鴨坦布蘇病毒e蛋白第三結構域原核表達的方法及其應用
【專利說明】
[0001]技術領域:
本發(fā)明涉及一種鴨坦布蘇病毒E蛋白原核表達的方法及其應用，屬于生物基因工程領域。
[0002]【背景技術】:
鴨源坦布蘇病毒病毒Tembusu κ/τ?Λ?, ZOT/Z/K)屬黃病毒科黃病毒屬成員，是引起國內以卵巢炎為特征的水禽新發(fā)傳染性疾病的主要病原，該病流行廣泛、傳播迅速、自2010年首次報道以來，病毒已在產蛋鴨、肉鴨和鵝等養(yǎng)殖水禽上發(fā)生感染，并造成產蛋嚴重下降等經濟損失。
[0003]DTMUV病毒編碼3個結構蛋白和7個非結構蛋白。其中囊膜糖蛋白(envelopeprotein,簡稱E蛋白)是坦布蘇病毒的主要結構蛋白，位于成熟病毒粒子表面，構成病毒顆粒的突起，在靶細胞受體結合，膜融合和病毒侵入過程中起著關鍵作用。具備較好的免疫原性和反應原性，是宿主抗感染免疫的主要保護性抗原，也是檢測該病毒特異性抗體的理想革巴抗原O
[0004]
【發(fā)明內容】
:
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種鴨坦布蘇病毒E蛋白原核表達的方法。
[0005]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是:
本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結構域原核表達的方法，包括下列步驟:
(1)特異性引物引物設計與合成: mmN-BainHl -F (上游引物)P1:
5，— GGA^(XTAGTGAAGAATCCTACCG— 3，黑體部分為添加的BamHl酶切位點；
DTMUV- EcoR 1-R (下游引物)P2:
5，— AAGTGAA77<3VCCCCCAACTGAGCC— 3，黑體部分為添加的及I酶切位點；
(2)鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結構域的克隆測序
(3)鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結構域的克隆表達
(4)重組質粒pET-28a-EM的表達與純化
所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白的第三結構域的克隆測序是:
病毒RNA的提取按照病毒總RNA提取試劑盒的說明進行操作，RT-PCR反應體系按照PrimeScript? One Step RT-PCR Kit 說明進行操作，反應程序:50°C 30 min ；94°C 2 min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s，30個循環(huán)；72°C 10 min。反應結束后0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳條帶，膠回收試劑盒回收純化PCR產物。將回收的PCR產物送往大連寶生物工程有限公司進行測序鑒定。
所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結構域的克隆表達是:
以DTMUV-QD株病毒RNA為模板，E基因第三結構域的特異性引物進行RT-PCR擴增，連接轉化按照《分子克隆實驗指南》進行操作，構建重組表達質粒pET-28a-EM，并通過BamH\和EcoR\進行雙酶切鑒定及序列分析。
[0006]所述的第三結構域重組質粒pET-28 a-EM的表達與純化是: 重組質粒pET-28a-EM轉化至大腸桿菌BL21 (Rosetta)感受態(tài)細胞，37°C過夜培養(yǎng)，挑選單個菌落至2 X YT培養(yǎng)基中，37 °C震蕩培養(yǎng)過夜，按1: 100進行轉種2 X YT培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)，用終濃度為0.1 mM的IPTG進行誘導表達。
[0007]將表達菌離心后加入PBS重懸菌體，超聲波冰浴裂解，離心處理后的進行SDS-PAGE鑒定，通過N1-NTA親和層析柱純化重組E蛋白。
[0008]本發(fā)明的方法中表達的鴨坦布蘇病毒E蛋白可用于檢測鴨坦布蘇病毒和制備鴨坦布蘇病毒抗體。
[0009]本發(fā)明的有益效果:
坦布蘇病毒是在我國首次發(fā)現(xiàn)的對水禽致病的新型黃病毒，傳播迅速、對鴨鵝危害大，已給中國水禽業(yè)造成巨大的經濟損失，由于坦布蘇病毒在中國爆發(fā)時間短，所以在該病毒的致病機理、跨物種傳播機制及疫苗研制方面還存在很多迫切需要解決的難題。E蛋白是黃病毒的囊膜蛋白，也是主要的結構蛋白，同時研究結果表明，E蛋白是體外中和作用的主要靶點和病毒特異性抗體的作用位點，具有中和活性，能夠刺激機體產生抗體引發(fā)特異性免疫。對E蛋白進行X射線晶體研究表明:第3結構域具備類免疫球蛋白樣結構域，包含病毒結合受體。具備組成主要線性表位的區(qū)域，也包含病毒中和單抗的識別位點。
[0010]本發(fā)明所構建的pET-28a-EM重組質粒經IPTG誘導可表達出分子量約20KD的E基因第三結構域重組蛋白，Western blotting分析該融合蛋白與DTMUV陽性血清反應呈陽性。具備良好的抗原性，可為建立ELISA方法、免疫熒光、免疫組化以及單克隆抗體的制備等提供原材料。
[0011]【附圖說明】:
圖1是DTMUV E蛋白氨基酸序列的⑶D分析結果。
[0012]圖2是DTMUV E蛋白的抗原性指數(shù)分析。
[0013]圖3 是 pet28a_EM 重組質粒雙酶切鑒定。Ml: λ -Η?η? III DNA Marker ；M2:DL2000 ；1:pET28a-EM/ BamHl + EcoRI ；2: DTMUV-E recombinant plasmid。
[0014]圖 4 是表達蛋白的 SDS-PAGE 鑒定。M: Protein Mff marker (Broad) ;1:未加 IPTG誘導的沉淀；2:未加IPTG誘導的上；3:未加IPTG誘導的全蛋白；4:1PTG誘導的沉淀；5:1PTG誘導的上清；6:1PTG誘導的全蛋白。
[0015]圖5是重組6蛋白純化產物的SDS-PAGE分析。M.蛋白質分子量；1.1PTG誘導的菌液；2.N1-NTA親和層析柱洗脫峰(含有純化的重組EM蛋白)。
[0016]圖 6 是表達蛋白的 SDS-PAGE 鑒定。M:Prot1n marker ；1:pET-28-E inducedby IPTG ；2:pET-28_E uninduced by IPTG ；3:The western blotting of the proteinsinduced by IPTG ；4:The western blotting of the proteins uninduced by IPTG0
[0017]【具體實施方式】:
實施例1鴨坦布蘇病毒E基因第三結構域的原核表達
I材料和方法
1.1毒株、菌株與質粒
DTMUV QD株由本實驗室分離并保存。E.coli DH5 α菌株、Rosetta(DE3)菌株及原核表達載體pET28a ( + )由本室制備并保存；BKH細胞、骨髓瘤細胞SP2/0由本實驗室保存；
1.2試劑 M-MLV反轉錄酶、Razoal RNA提取試劑盒購自Promega公司；Ex Taq DNA擴增用酶，IPTG、DNA marker和限制性內切酶及碰和EcoR\均購自大連寶生物工程有限公司；DNA片段凝膠快速回收試劑盒以及質粒提取試劑盒購自Tiangen公司；6XHis蛋白質純化樹脂N1-NTA購自QIAGEN公司；羊抗鴨HRP-1gG、羊抗鼠HRP-1gG購自Jackson公司；羊抗鼠FITC-1gG、PEG4000、HAT等購自Sigma公司；BALB/c購自山東大學實驗動物中心。自然感染的康復鴨源DTMUV多抗由本實驗室分離保存。
[0018]主要生物信息學分析工具
應用NCBI Conserved Domains查找工具分析氨基酸序列保守結構域，應用DNAStarProtean軟件模塊進行抗原指數(shù)預測，用Emini原則預測特定區(qū)域位于蛋白質表面的可能性，應用親水性、表面特性、柔韌性和二級結構4種參數(shù)聯(lián)合的Jameson-Wolf法綜合預測蛋白的抗原指數(shù)，并根據各結構域的抗原指數(shù)結果選取主要抗原域iMain antigenicdomains, MAD)命名為 E-M。
[0019]引物的設計與合成
根據DTMUV QD株基因序列(GenBank登錄號HQ833330.1)，設計一對E基因第三結構域的特異性引物，預擴增片段長度345bp，由大連寶生物合成。
[0020]mmN-BarnHl -F (上游引物)P1:
5’ — GGA^(XTAGTGAAGAATCCTACCG— 3，黑體部分為添加的及碰們酶切位點 DTMUV- EcoRl