一株具有益生作用的凝結(jié)芽孢桿菌hew-b379及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株具有益生作用的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，該菌株命名為HEW?B379，保藏編號(hào)為CGMCC No.12553。本發(fā)明的凝結(jié)芽孢桿菌HEW?B379具有顯著的益生性，可有效抑制腸道致病大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌屬、變形桿菌、腐敗希瓦氏菌、銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)繁殖。本發(fā)明凝結(jié)芽孢桿菌HEW?B379具有較強(qiáng)的抗逆性，可以耐高溫、耐模擬胃液、模擬膽鹽環(huán)境，且能保持99％?100％的存活率，該菌可有效調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生物平衡，抑制有害微生物生長(zhǎng)，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。CGMCC No.1255320160527
【專利說(shuō)明】
-株具有益生作用的凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，設(shè)及一種具有益生作用的凝結(jié)芽抱桿菌 HEW-B379及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們對(duì)畜產(chǎn)品安全和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷加強(qiáng)，作為抗生素的替代品，益生 菌越來(lái)越多的應(yīng)用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)和飼料中。益生菌是一類能改善動(dòng)物胃腸道微生態(tài)平衡，有 益于動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能發(fā)揮的微生物添加劑。其主要作用效果體現(xiàn)在改善動(dòng)物新陳代 謝，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用，提高免疫力，減少環(huán)境污染等方面發(fā)揮重要作用。
[0003] 由于芽抱桿菌對(duì)干燥、高溫、高壓、氧化等不良環(huán)境抵抗力很強(qiáng)，運(yùn)種穩(wěn)定性增加 了它作為益生菌的潛力。因此，獲得新型具有益生特性的芽抱桿菌的研究具有重大意義。分 離和篩選抗病原菌且具有益生效果的凝結(jié)芽抱桿菌，可W更好的應(yīng)用于飼料添加劑，W代 替抗生素。但凝結(jié)芽抱桿菌作為益生菌制劑或飼料添加劑的研究與應(yīng)用較少，尤其是在替 代飼養(yǎng)抗生素和促進(jìn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等方面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種具有益生作用的凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379及其應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379(Bacillus coagulans) 是從健康豬腸道內(nèi)容物中分離的芽抱桿菌菌株，通過(guò)菌落形態(tài)觀察、發(fā)酵性能檢測(cè)、抑菌性 能檢測(cè)、16S rDNA基因序列分析和體外益生效果評(píng)價(jià)得到，該菌株抗逆性強(qiáng)，耐酸堿及耐高 溫強(qiáng)、益生性更加顯著。其16S rDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。該菌株已于2016年5月27日保 藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，分類命名為凝結(jié)芽抱桿菌 (Bacillus coagulans),保藏編號(hào)為CGMCC No. 12553。
[0006] 本發(fā)明提供的凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)皿W-B379具有W下微生物學(xué) 特征：凝結(jié)芽抱桿菌皿W-B379是革蘭氏陽(yáng)性桿菌，在MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，白色菌落、圓 形、有光澤、邊緣整齊，菌落直徑為2~3mm，菌落形態(tài)如圖1，顯微鏡下菌體呈直桿狀，芽抱短 生，兼性厭氧生長(zhǎng)，經(jīng)革蘭氏染色后菌株形態(tài)如圖2;凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379生長(zhǎng)適宜溫度 范圍：4Γ-65°C，最適生長(zhǎng)溫度:20°C-45°C ;生長(zhǎng)適宜pHl. 5-10，最適pH值為6-8。部分生理 生化特性如表1。
[0007] 本發(fā)明提供了含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 12553的凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379的菌劑。 [000引本發(fā)明提供了含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 12553的凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379的飼料 添加劑。
[0009] 飼料添加劑中凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379的活菌數(shù)為1.0X 106~1.0X lO^CFU/g。優(yōu) 選地，飼料添加劑中凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379的活菌數(shù)為1 X 107CFU/g。
[0010] 本發(fā)明提供了含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 12553的凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379的動(dòng)物 飼料。
[0011]本發(fā)明提供了含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 12553的凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379的藥物， 所述藥物為預(yù)防或治療動(dòng)物腹瀉的藥物。
[0012]本發(fā)明提供了含有保藏編號(hào)為CGMCC齡.12553的凝結(jié)芽抱桿菌肥胖-8379或含有 其的菌劑在提高飼料轉(zhuǎn)化率，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明提供了含有保藏編號(hào)為CGMCC齡.12553的凝結(jié)芽抱桿菌肥胖-8379或含有 其的菌劑在制備微生態(tài)益生制劑中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明提供了含有保藏編號(hào)為CGMCC No.l2553的凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379或含有 其的菌劑在制備預(yù)防或治療動(dòng)物腹瀉的藥物中的應(yīng)用。
[001日]本發(fā)明提供了含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 12553的凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379或含有 其的菌劑在制備廣譜抗菌劑中的應(yīng)用。
[0016]所述廣譜抗菌劑的抗菌譜包括抗W下菌:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙口氏 菌、沙口氏菌、志賀氏菌屬、變形桿菌、腐敗希瓦氏菌、銅綠假單胞菌。
[0017]本發(fā)明提供了含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 12553的凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379或含有 其的菌劑在食品制造中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的食品為動(dòng)物用食品。
[0018] 本發(fā)明中所述凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379的培養(yǎng)方法如下：
[0019] 取凝結(jié)芽抱桿菌皿W-B379種子液l-5mL(種子液是挑取的單個(gè)菌落在種子液培養(yǎng) 基中培養(yǎng)的，其活菌濃度Wl〇9CFU/mL計(jì);種子液的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件與發(fā)酵的培養(yǎng)基和培 養(yǎng)條件相同），接種到300mL培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。
[0020] 所述培養(yǎng)基由如下組分組成：可溶性淀粉0.5-5 %，薦糖0.5-5 %，酵母浸粉0.5- 3%，蛋白腺0.1-1.0%，憐酸氨二鐘0.05-0.5%，硫酸儀0.05-0.5%，氯化鋼0.1-2.0%，碳 酸巧0.1-1.0%，余量為水，pH6.8±0.2;其中，優(yōu)選為：可溶性淀粉1.2%，薦糖1.8%，酵母 浸粉1.0%，蛋白腺1.5%，憐酸氨二鐘0.08%，硫酸儀0.2 %，氯化鋼0.5 %，碳酸巧0.2 %，余 量為水，P冊(cè).8±0.2。
[0021] 所述搖瓶發(fā)酵的條件為:發(fā)酵溫度25-45 °C，發(fā)酵時(shí)間8-2地，pH值6.0-8.0，轉(zhuǎn)速為 100-30化/m;優(yōu)選為:發(fā)酵溫度為40°C、pH值6.8、攬拌轉(zhuǎn)速20化/m，發(fā)酵時(shí)間1 Oh。
[0022] 5化種子罐罐培養(yǎng)基與搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基相同。5化發(fā)酵罐發(fā)酵條件為:裝液量為20- 4化培養(yǎng)基，接種量為500-1000mL搖瓶種子液，發(fā)酵溫度為25-45°C，發(fā)酵時(shí)間5-20h，pH值 6.0- 8.0，攬拌轉(zhuǎn)速100-30化/min。其中，優(yōu)選為:裝液量為3化培養(yǎng)基，接種量為600mL，發(fā)酵 溫度為40°C，發(fā)酵時(shí)間1 Oh，pH值6.8，攬拌轉(zhuǎn)速15化/min。
[0023] 50化發(fā)酵罐中試培養(yǎng)基及發(fā)酵條件為：1-25 %教皮浸出液、1-5 %淀粉、1-5 %豆 巧、1-5 %玉米漿干粉、0.05-0.1 %憐酸氨二鐘、0.05-0.5 %硫酸儀、0.1-2.0 %氯化鋼、 0.01-0.05%硫酸儘、0.1-1.0%碳酸巧，余量為水，pH6.0-8.0,控制罐壓0.02-0.05MpB，裝 液量250-30化、接種量25-3化，發(fā)酵溫度為25-45°C，發(fā)酵時(shí)間5-20h，pH值6.0-8.0，攬拌轉(zhuǎn) 速100-30化/min，其中，優(yōu)選為:裝液量為30化培養(yǎng)基，接種量為35mL，發(fā)酵溫度為40°C，發(fā) 酵時(shí)間15h，pH值6.8，攬拌轉(zhuǎn)速150r/min。
[0024] 5T發(fā)酵罐培養(yǎng)基與50化發(fā)酵罐中試培養(yǎng)基相同，其發(fā)酵條件為：控制罐壓0.02- 0.05MpB，裝液量2.5T-3.5T、接種量250-350L，發(fā)酵溫度為25-45°C，發(fā)酵時(shí)間20-3化，抑值 6.0- 8.0，攬拌轉(zhuǎn)速100-30化/min，其中，優(yōu)選為:裝液量為3T培養(yǎng)基，接種量為300mL，發(fā)酵 溫度為40°C，發(fā)酵時(shí)間30h，pH值6.8，攬拌轉(zhuǎn)速15化/min。
[00巧]本發(fā)明凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379的益生性的檢驗(yàn)方法如下：
[0026] 在無(wú)菌操作臺(tái)上，將病原菌(腸道致病大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙口氏菌、 沙口氏菌、志賀氏菌屬、變形桿菌、腐敗希瓦氏菌、銅綠假單胞菌)濃度為109CFU/mL的菌懸 液lOmL與90血與冷卻至50°C的營(yíng)養(yǎng)瓊脂(滅菌后)混勻，制備成厚度4mm左右的病原菌平板， 將滅菌的牛津杯（內(nèi)徑6mm、外徑8mm、高10mm的圓形小管，管的兩端要光滑)放置在培養(yǎng)基 上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，待數(shù)分鐘后，分別向各小管中滴加2(Κ)化的本發(fā)明 制備的發(fā)酵液，勿使其外溢，25 °C -45 °C培養(yǎng)20-3化，然后測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)Ξ個(gè)重 復(fù)，取平均值。
[0027] 其中，所述病原菌平板是將12rC高溫滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂與病原菌菌懸液混勻后， 倒入滅菌后的平板，冷卻后形成表面光滑的4mm厚的病原菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。
[00%]本發(fā)明凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379抗逆性的檢驗(yàn)方法如下：
[0029] 1、高溫耐受試驗(yàn):取lOmL本發(fā)明制備得到的發(fā)酵液注入到試管1中，采用十倍逐級(jí) 稀釋，根據(jù)對(duì)發(fā)酵液活菌的估計(jì)，選擇適當(dāng)稀釋倍數(shù)的稀釋液進(jìn)行涂布。再將裝有l(wèi)OmL本發(fā) 明制備得到的發(fā)酵液的試管2置于90°C水浴鍋中加熱15min，取加熱后的凝結(jié)芽抱桿菌HEW- B379發(fā)酵液進(jìn)行十倍逐級(jí)稀釋，選擇適當(dāng)稀釋倍數(shù)的稀釋液進(jìn)行涂布。最后將加熱前和加 熱后的平板均在4(TC條件下培養(yǎng)2地，計(jì)算凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379加熱前后的數(shù)量。
[0030] 2、模擬胃液及腸液的耐受試驗(yàn)：取lOOg/L的鹽酸16.4mL加蒸饋水稀釋，使pH值分 別為1.5、2.5和3.5，取1 OOmL稀鹽酸溶液，分別加入1 g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模擬胃 液，微孔濾膜除菌(0.22皿)備用。取憐酸二氨鐘6.8g，加水500mL使溶解，用0.1 moL/L氨氧化 鋼溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8;另取膜蛋白酶lOg，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至 1000ml，得模擬腸液，微孔濾膜除菌(0.22μπι)備用。取ImL凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379發(fā)酵液加 入到9mL的模擬胃液中（即十倍逐級(jí)稀釋），并迅速在振蕩器上充分混勻，然后置于40°C靜置 培養(yǎng)2-地。分別在化、2h、化、地的時(shí)候取出培養(yǎng)液并立即檢測(cè)殘存活菌數(shù)，與原活菌數(shù)進(jìn)行 比較。
[0031] 3、模擬膽鹽的耐受試驗(yàn):用膜液素制成Ig/L的溶液，并在溶液中加入0.3%的豬膽 鹽，用10 %的化0H調(diào)整抑為8.0，然后用0.45μπι微濾膜過(guò)濾并除菌。將1血凝結(jié)芽抱桿菌肥W- Β379發(fā)酵液接種到9mL模擬膽鹽中，培養(yǎng)24h后得到培養(yǎng)液，檢測(cè)殘存凝結(jié)芽抱桿菌皿W- B379的活菌數(shù)，與原活菌數(shù)進(jìn)行比較。
[0032] 模擬胃液及腸液和模擬膽鹽耐受試驗(yàn)中的計(jì)數(shù)方法：
[0033] 樣品用無(wú)菌生理鹽水十倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度用于計(jì)數(shù)。涂布時(shí)用移液 槍準(zhǔn)確吸取0.1 mL稀釋液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中間位置，用無(wú)菌涂布器涂布均勻。4(TC倒置培養(yǎng) 2地。
[0034] 本發(fā)明凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379預(yù)防和治療腹瀉的檢驗(yàn)方法：
[0035] 選取普通昆明小白鼠90只，雌性，18-20g，常規(guī)飼養(yǎng)。隨機(jī)分為Ξ組，每個(gè)處理飼喂 基礎(chǔ)日糧，飼喂1周，使小鼠盡快適應(yīng)。開始正式試驗(yàn)，對(duì)照組每日無(wú)菌生理鹽水20化L，試驗(yàn) I組灌胃凝結(jié)芽抱桿菌發(fā)酵液20化L，試驗(yàn)Π 組灌胃大腸桿菌發(fā)酵液20化L，每天早晨9:00灌 胃，連續(xù)兩周，試驗(yàn)期間小鼠同室分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由采食和飲水。環(huán)境溫度控制在25 ±2°C，濕度60%，試驗(yàn)前后分別稱重1次。試驗(yàn)期間觀察小鼠生長(zhǎng)、腹瀉和排便情況;每5天 測(cè)各組小鼠糞便大腸桿菌數(shù)量，取小鼠糞便約Ig，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)加入玻璃珠，震蕩混勻， 稀釋并接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，計(jì)算每克濕便中的大腸桿菌數(shù)。
[0036] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0037] (1)本發(fā)明的凝結(jié)芽抱桿菌皿W-B379耐熱性強(qiáng)（生長(zhǎng)溫度:4°C-65°C，最適生長(zhǎng)溫 度:20°C-45°C);耐酸堿范圍寬泛（生長(zhǎng)適宜pHl.5-10,最適pH值為6-8);發(fā)酵力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺 盛;經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝優(yōu)化，發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)到6.1 X lO^CFU/mL，更加適合飼料工業(yè)和 畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，在畜牧養(yǎng)殖可大大降低生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益，為W后發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí) 的菌種基礎(chǔ)。
[0038] (2)本發(fā)明的凝結(jié)芽抱桿菌皿W-B379具有顯著的益生性，能顯著抑制腸道致病大 腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙口氏菌、沙口氏菌、志賀氏菌屬、變形桿菌、腐敗希瓦氏菌、 銅綠假單胞菌等病原菌的生長(zhǎng)繁殖，具有廣譜抑菌性。
[0039] (3)本發(fā)明的凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379具有較強(qiáng)的抗逆性，能夠耐受模擬胃酸、模擬 膽鹽W及高溫環(huán)境，并且能保持較高的活菌存活率，其活菌存活率可達(dá)到99-100%，更加適 合飼料工業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)的要求。
[0040] (4)本發(fā)明中凝結(jié)芽抱桿菌皿W-B379可有效維持動(dòng)物腸道菌群平衡，改善腸道性 能，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。經(jīng)小鼠腹瀉試驗(yàn)，肥W-B379試驗(yàn)組小鼠體重平均增長(zhǎng)率顯著高于對(duì) 照組和大腸桿菌組(P<〇.05)，且未出現(xiàn)腹瀉情況;大腸桿菌組試驗(yàn)小鼠灌胃凝結(jié)芽抱桿菌 發(fā)酵液后，小鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，且腹瀉情況減少。表明飼喂HEW-B379可有效預(yù)防和治療小鼠 腹瀉，并能夠促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)。
[0041] (5)本發(fā)明的凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379不但可促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料消化吸收，節(jié)約成本， 同時(shí)改善了動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境的微生態(tài)平衡，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，顯著提高了動(dòng)物的生產(chǎn)性能 等，降低了生產(chǎn)成本。具體表現(xiàn)在：107CFU/mL凝結(jié)芽抱桿菌可顯著提高仔豬平均日增重 13.85% (P<0.05)，腹瀉率和死亡率分別降低了53.23%、5.8%。凝結(jié)芽抱桿菌既有與普通 乳酸菌十分相似的特征，又因?qū)儆谘勘U菌而可W體現(xiàn)芽抱桿菌抗逆性強(qiáng)、耐酸耐堿、耐高 溫和易于儲(chǔ)藏等優(yōu)良特性，可W抵抗胃酸和生物酶作用，順利在腸道萌發(fā)并發(fā)揮其對(duì)腸道 的有利作用。
【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1是凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。
[0043] 圖2是凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379經(jīng)革蘭氏染色顯微鏡下的菌株形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0044] W下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0045] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0046] 實(shí)施例1凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379的分離和鑒定
[0047] 1、芽抱桿菌的分離純化:在無(wú)菌條件下采集健康豬腸道內(nèi)容物Ig，置于盛有4.5mL 滅菌生理鹽水的離屯、管中，充分震蕩混勻，于85°C水浴鍋中水浴15min，然后吸取0.5血混合 液于盛有4.5血滅菌生理鹽水的離屯、管中，此稀釋度為ΙΟΛ重復(fù)W上過(guò)程做10倍梯度稀釋， 至10-6稀釋濃度，選擇10-4~10-6Ξ個(gè)稀釋度，吸取0.1 mL涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，平板涂布 后4(TC倒置培養(yǎng)2地，用接種環(huán)挑取疑似芽抱桿菌的菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行劃線分離 培養(yǎng)，經(jīng)2地培養(yǎng)后，挑取分離效果較好的菌落，用接種環(huán)轉(zhuǎn)接于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上作純培養(yǎng)， 重復(fù)傳代純培養(yǎng)3次，而后置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0048] 2、菌落形態(tài)的觀察將步驟1保存的斜面菌種，經(jīng)2-3次活化，取干凈的載玻片進(jìn)行 革蘭氏染色，鏡檢，觀察菌株顯微形態(tài)，選取革蘭氏染色為陽(yáng)性的產(chǎn)芽抱桿菌作為備用。
[0049] 3、抑菌性芽抱桿菌的篩選:取致病菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙口氏菌、肺炎 克雷伯氏菌、志賀氏菌屬、韋榮氏球菌、綠脈桿菌、嗜水氣單胞菌、多殺性己氏桿菌)濃度為 109CFU/mL的菌懸液O.lmL均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，制備成致病菌平板若干個(gè)，在超凈 工作臺(tái)上每個(gè)病原菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板用無(wú)菌綴子夾取2個(gè)滅菌牛津杯對(duì)稱放在平皿上，使其 與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，待數(shù)分鐘后，分別吸取2(Κ)化疑似芽抱桿菌菌株發(fā)酵液于牛津杯中， 另一個(gè)牛津杯中加入等量的YPD培養(yǎng)基作為對(duì)照，于4(TC下恒溫培養(yǎng)4她。每個(gè)菌株至少做3 個(gè)重復(fù)，觀察并測(cè)量抑菌圈大小，選擇抑菌圈大的菌株8株，并分別標(biāo)號(hào)為皿W-B10-1、皿W- B10-2、肥 W-B10-3、皿 W-B10-4、肥 W-B10-5、肥 W-B10-6、皿 W-B10-7、皿 W-B10-8。用接種環(huán)轉(zhuǎn) 接于MRS斜面上作純培養(yǎng)，重復(fù)傳代純培養(yǎng)3次，而后置于4Γ冰箱保存?zhèn)溆茫M(jìn)行下一步的 研究。
[0050] 4、產(chǎn)細(xì)菌素芽抱桿菌的篩選
[0051] 1)目標(biāo)菌株的確定：
[0052] 將步驟3中篩選獲得的8個(gè)芽抱桿菌于YTO斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種活化3-4次，取1- 2環(huán)轉(zhuǎn)接于裝有300mL YPD液體培養(yǎng)基的搖瓶中40°C培養(yǎng)1她，轉(zhuǎn)速為18化/m，調(diào)節(jié)pH值至 7.0，然后分別吸取200化芽抱桿菌發(fā)酵液，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，選擇抑菌性能最好的芽抱桿菌 HEW-B10-2為本發(fā)明篩選的目標(biāo)芽抱桿菌，其在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖1，其經(jīng) 革蘭氏染色顯微鏡下的菌株形態(tài)見圖2,將該菌暫時(shí)命名為芽抱桿菌HEW-B379。
[0053] 2)抑菌蛋白的確認(rèn)：
[0054] 將步驟1)皿W-B10-2培養(yǎng)液中加入硫酸錠至到培養(yǎng)液中不再有沉淀析出，收集沉 淀和上清液，將沉淀透析、去鹽后溶于與上清液等體積的超純水，均勻混合，得溶解液，取適 量溶解液加入0.1 mg/mL的蛋白酶37 °C酶解化。取培養(yǎng)液、上清液、溶解液、酶解液做抑菌試 驗(yàn)。最終確定芽抱桿菌HEW-B379發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為抑菌蛋白。
[0055] 5、菌株屬的鑒定對(duì)肥W-B379菌株進(jìn)行生理生化鑒定，氧化酶、接觸酶、明膠液化試 驗(yàn)、嗎I噪試驗(yàn)和淀粉水解均為陽(yáng)性，表明皿W-B379菌株為芽抱桿菌屬。通過(guò)厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)、 65°C生長(zhǎng)試驗(yàn)及糖醇發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)照。鑒定結(jié)果顯示皿W- B379菌株為凝結(jié)芽抱桿菌。
[0化6] 表1凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379部分生理生化特性
[0化7]
[0化引
[0059] 注：V'表示反應(yīng)陽(yáng)性；表示反應(yīng)陰性。
[0060] 6、16S rDNA測(cè)序測(cè)定采用細(xì)菌DNA提取的試劑盒提取肥W-B379菌株基因組DNA。通 過(guò)引物F和R對(duì)HEW-B379菌株的16S rDNA基因片段進(jìn)行測(cè)序，將所測(cè)得的序列與GenBank中 的16S rDNA序列進(jìn)行化AST分析比對(duì)，可W看出菌株皿W-B379與凝結(jié)芽抱桿菌的同源性達(dá) 到99.98 %。通過(guò)菌株皿W-B379的形態(tài)特征、生理生化特征、16SrDNA特征，確定菌株皿W- B379為凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)。
[0061 ] 7 .菌株保藏上述經(jīng)分離、純化、篩選得到的凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans) 肥W-B379已于2016年5月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（簡(jiǎn) 稱CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼： 100101)，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 12553,分類命名為凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)。
[0062] 實(shí)施例2凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379發(fā)酵液的制備
[0063] 取凝結(jié)芽抱桿菌皿W-B379(保藏編號(hào)為CGMCCNo.l2553)種子液（活菌濃度為 10化即/mL)3mL，接種于300mL培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為40°C、pH6.8、200r/ min,發(fā)酵時(shí)間1 Oh。
[0064] 其中，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基由下述組分組成:可溶性淀粉1.2%，薦糖1.8%，酵母浸粉 1.0%，蛋白腺1.5%，憐酸氨二鐘0.08%，硫酸儀0.2%，氯化鋼0.5%，碳酸巧0.2%，余量為 水，P冊(cè).8 ± 0.2。
[0065] 搖瓶發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行發(fā)酵罐一級(jí)種子培養(yǎng)，取0.化搖瓶發(fā)酵種子液接種到50L發(fā) 酵罐中裝液量為3化培養(yǎng)基，接種量為600mL，發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵時(shí)間1 Oh，pH值6.8，攬拌 轉(zhuǎn)速15化/min。5化發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成同搖瓶發(fā)酵。
[0066] 將50L發(fā)酵的一級(jí)種子液3化接種于50化二級(jí)種子罐中，500L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基成分 及發(fā)酵條件為：1-25 %教皮浸出液、1-5 %淀粉、1-5 %豆巧、1-5 %玉米漿干粉、0.05-0.1 % 憐酸氨二鐘，0.05-0.5 %硫酸儀，0.1-2.0 %氯化鋼，0.01-0.05 %硫酸儘0.1-1.0 %碳酸巧， 余量為水，pH6.0-8.0，裝液量為30化培養(yǎng)基，接種量為35mL，發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵時(shí)間 1化，pH值6.8，攬拌轉(zhuǎn)速150r/min。
[0067] 5T發(fā)酵罐培養(yǎng)基與500L發(fā)酵罐二級(jí)種子培養(yǎng)基相同，其發(fā)酵條件為：控制罐壓 0.02-0.05MpB，裝液量為3T培養(yǎng)基，接種量為300mL，發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵時(shí)間30h，pH值 6.8，攬拌轉(zhuǎn)速15化/111111。
[0068] 發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)發(fā)酵液活菌數(shù)為6.1 X l〇WCFU/mL，發(fā)酵液于4°C保存在冰箱內(nèi)備 用。
[0069] 實(shí)施例3凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379益生性驗(yàn)證
[0070] 在無(wú)菌操作臺(tái)上，將病原菌(腸道致病大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙口氏菌、 沙口氏菌、志賀氏菌屬、變形桿菌、腐敗希瓦氏菌、銅綠假單胞菌)濃度為109CFU/mL的實(shí)施 例2制得的凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379菌懸液0.1 mL均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，制備成致病菌 平板若干個(gè)，在超凈工作臺(tái)上每個(gè)病原菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板用無(wú)菌綴子夾取2個(gè)滅菌牛津杯對(duì) 稱放在平皿上，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，待數(shù)分鐘后，分別向各小管中滴加2(Κ)化的本發(fā) 明制備的發(fā)酵液，勿使其外溢，25°C-45°C培養(yǎng)20-3化，然后測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)立個(gè) 重復(fù)，取平均值。結(jié)果如表2。
[0071 ] 表2凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379對(duì)病原菌的抑菌效果
[0072]
[0073] 實(shí)施例4凝結(jié)芽抱桿菌HEW-B379抗逆性驗(yàn)證
[0074] 1、耐高溫試驗(yàn):取本發(fā)明實(shí)施例2制備得到的凝結(jié)芽抱桿菌皿W-B379發(fā)酵液lOmL 于試管1中，置于90°C水浴鍋中處理15min，計(jì)算凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379發(fā)酵液加熱前后的 數(shù)量。
[0075] 結(jié)果表明，活菌存活率達(dá)到了 100%。
[0076] 2、模擬胃液及腸液的耐受試驗(yàn)：取lOOg/L的鹽酸16.4mL加蒸饋水稀釋，使pH值分 別為1.5、2.5和3.5，取1 OOmL稀鹽酸溶液，分別加入1 g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模擬胃 液，微孔濾膜除菌(0.22皿)備用。取憐酸二氨鐘6.8g，加水500mL使溶解，用0.1 moL/L氨氧化 鋼溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8;另取膜蛋白酶lOg，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至 1000ml，得模擬腸液，微孔濾膜除菌(0.22μπι)備用。取ImL凝結(jié)芽抱桿菌肥W-B379發(fā)酵液加 入到9mL的模擬胃液中（即十倍逐級(jí)稀釋），并迅速在振蕩器上充分混勻，然后置于40°C靜置 培養(yǎng)2-地。分別在化、2h、化、地的時(shí)候取出培養(yǎng)液并立即計(jì)數(shù)殘存活菌數(shù)，與原活菌數(shù)進(jìn)行 比較，結(jié)果表明活菌存活率為99%。
[0077] 3、模擬膽鹽的耐受試驗(yàn):用膜液素制成Ig/L的溶液，并在溶液中加入0.3%的豬膽 鹽，用10 %的化0H調(diào)整抑為8.0，然后用0.45μπι微濾膜過(guò)濾并除菌。將1血凝結(jié)芽抱桿菌肥W- Β379發(fā)酵液接種到9mL模擬膽鹽中，培養(yǎng)24h后得到培養(yǎng)液，計(jì)算殘存凝結(jié)芽抱桿菌皿W- B379的活菌數(shù)，與原活菌數(shù)進(jìn)行比較。結(jié)果表明活菌存活率為99%。
[0078] 模擬胃液及腸液和模擬膽鹽耐受試驗(yàn)中的計(jì)數(shù)方法：
[0079] 樣品用無(wú)菌生理鹽水十倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度用于計(jì)數(shù)。涂布時(shí)用移液 槍準(zhǔn)確吸取0.1 mL稀釋液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中間位置，用無(wú)菌涂布器涂布均勻。4(TC倒置培養(yǎng) 2地。
[0080] 實(shí)施例5凝結(jié)芽抱桿菌CGMCC NO. 12553急性毒性試驗(yàn)
[0081] 凝結(jié)芽抱桿菌的安全性評(píng)價(jià)采用急性毒性試驗(yàn)，參照國(guó)標(biāo)GB15193.3-2003最大耐 受劑量法進(jìn)行。取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半，18-20g，常規(guī)飼養(yǎng)1周后，一日分Ξ次對(duì) 小白鼠進(jìn)行灌胃，〇.25g/mL凝結(jié)芽抱桿菌皿W-B379菌液(相當(dāng)于15000mg/kg體重），連續(xù)灌 月良2周，觀察小鼠是否有中毒或死亡的現(xiàn)象。
[0082] 試驗(yàn)期間，小鼠均無(wú)中毒和死亡現(xiàn)象，因此本發(fā)明菌株的急性毒性試驗(yàn)最大耐受 劑量MTD> 15000mg/kg，根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，可確定該菌種為無(wú)毒級(jí)，具有較高的安全性。
[0083] 實(shí)施例6小鼠腹瀉試驗(yàn)
[0084] 選取普通昆明小白鼠90只，雌性，18-20g，常規(guī)飼養(yǎng)。隨機(jī)分為Ξ組，每個(gè)處理飼喂 基礎(chǔ)日糧，飼喂1周，使小鼠盡快適應(yīng)。開始正式試驗(yàn)，對(duì)照組每日無(wú)菌生理鹽水20化L，試驗(yàn) I組灌胃實(shí)施例2制得的凝結(jié)芽抱桿菌發(fā)酵液2(K)yL，試驗(yàn)Π 組灌胃大腸桿菌發(fā)酵液2(K)yL， 每天早晨9:00灌胃，連續(xù)兩周，試驗(yàn)期間小鼠同室分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由采食和飲水。環(huán) 境溫度控制在25±2°C，濕度60%，試驗(yàn)前后分別稱重1次。試驗(yàn)期間觀察小鼠生長(zhǎng)、腹瀉和 排便情況，計(jì)算各組體重平均增長(zhǎng)率，結(jié)果如表3;每5天測(cè)各組小鼠糞便大腸桿菌數(shù)量，取 小鼠糞便約Ig，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)加入玻璃珠，震蕩混勻，稀釋并接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，計(jì) 算每克濕便中的大腸桿菌數(shù)，結(jié)果如表4。
[0085] 表3小鼠增重情況
[0086]
[0087]表4小鼠糞便中大腸桿菌數(shù)的情況 [008引
[0089] 試驗(yàn)期間，試驗(yàn)I組小鼠精神較好，表現(xiàn)活躍，皮毛鮮亮，且平均增重顯著高于對(duì)照 組，糞便中大腸桿菌數(shù)顯著降低，基本沒(méi)有腹瀉情況;試驗(yàn)Π 組小鼠精神萎靡，不活躍，皮毛 顏色發(fā)暗，糞便較濕，且糞便中大腸桿菌數(shù)顯著增多，出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉情況。將試驗(yàn)Π 組小鼠 隨機(jī)分為兩組，一組進(jìn)行灌胃凝結(jié)芽抱桿菌發(fā)酵液20化L。另一組進(jìn)行灌胃無(wú)菌生理鹽水 200化作為對(duì)照組，灌胃1周，觀察小鼠生長(zhǎng)和糞便狀況。發(fā)現(xiàn)灌胃凝結(jié)芽抱桿菌發(fā)酵液組的 小鼠精神狀態(tài)轉(zhuǎn)好，且小鼠開始活躍，皮毛色澤轉(zhuǎn)好，而對(duì)照組小鼠狀態(tài)仍萎靡不振，食欲 不振，減少腹瀉情況。結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明的凝結(jié)芽抱桿菌發(fā)酵液能夠抑制小時(shí)腹瀉，并促進(jìn) 小鼠生長(zhǎng)。
[0090] 實(shí)施例7哺乳仔豬試驗(yàn)
[0091] 選24頭分娩母豬，隨機(jī)分為四組，并W分娩母豬所產(chǎn)仔豬為試驗(yàn)對(duì)象。分為1個(gè)對(duì) 照組和Ξ個(gè)試驗(yàn)組(試驗(yàn)組1總活菌數(shù)為107c化疑結(jié)芽抱桿菌HEW-B379、試驗(yàn)組2總活菌 數(shù)為108c化/mL凝結(jié)芽抱桿菌皿W-B379、試驗(yàn)組3總活菌數(shù)為109c化/mL凝結(jié)芽抱桿菌皿W- B379)。試驗(yàn)組凝結(jié)芽抱桿菌制劑溶解于無(wú)菌水中，用于試驗(yàn)。試驗(yàn)組仔豬在吃初乳前分別 灌服2mL凝結(jié)芽抱桿菌水溶液，對(duì)照組仔豬則灌服2mL生理鹽水。W后在7d和14加寸再次W同 樣劑量灌服。仔豬出生時(shí)稱初重，28d斷奶時(shí)再次稱重，記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，期間觀察仔豬腹 瀉及死亡情況。
[0092] 表5凝結(jié)芽抱桿菌制劑對(duì)哺乳仔豬體重的影響
[0093]
[0094] 注：同列數(shù)字肩標(biāo)小寫字母相同表示差異不顯著(P〉0.05)，小寫字母不同的表示 差異顯著(P<〇.05)，大寫字母不同的表示差異極顯著(P<0.01)。
[00M]由表5可見，試驗(yàn)組1~3平均增重均高于對(duì)照組，分別比對(duì)照組提高了 13.85 %、 20.77%、20.45%。。試驗(yàn)組1~3的增重分別與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)組1~ 3之間增重差異不顯著(P〉0.05)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，凝結(jié)芽抱桿菌可有效提高哺乳期仔豬的體 重。
[0096]表6凝結(jié)芽抱桿菌制劑對(duì)哺乳仔豬腹瀉及死亡率的影響
[0097]
[0099] 由表6可見，哺乳期仔豬腹瀉主要出現(xiàn)在一周左右。試驗(yàn)組1~3的腹瀉率分別比對(duì) 照組降低了53.23 %、54.79 %和55.04%。復(fù)合益生菌對(duì)于仔豬死亡率的影響，試驗(yàn)組1和試 驗(yàn)組3分別死亡1頭，試驗(yàn)組2未出現(xiàn)死亡的情況，對(duì)照組死亡4頭。實(shí)驗(yàn)組1~3死亡率分別比 對(duì)照組降低5.8%、7.55%和5.83%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凝結(jié)芽抱桿菌可有效降低哺乳期仔豬 的腹瀉率和死亡率。
[0100] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，運(yùn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運(yùn)些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans)HEW-B379,其保藏編號(hào)為CGMCC No.12553。2. 含有權(quán)利要求1所述凝結(jié)芽孢桿菌HEW-B379的菌劑。3. 含有權(quán)利要求1所述凝結(jié)芽孢桿菌HEW-B379的飼料添加劑。4. 如權(quán)利要求3所述的飼料添加劑，其特征在于，飼料添加劑中凝結(jié)芽孢桿菌HEW-B379 的活菌數(shù)為1.0 X 1〇6~1.0 X l〇1()CFU/g。5. 含有權(quán)利要求1所述凝結(jié)芽孢桿菌HEW-B379的藥物，所述藥物為預(yù)防或治療動(dòng)物腹 瀉的藥物。6. 權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌HEW-B379或權(quán)利要求2所述的菌劑在提高飼料轉(zhuǎn)化 率，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌HEW-B379或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備微生態(tài)益 生制劑中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌HEW-B379或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備廣譜抗菌 劑中的應(yīng)用。9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述廣譜抗菌劑的抗菌譜包括抗以下菌:大腸桿菌、金黃 色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌屬、變形桿菌、腐敗希瓦氏菌、銅綠假單胞 菌。10. 權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌HEW-B379或權(quán)利要求2所述的菌劑在食品制造中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P1/12GK106011036SQ201610633178
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年8月4日
【發(fā)明人】李雪平
【申請(qǐng)人】北京好實(shí)沃生物技術(shù)有限公司