交聯后的四膜蟲小核的分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于純化交聯后的四膜蟲，尤其是嗜熱四膜蟲的小核，尤其是新月期小核的分離方法。
【背景技術】
[0002]現有的四膜蟲大小核的分離方法一般是在機械破碎后通過差速離心或密度梯度沉降的方式進行大小核的分離。主要是針對活細胞進行操作，操作的時間較長且不適合分離新月期小核，因為新月期小核由原本的圓形小核極度延伸后成為線形的小核，在機械破碎時容易破碎。另外由于甲醛等交聯后的細胞難以進行機械破碎，所以目前的實驗方法不適用于交聯后的細胞。
[0003]嗜熱四膜蟲是一個很好的研究模型，然而不能對交聯后的細胞進行有效的裂解和小核的分離，以及難以得到較好的新月期小核。使得針對小核的相關實驗(ChIP，H1-C)難以有效開展。為更好的研究如小核在接合生殖中轉錄活性短暫恢復等問題，需要建立一種可以用于交聯后的嗜熱四膜蟲小核分離的方法。

【發明內容】

[0004]本發明主要針對交聯后的嗜熱四膜蟲進行小核的分離，特別適用于一個特殊時期(新月期)小核的分離，可用于后續的H1-C，ChIP-Seq等實驗。就H1-C實驗而言，這是一種可用于全基因組水平染色質構象及相互作用研究的技術，在近幾年得到了廣泛的關注。四膜蟲有兩個細胞核，且大核中染色體有多個拷貝不適用于H1-C實驗的后續分析研究，故而需要分離純化出其小核用于后續實驗研究，另外四膜蟲的新月期小核是研究染色質構象變化的一個很好的材料。因此本發明為嗜熱四膜蟲中的H1-C及相關研究提供了可行性。
[0005]本發明在用交聯劑如甲醛對嗜熱四膜蟲細胞進行交聯處理后，通過化學裂解法裂解細胞，最終通過離心法分離嗜熱四膜蟲的小核。本發明的技術方案包括:1)使用交聯劑如甲醛對嗜熱四膜蟲細胞進行交聯處理；2)用化學裂解液處理嗜熱四膜蟲細胞使其細胞膜易破碎；3)使用SDS裂解細胞；4)通過多次離心的方式除去大核，最終得到嗜熱四膜蟲的小核。
[0006]本發明技術通過用交聯劑固定細胞，使用化學方法裂解細胞后進行大核和小核的分離。不僅能得到普通的圓形小核，也能分離出處于嗜熱四膜蟲有性生殖中新月期的線性小核。
[0007]具體而言，本發明包括以下各項:
[0008]1.一種分離四膜蟲的小核的方法，所述方法包括:
[0009]I)使用交聯劑對四膜蟲細胞進行交聯處理；
[0010]2)使用SDS裂解細胞；
[0011]3)離心除去大核，得到小核。
[0012]2.根據I所述的方法，所述方法還包括在步驟2)之前用細胞裂解液處理四膜蟲細胞的步驟。
[0013]3.根據權利要求1所述的方法，其中所述四膜蟲是嗜熱四膜蟲。
[0014]4.根據I所述的方法，其中所述交聯劑是甲醛。
[0015]5.根據I所述的方法，其中所述細胞裂解液具有如下組成:20mM Tris-HClpH8.0, 10mM NaCl，20mM KCl, 1.5mM MgC12,1% NP-40。
[0016]6.根據5所述的方法，其中所述細胞裂解液還包含蛋白酶抑制劑混合物。
[0017]7.根據I所述的方法，其中所述小核為新月期小核。
[0018]8.根據I所述的方法，其中步驟3)中的裂解步驟需要將細胞分散成單細胞。
[0019]9.根據I所述的方法，其中步驟3)中的裂解時間為10-15分鐘，優選為12分鐘。
[0020]10.根據I所述的方法，其中重復步驟4)中的離心步驟數次。
[0021]本發明具有以下優點和積極效果:
[0022]現有的分離方法主要用于嗜熱四膜蟲活細胞中的大小核的分離，且不適用于新月期小核的分離。我們建立的嗜熱四膜蟲的小核分離的方法主要是針對H1-C，ChIP等實驗，需要對細胞進行甲醛的固定處理。另外，我們的分離方法不僅可以分離出一般的圓形小核，也可以用于特殊的新月期小核的分離。這一方法的建立，使得針對嗜熱四膜蟲小核的H1-C，ChlP-seq等實驗可以進行。從而為嗜熱四膜蟲小核的基因組功能研究提供了方便。
【附圖說明】
[0023]圖1.嗜熱四膜蟲接合生殖中新月期小核的分離。
【具體實施方式】
[0024]本發明通過以下方式來實現。
[0025]1.樣品收集及保存
[0026]1.取接合后3小時，即新月期的四膜蟲，密度約為2.5xl05個細胞/ml，加37%的甲醛至終濃度I %，混勻，室溫10分鐘。
[0027]2.加入2.5M的甘氨酸至終濃度為125mM以中和甲醛，混勻，室溫放置5分鐘，冰上放置15分鐘。
[0028]3.1500g，4攝氏度離心2分鐘，去上清，用1mM的Tris-HCl清洗一次。再次離心去上清O
[0029]4.轉移到1.5ml的離心管中，每管約2xl07個細胞，2000g，4攝氏度多次離心，盡可能除去殘留的液體。樣品可保存在-80攝氏度或直接用于后續的實驗。
[0030]I1.細胞裂解及新月期小核分離
[0031]1.取-80攝氏度保存的四膜蟲樣品(2xl07個細胞/管)，將每一管樣品，重懸于Iml 的細胞裂解液(20mM Tris-HCl ρΗ8.0，10mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgC12,1% NP-40，使用前加入Ix蛋白酶抑制劑混合物(Roche貨號:Cat.N0.11873580001))中，4攝氏度旋轉裂解I小時。
[0032]2.2000g，4攝氏度離心除去上清，用500ul預冷的細胞裂解液清洗一次，離心后除去裂解液。
[0033]5.用400ul 0.5%的SDS重懸細胞，重懸時盡量使細胞分散成單細胞，避免過多的細胞成團聚集，在62攝氏度下震蕩處理約12分鐘。
[0034]6.加入 200ul 10% Triton X-1OO 和 200ul 水中和 SDS，混勻。
[0035]7.780g，4攝氏度離心12分鐘，小心轉移上清至新的離心管中(小核)，780g，4攝氏度再次離心12分鐘，轉移上清至新的離心管中(除去殘留的大核，可多重復幾次)。
[0036]10.取部分用于DAPI染色鑒定小核分離的效果(如圖1所示)。剩下的樣品20000g，4攝氏度離心12分鐘，棄上清，沉淀為小核。
[0037]分析結果(圖1)中，Lysis是在細胞裂解后的裂解效果圖既有線性的新月期小核和圓形的小核，也有圓形的大核。MIC_1，2，3是最終純化得到的小核的效果圖，基本都是圓形和線性的小核，大核污染很少。因此，證明本發明對于分離小核，尤其是新月期小核非常有效。
【主權項】
1.一種分離四膜蟲的小核的方法，所述方法包括: 1)使用交聯劑對四膜蟲細胞進行交聯處理； 2)使用SDS裂解細胞； 3)離心除去大核，得到小核。2.根據權利要求1所述的方法，所述方法還包括在步驟2)之前用細胞裂解液處理四膜蟲細胞的步驟。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述四膜蟲是嗜熱四膜蟲。4.根據權利要求1所述的方法，其中所述交聯劑是甲醛。5.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞裂解液具有如下組成:20mMTris-HClpH8.0, 10mM NaCl，20mM KCl, 1.5mM MgCl2,1% NP-40o6.根據權利要求5所述的方法，其中所述細胞裂解液還包含蛋白酶抑制劑混合物。7.根據權利要求1所述的方法，其中所述小核為新月期小核。8.根據權利要求1所述的方法，其中步驟3)中的裂解步驟需要將細胞分散成單細胞。9.根據權利要求1所述的方法，其中步驟3)中的裂解時間為10-15分鐘，優選為12分鐘。10.根據權利要求1所述的方法，其中重復步驟4)中的離心步驟數次。
【專利摘要】本發明涉及一種交聯后的四膜蟲小核的分離純化方法，具體是在用交聯劑如甲醛對四膜蟲細胞進行交聯處理后，通過化學裂解法裂解細胞，最終通過離心分離四膜蟲的小核。為嗜熱四膜蟲中的Hi-C及相關研究提供了可行性。
【IPC分類】C12N5/07
【公開號】CN105200004
【申請號】CN201510642078
【發明人】宋曉元, 羅正譽
【申請人】中國科學技術大學
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月30日