本發明而不是限制本發明，以下結合實施例加以說 明。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。所述試劑和生物材料如無 特殊說明均可從商業途徑獲得。
[0040] 實施例一：構建抗甘蔗花葉病的RNAi載體
[0041] 構建抗甘蔗花葉病的RNAi載體的方法，包括以下步驟：
[0042] 1、MV4序列的人工合成：
[0043] 將收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分