收集和使用胎盤臍血干細胞的方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2007年05月11日和發(fā)明名稱為"收集和使用胎盤臍血干細胞 的方法"的200780024901. 2號發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 本申請要求2006年5月11日提交的60/799734號美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)。前述 臨時申請的公開內(nèi)容通過引用全部引入本申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明的主題涉及收集胎盤臍血干細胞的高效方法和使用收集的干細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 1.本發(fā)明的領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明的主題涉及從胎盤收集干細胞，其中詳細設(shè)計了一種臨床上可行的、方便 和高效的新方法。特別是，本發(fā)明描述了一個新的發(fā)現(xiàn)，即通過機械搏動灌注收集的殘留胎 盤臍血細胞與由常規(guī)的針/注射器吸取或重力引流收集方式獲得的胎盤臍血細胞相比更 富含原始造血干細胞表型，因而使得臍血細胞能夠用于再生的醫(yī)學(xué)目的。使用所描述的方 法從單個胎盤獲得的干細胞數(shù)的增加也可以改善異源造血干細胞移植的結(jié)果和避免為了 補償來自單個供體移植物的干細胞的量不足而使用來自不同供體的兩元或三元的臍帶血 移植物。
[0006] 2?【背景技術(shù)】的描述
[0007] 臍血收集方法和成人的臍血移植
[0008] 臍帶CB細胞對于針對造血系統(tǒng)惡性腫瘤和骨髓衰竭綜合征進行異源HSC移 植是很有前途的HSC的來源（Kurtzberg等，1996;Wagner等，1996;Gluckman等，1997 ; Rubinstein等，1998)。其顯著的優(yōu)勢包括快速地獲取在全國范圍的CB銀行中儲存的CB細 胞，及由于與匹配的無關(guān)供體（unrelateddonor)移植物相比很少發(fā)生嚴重的移植物抗宿 主?。℅VHD) (Barker等，2002)，可以接受1-2個人類白血病抗原失配的移植物。CB細胞使 得病人能夠在沒有另外合適的匹配供體的情況下（特別是在少數(shù)族群的病人中）選擇異源 移植作為造血系統(tǒng)惡性腫瘤的治療方法。盡管具有以上的優(yōu)勢，CB在成人中的應(yīng)用由于細 胞（包括CD34+細胞和祖細胞）數(shù)目的不足而受到限制。采用低水平總有核細胞計數(shù)的CB 移植導(dǎo)致嗜中性細胞和血小板的移植后植入（engraftment)顯著延遲或植入失?。╓agner 等，2002 ;Laughlin等，2004)。已知的采集CB的過程包括通過重力從分娩的胎盤排出血液 和通過靜脈穿刺將血液排到收集袋或注射器中。
[0009] 由于CB供應(yīng)甚至幾乎不足以進行單次的使用或者新近使用來自兩個不同供體的 二元CB供應(yīng)，因此成人CB移植一般僅在沒有合適的無關(guān)供體的時候在臨床研究的基礎(chǔ)上 進行。實際上，僅20-40ml的回收量并不少見，而因此這些CB細胞甚至沒有被使用或儲存 (Lasky等，2002;George等，2006)。在這種情況下，由于沒有可以在最初采集后對CB細胞 進行補充收集的標(biāo)準(zhǔn)化補充方法，大量的未收集的CB細胞仍保留在胎盤中并被丟棄了。為 了擴大將來的CB銀行供體庫，研究改進的CB采集方法（包括如何在常規(guī)的CB采集后收集 遺留的剩余CB細胞）是重要的（Harris等，1994)。更重要的是，從同一胎盤獲得更大量的CB細胞可以儲存足以用于多項用途的CB細胞量，包括備份或移植物工程（如，體外擴增和 過繼性免疫治療）。
[0010] 當(dāng)前關(guān)于HSC可塑性和組織再生的認識
[0011] 在過去的十年內(nèi)，在人體內(nèi)鑒定出了許多類型的具有復(fù)制、自我更新和分化能力 的干細胞。全能干細胞能夠形成每一種類型的體細胞，且這些細胞處在早期胚胎中，是所謂 的人ES細胞。多能干細胞能夠發(fā)育成內(nèi)胚層、中胚層或外胚層。組織特異性干細胞僅用于 產(chǎn)生特定的組織。例如，造血干細胞（HSC)負責(zé)產(chǎn)生所有類型的血細胞，但不負責(zé)產(chǎn)生其它 的組織類型，且它們在成人體內(nèi)的持續(xù)存在提供了修復(fù)能力。但是，研究者發(fā)現(xiàn)，象被認為 負責(zé)產(chǎn)生不同類型的造血祖細胞的成體HSC那樣的細胞甚至也產(chǎn)生不同組織或器官的細 胞，如神經(jīng)細胞或肌肉細胞。
[0012] 關(guān)于成體HSC的轉(zhuǎn)分化的探索研究仍然存在爭議，且還在進行著活躍的研究工 作。相反，許多臨床病例報告了在BM移植或心臟移植后非造血細胞發(fā)生的證據(jù)。尋找BM 移植后BM向腦轉(zhuǎn)分化的追溯研究顯示了神經(jīng)生成（neuropoiesis)的證據(jù)，在長期情況中 檢測到星形細胞和小膠質(zhì)細胞而沒有細胞融合（Cogle等，2004)。其它的報道提到了在BM 移植之后在成骨細胞、肝細胞、胃腸（GI)道上皮細胞、間質(zhì)中，在外周血干細胞移植之后在 角質(zhì)形成細胞/肝細胞/GI道/皮膚上皮細胞中，和在心臟移植之后在帶或不帶內(nèi)皮細胞 的心肌細胞中，檢測到大百分范圍的供體細胞（Hruban等，1993 !Theise等，2000!Korbling 等，2002;Muller等，2002 ;0kamoto等，2002;Quaini等，2002)。
[0013] 作為成體干細胞來源的臍血細胞
[0014] 雖然人ES細胞可以在體外分化和擴增以產(chǎn)生不同類型的祖細胞，但其在病人中 的應(yīng)用最近受到了多種倫理問題的阻礙。另外，必須要解決胚胎干細胞源的祖細胞的純度 問題。與此相反，源自造血組織（包括骨髓和臍帶CB細胞）的成體干細胞群被發(fā)現(xiàn)能夠在 受到適當(dāng)?shù)拇碳r分化成外胚層或內(nèi)胚層（Eglitis和Mezey，1997 !Brazelton等，2000 ; Mezey等，2000 ;Sanchez_Ramos等，2001 ;Chen等，2005)。特別是，由于CB源的干細胞是從 通常被丟棄的胎盤中收集，因而不需要在采集細胞時對主體造成組織損傷，因此它們與其 它來源相比具有更進一步的優(yōu)勢。與BM細胞相比，CB為帶有幼稚免疫狀態(tài)和相對未縮短 的端粒長度的原始個體發(fā)生。
[0015] 在關(guān)于是否存在真正多能的體干細胞（somaticstemcell)的爭論中，源自CB和 胎盤的細胞由于包含用于潛在臨床應(yīng)用的令人感興趣的性質(zhì)而日益受到關(guān)注。最近，CB已 被證明包含異質(zhì)細胞群并被認為是多能干細胞源（Goodwin等，2001 ;Sanchez-Ramos等， 2001;Bicknese等，2002 ;Sanchez-Ramos，2002 ;Zigova等，2002)。其他人報道，在譜系陽性 細胞耗竭（lineagepositivecelldepletion)后從一周時間的CB細胞懸浮培養(yǎng)中分離 的粘附細胞群被證明表現(xiàn)外胚層和內(nèi)胚層特征的免疫組織化學(xué)證據(jù)（McGuckin等，2004)。 現(xiàn)有一系列的對患有神經(jīng)退行性疾病克拉勃腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的兒童成功地進行CB移植的 報道（Escolar等，2005)。
[0016] 本發(fā)明人推測，在CB干細胞中發(fā)現(xiàn)的這些獨特的特征可能是由于最近公開的一 種新興的概念，即，妊娠胎盤可能是胚胎發(fā)育過程中的造血生境（niche) (Gekas等，2005 ; Ottersbach和Dzierzak，2005)?？梢院唵蔚丶僭O(shè)，足月的胎盤也可能包含粘附到血管生境 的殘余原始干細胞，或者可能由于與"出生（birth) "相關(guān)的應(yīng)激，從胎兒BM或肝臟釋放的、 已經(jīng)迀移到胎盤生境中的循環(huán)干細胞的數(shù)目可能增加。因此，本發(fā)明人推測，通過本發(fā)明獲 得的源自胎盤的CB細胞可能包含更多的自胚胎發(fā)生以來作為殘余干細胞沉積在胎盤血管 床生境中的原始干細胞（ES細胞樣細胞）。
[0017] 包括ES細胞樣細胞和原始HSC的原始CB細胞的分離和選擇
[0018] 為使用胚胎、造血和神經(jīng)干細胞的基因表達譜的比較分析鑒別共同的干細胞標(biāo)志 物，僅一個基因得到確認（可能是由于技術(shù)困難MFortunel等，2003)。因此，識別和選擇 干細胞可能仍需要幾個標(biāo)志物以將這些細胞分離開來?？梢杂糜趨^(qū)別干細胞的特性之一 是不存在分化標(biāo)志物。這一方法已廣泛地用于HSC領(lǐng)域以進行干細胞的富集，從而用于治 療。這一"譜系陰性（Lin-)"特性是許多干細胞群的共同性質(zhì)（Cai等，2004b)。為進一步 從Lin-CB細胞富集干細胞群，已經(jīng)有報道，⑶133+標(biāo)志物在生長因子刺激下顯示出高增殖 潛力（Forraz等，2004)。其他人報道，⑶133+/⑶34-細胞亞群可能代表更原始的干細胞， 因為它們不在甲基纖維素中產(chǎn)生集落形成細胞（CFC)，而表現(xiàn)出最高的SCID再植細胞頻率 (Kuci等，2003)。如階段特異性胚胎抗原（SSEA)-3、SSEA-4、TRA-l-60和TRA-1-81的胚胎 干細胞標(biāo)志物僅在ES細胞上表達，ES細胞已廣泛用于與FACS分析（其可從市場得到）相 容的多能干細胞和抗體的鑒定。新近Kucia等人描述了攜帶Lin-/⑶45-/CXCR4+/⑶133+/ ⑶34+表型的稱為"極小胚胎樣（VSEL)干細胞"的原始干細胞群（Kucia等，2006)。這些細 胞對于胚胎轉(zhuǎn)錄因子〇ct-4和Nanog也是陽性的。
[0019] 可選擇地，利用一般代謝標(biāo)志物的存在的方法也已用于識別和分離干細胞。已 被描述的代謝標(biāo)志物中的一種是醛脫氫酶（ALDH) (Takebe等，2001)。ALDH的熒光底 物-Aldefluor(StemCell)-已被用于在神經(jīng)干細胞（Cai等，2004b;Corti等，2006)和 HSC(Storms等，1999)中證明ALDH活性的增加。這種非毒性的、活體標(biāo)記方法也可以用于 識別其它干細胞群（Cai等，2004a)。此外，若丹明攝取和Hoechst染料標(biāo)記已被用于從BM、 CB、間充質(zhì)、肌肉和成人腦選擇干細胞群（Kim等，2002 ;Bhattacharya等，2003;Migishima 等，2003 ;Parmar等，2003)。由Hoechst染料33342的低攝取證明的側(cè)群（SP)代表了最 高的自我更新能力和多能性。Hoechst染料的攝取通過膜轉(zhuǎn)運體ABCG2調(diào)節(jié)，因而SP群由 ABCG2蛋白的表達限定（Zhou等，2001;Scharenberg等，2002)。ABCG2蛋白也在神經(jīng)干細 胞中特異性地表達，且在前體細胞分化時表達下降（Cai等，2002)。
[0020] 人類造血細胞譜系的外胚層細胞轉(zhuǎn)分化的證據(jù)
[0021] 自從BM間質(zhì)源的祖細胞被首次報道在小鼠中分化成肌肉、神經(jīng)膠質(zhì)和肝細胞以 來，現(xiàn)在有越來越多的關(guān)于這些細胞分化成神經(jīng)細胞的報道（Azizi等，1998 !Ferrari等， 1998 ,Petersen等，1999)。已經(jīng)報道了在用視黃酸、表皮生長因子（EGF)或腦源神經(jīng)營養(yǎng) 因子（BDNF)刺激后，在源自人和嚙齒動物BM間質(zhì)細胞的細胞中誘導(dǎo)神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì) 的體外證據(jù)，如巢蛋白（nestin)、神經(jīng)元特異性核蛋白（NeuN)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP) (Sanchez-Ramos等，2000)。在非間充質(zhì)造血祖細胞中，已有幾個報告顯示，包括分離的 CD133+細胞的人CB單核細胞在暴露于堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)和hEGF后被誘導(dǎo) 體外表達神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)志物，如(6-微管蛋白III、GFAP，且在暴露于視黃酸和神經(jīng) 生長因子（NGF)后還表達Musashi-1 (Sanchez-Ramos等，2001;Bicknese等，2002) 〇
[0022] 造血細胞譜系的內(nèi)胚層細胞轉(zhuǎn)分化的證據(jù)
[0023] 原先，在小鼠模型中肝細胞被認為是由注入的BM細胞轉(zhuǎn)化的（Lagasse等，2000)， 但后來在特定的肝臟再生模型中發(fā)現(xiàn)它是由細胞融合引起的（Wang等，2003b)。其他人也 發(fā)現(xiàn)，BMHSC來源的骨髓單核細胞是肝細胞融合伴體的主要來源（Camargo等，2004)。通 過在譜系陽性細胞耗竭過程后進行一周懸浮培養(yǎng)分離的CB細胞形成了粘附細胞群，其被 發(fā)現(xiàn)在用肝細胞生長培養(yǎng)基進一步孵育后表達肝細胞的標(biāo)志物（McGuckin等，2005)。已經(jīng) 報道了在CB⑶34+⑶38-⑶7-移植后用0：14處理的免疫缺陷小鼠肝臟中肝細胞樣細胞發(fā) 育的體內(nèi)證據(jù)（Wang等，2003a)，且新近在使用胎綿羊的非損傷模型中，通過利用人HSC的 胎綿羊BM重建產(chǎn)生了人肝細胞，人HSC包括源自BM、外周血或CB的任一種的⑶34+/Lin-、 CD34-/Lin-、CD34+/Lin-/CD38-、CD34-/Lin-/CD38-、CD34+/Lin-/CD133+、CD34+/Lin-/ CD133-(Almeida_Porada等，2004)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024] 本發(fā)明的主題涉及從胎盤收集臍血（CB)源的干細胞的新方法。在本發(fā)明的一種 實施方式中，可以通過搏動機械胎盤灌注（PMPP)方法進行胎盤灌注。PMPP可以與常規(guī)的收 集方法組合，通常是靜脈穿刺（用針和注射器抽吸臍帶脈管系統(tǒng)）或重力引流，或者不進行 預(yù)先的收集。PMPP可以用含抗凝血劑的器官灌注溶液進行以將臍血細胞沖出，然后收集所 獲得的含干細胞的灌注液。這一方法不需要在分娩后進行任何制備或?qū)⒖鼓獎┳⑷胩ケP 中來防止凝結(jié)。離體的胎盤可以在灌注之前通過例如置于冰上進行冷卻。如果灌注是在胎 盤離體的一個小時之內(nèi)進行，胎盤不需要在灌注之前進行冷卻。如果胎盤在進行灌注之前 經(jīng)過制備或注射了抗凝血劑，當(dāng)前描述的方法仍可以進行。如果臍血細胞首先使用常規(guī)方 法收集，通過PMPP獲得的剩余臍血細胞可以添加到該初始收集物中。PMPP獲得的臍血細胞 也可以作為備份細胞儲存或儲存用于將來的細胞移植工程和再生性醫(yī)學(xué)目的。不需要立即 將臍血干細胞從胎盤中去除產(chǎn)生的便利性和不需要進行任何進一步的制備而將其直接置 于冰上運送到中心實驗室的能力使得這一方法對于在當(dāng)前建立的臍血細胞銀行系統(tǒng)中應(yīng) 用具有潛在的吸引力。
[0025] -種實施方式包括從離體的非放血或部分放血的哺乳動物胎盤收集臍血干細胞 的方法。其它的實施方式可以包括用灌注溶液（例如，至少第一體積的灌注溶液）對哺乳動 物的胎盤進行胎盤灌注以產(chǎn)生包含臍血干細胞的灌注液；收集包含臍血干細胞的灌注液； 和從灌注液分離臍血干細胞以產(chǎn)生分離的臍血干細胞。灌注可以包括用一個或多個體積的 灌注溶液（例如，1-3個體積的灌注溶液）進行灌注。
[0026] 在某些實施方式中，灌注包括用壓力介導(dǎo)的灌注溶液的液流灌注非放血或部分放 血的哺乳動物胎盤。在特定的實施方式中，壓力介導(dǎo)的灌注溶液的液流包括灌注溶液的脈 動流。在某些實施方式中，壓力介導(dǎo)的灌注溶液的液流包括一個或多個正壓介導(dǎo)的灌注溶 液的液流或負壓介導(dǎo)的灌注溶液的液流。
[0027] 在某些實施方式中，該方法包括例如通過搏動灌注用壓力介導(dǎo)的灌注液的液流灌 注非放血或部分放血的哺乳動物胎盤，其中灌注是在足以產(chǎn)生基本上無臍血干細胞的哺乳 動物胎盤的條件下進行的。在進一步的實施方式中，胎盤灌注是使用蠕動栗進行的。
[0028] -般，該方法包括分離存在于離體胎盤的臍血中的干細胞。分離的干細胞可以包 括胚胎干細胞（ES)樣干細胞、造血干細胞、間充質(zhì)干細胞或其組合。其它可以通過該方法 獲得的臍血細胞包括T-細胞、單核細胞、樹突細胞和B細胞。
[0029] 在其它的實施方式中，該方法可以進一步包括：在灌注前，從哺乳動物供體分離哺 乳動物胎盤以獲得離體的哺乳動物胎盤；和冷卻離體的哺乳動物胎盤以獲得冷卻的哺乳動 物胎盤。
[0030] 在幾種實施方式中，離體胎盤在取得后、灌注前在冰上冷卻或保存。在某些實施方 式中，冷卻的離體胎盤在進行灌注之前保持在從大約> 〇°C到大約6°C或者大約1°C到大約 4°C范圍的溫度下，只要不使胎盤凍結(jié)即可。在其它實施方式中，胎盤在進行灌注之前保持 在大約4°C到大約KTC之間的溫度下4小時。在一種實施方式中，胎盤在進行灌注之前保 持在4°C。在特定的實施方式中，離體的冷卻胎盤在取得后、灌注前保持最多大約40小時的 時間。
[0031] 在某些實施方式中，該方法不需要在灌注之前向胎盤中施用或注射抗凝血劑。在 一種實施方式中，胎盤在灌注之前不施用或注射抗凝血劑。
[0032] 在某些實施方式中，灌注溶液包括生理相容溶液Belzer(非人類使用HffiM