一種用于制備ε?聚賴氨酸的微生物球的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于制備ε?聚賴氨酸的微生物球的制備方法，屬于ε?聚賴氨酸制備技術領域。本發明利用蠶繭為原料進行處理，將自制培養基作為填充物，對處理蠶繭殼進行填充，制得微生物球基體，浸泡于由無菌水淋洗培養菌種的培養基表面得到的淋洗液中，之后再移入海藻酸鈉浸泡，進行包裹，再使用竹膜進行表面包裹，從而得到ε?聚賴氨酸的微生物球的制備方法。實例證明，本發明操作簡單，反應條件溫和，儀器取材容易，顯著提高了ε?聚賴氨酸的發酵產量和生產強度，最終使得制得的ε?聚賴氨酸收率和純度均達到了90％以上，可用于工業化生產。
【專利說明】
一種用于制備ε-聚賴氨酸的微生物球的制備方法
技術領域
[0001]本發明公開了一種用于制備ε-聚賴氨酸的微生物球的制備方法，屬于ε-聚賴氨酸制備技術領域。
【背景技術】
[0002]食品的腐敗變質會引起巨大的經濟損失，如何防止腐敗是食品科學工作者最為關注的一個問題.。目前，常用的防腐措施是添加食品防腐劑，食品防腐劑分為化學防腐劑、天然防腐劑和復合型防腐劑，其中使用最為廣泛的是化學防腐劑.目前。除礦泉水、純凈水以夕卜，幾乎所有保質期超過一個月以上的飲料(包括兒童飲用的各種飲料)，蜜餞、醬菜等食品，包括藥品、保健食品口服液的保鮮，均需加入抗菌防腐劑。常規的抗菌防腐劑主要是化學合成的，如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等，毒理學安全評價早已證明，長期使用苯甲酸鈉會對人的肝臟產生危害，并可致癌；山梨酸鉀也對人體有一定的副作用，隨著人們對健康的重視，天然防腐劑和復合型防腐劑的應用會越來越廣泛.。因此，研發天然、無副作用的抗菌防腐劑代替化學抗菌防腐劑已成為必然的趨勢。
[0003]ε_聚賴氨酸是一種新型的天然防霉防腐劑，它不但對人體健康無害，有的還具有一定的營養價值，是今后開發的方向。ε_聚賴氨酸是L-賴氨酸殘基通過α-羧基和ε-氨基形成的酰胺鍵連接而成的均聚氨基酸，故稱為ε_聚賴氨酸。ε-聚賴氨酸具有廣譜抗菌性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有很好的抑菌效果，是目前天然防腐劑中具有優良防腐性能和巨大商業潛力的微生物類飼料防腐劑。
[0004]ε-聚賴氨酸生物防腐劑是一種天然的微生物代謝產物，是需要經分離提取精制而獲得的發酵產品。但是，提取工藝繁瑣、收率低、含量低、純度低、費用高一直是限制ε_聚賴氨酸工業化的重要因素，但目前葡萄糖和甘油都是ε-PL產生菌最適碳源。以葡萄糖為唯一碳源時，ε-PL產生菌的發酵速度快，但ε-PL產量低，葡萄糖轉化率低。以甘油為唯一碳源時，轉化率高，ε-PL產量高，但發酵速度慢。然而，我們研究發現簡單的將葡萄糖和甘油混合共同作為碳源用于ε-PL發酵卻并不能有效提高ε-PL發酵水平。

【發明內容】

[0005]本發明主要解決的技術問題:針對目前傳統方法制備ε_聚賴氨酸的過程中，提取工藝繁瑣，且在發酵的過程中，利用簡單的葡萄糖和甘油混合，用于發酵不能有效提高ε-聚賴氨酸發酵水平，導致制得的ε_聚賴氨酸收率、純度均較低的現狀，提供了一種利用蠶繭為原料進行處理，將自制培養基作為填充物，對處理蠶繭殼進行填充，制得微生物球基體，浸泡于由無菌水淋洗培養菌種的培養基表面得到的淋洗液中，之后再移入海藻酸鈉浸泡，進行包裹，再使用竹膜進行表面包裹，從而得到ε_聚賴氨酸的微生物球的制備方法。該方法操作簡單，反應條件溫和，儀器取材容易，顯著提高了 ε_聚賴氨酸的發酵產量和生產強度，最終使得制得的ε_聚賴氨酸收率和純度均達到了90%以上，可用于工業化生產。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是: (1)使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質量分數為1.2%碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設定壓力為70?80kPa，溫度為95?100°C，蒸煮50?70min后自然冷卻至室溫，過濾收集蠶繭殼浸泡于質量分數為15%的氨水溶液中，再置于15?20°C下靜置2?4h;
(2)上述靜置后過濾，將過濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1:3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在23?26KHz下振蕩50?60min，過濾并將濾渣放入風干機中風干，得處理蠶繭殼；
(3)按重量份數計，取60?70份蛋白胨、40?50份酵母浸膏、20?25份玉米胚芽柏、I?3份制霉素、0.3?0.6份磷酸二氫鉀、0.4?0.5份磷酸氫二鉀、0.6?0.8份水楊酸及6?8份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基，將所得的培養基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用；
(4)按接種量10?15%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養基，并將培養基移至恒溫搖床中，設定溫度為28?32°C，使用紫外線進行照射，培養10?15h，再將培養基移至微波反應器中，室溫下培養4?6h，隨后取出，使用無菌水淋洗培養基表面至其表面無菌絲，收集淋洗液；
(5)將步驟(3)備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開口朝上，使淋洗液淹沒微生物球基體，靜置4?6h，將微生物球基體取出浸泡于質量分數為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置3?5min，將微生物球基體取出室溫下風干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε -聚賴氨酸的微生物球。
[0007]本發明的應用方法是:將本發明制得的ε-聚賴氨酸的微生物球放入發酵罐中，在溫度35?55°C，相對濕度38?42%下密封發酵5?7天，待發酵完畢，取出，經檢測，經此發酵制得的ε_聚賴氨酸收率和純度均達到了90%以上，比傳統發酵法收率提高了 I?2倍，可用于工業化生產。
[0008]本發明的有益效果是:
(1)本發明操作簡單，反應條件溫和，儀器取材容易，發酵條件容易掌握，從而顯著提高了 ε-聚賴氨酸的發酵產量和生產強度；
(2)本發明使得制得的ε_聚賴氨酸能力強，收率和純度均達到了90%以上，可用于工業化生產。
【具體實施方式】
[0009]首先使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質量分數為1.2%碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設定壓力為70?80kPa，溫度為95?100°C，蒸煮50?70min后自然冷卻至室溫，過濾收集蠶繭殼浸泡于質量分數為15%的氨水溶液中，再置于15?20°C下靜置2?4h;上述靜置后過濾，將過濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1:3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在23?26KHz下振蕩50?60min，過濾并將濾渣放入風干機中風干，得處理蠶繭殼；隨后按重量份數計，取60?70份蛋白胨、40?50份酵母浸膏、20?25份玉米胚芽柏、I?3份制霉素、0.3?0.6份磷酸二氫鉀、0.4?0.5份磷酸氫二鉀、0.6?0.8份水楊酸及6?8份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基，將所得的培養基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用;接下來按接種量10?15%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養基，并將培養基移至恒溫搖床中，設定溫度為28?32°C，使用紫外線進行照射，培養10?15h，再將培養基移至微波反應器中，室溫下培養4?6h，隨后取出，使用無菌水淋洗培養基表面至其表面無菌絲，收集淋洗液;最后將上述備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開口朝上，使淋洗液淹沒微生物球基體，靜置4?6h，將微生物球基體取出浸泡于質量分數為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置3?5min，將微生物球基體取出室溫下風干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε-聚賴氨酸的微生物球。
[0010]實例I
首先使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質量分數為1.2%碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設定壓力為70kPa，溫度為95°C，蒸煮50min后自然冷卻至室溫，過濾收集蠶繭殼浸泡于質量分數為15%的氨水溶液中，再置于15°C下靜置2h;上述靜置后過濾，將過濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1: 3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在23KHz下振蕩50min，過濾并將濾渣放入風干機中風干，得處理蠶繭殼；隨后按重量份數計，取60份蛋白胨、40份酵母浸膏、20份玉米胚芽柏、I份制霉素、0.3份磷酸二氫鉀、0.4份磷酸氫二鉀、0.6份水楊酸及6份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基，將所得的培養基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用;接下來按接種量10%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養基，并將培養基移至恒溫搖床中，設定溫度為28°C，使用紫外線進行照射，培養10h，再將培養基移至微波反應器中，室溫下培養4h，隨后取出，使用無菌水淋洗培養基表面至其表面無菌絲，收集淋洗液;最后將上述備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開口朝上，使淋洗液淹沒微生物球基體，靜置4h，將微生物球基體取出浸泡于質量分數為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置3min，將微生物球基體取出室溫下風干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε -聚賴氨酸的微生物球。
[0011]本實例操作簡便，使用時，將本發明制得的ε-聚賴氨酸的微生物球放入發酵罐中，在溫度35°C，相對濕度38%下密封發酵5天，待發酵完畢，取出，經檢測，經此發酵制得的ε-聚賴氨酸收率和純度均達到了 90 %，比傳統發酵法收率提高了 I倍，可用于工業化生產。
[0012]實例2
首先使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質量分數為1.2%碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設定壓力為75kPa，溫度為98°C，蒸煮60min后自然冷卻至室溫，過濾收集蠶繭殼浸泡于質量分數為15%的氨水溶液中，再置于18°C下靜置3h;上述靜置后過濾，將過濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1: 3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在25KHz下振蕩55min，過濾并將濾渣放入風干機中風干，得處理蠶繭殼；隨后按重量份數計，取65份蛋白胨、45份酵母浸膏、23份玉米胚芽柏、2份制霉素、0.5份磷酸二氫鉀、0.45份磷酸氫二鉀、0.7份水楊酸及7份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基，將所得的培養基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用;接下來按接種量13%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養基，并將培養基移至恒溫搖床中，設定溫度為30°C，使用紫外線進行照射，培養13h，再將培養基移至微波反應器中，室溫下培養5h，隨后取出，使用無菌水淋洗培養基表面至其表面無菌絲，收集淋洗液;最后將上述備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開口朝上，使淋洗液淹沒微生物球基體，靜置5h，將微生物球基體取出浸泡于質量分數為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置4min，將微生物球基體取出室溫下風干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε -聚賴氨酸的微生物球。
[0013]本實例操作簡便，使用時，將本發明制得的ε-聚賴氨酸的微生物球放入發酵罐中，在溫度45°C，相對濕度40%下密封發酵6天，待發酵完畢，取出，經檢測，經此發酵制得的ε-聚賴氨酸收率和純度均達到了 92 %，比傳統發酵法收率提高了 1.5倍，可用于工業化生產。
[0014]實例3
首先使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質量分數為1.2%碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設定壓力為SOkPa，溫度為100°C，蒸煮70min后自然冷卻至室溫，過濾收集蠶繭殼浸泡于質量分數為15 %的氨水溶液中，再置于20°C下靜置4h;上述靜置后過濾，將過濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1: 3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在26KHz下振蕩60min，過濾并將濾渣放入風干機中風干，得處理蠶繭殼；隨后按重量份數計，取70份蛋白胨、50份酵母浸膏、25份玉米胚芽柏、3份制霉素、0.6份磷酸二氫鉀、0.5份磷酸氫二鉀、0.8份水楊酸及8份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基，將所得的培養基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用;接下來按接種量15%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養基，并將培養基移至恒溫搖床中，設定溫度為32°C，使用紫外線進行照射，培養15h，再將培養基移至微波反應器中，室溫下培養6h，隨后取出，使用無菌水淋洗培養基表面至其表面無菌絲，收集淋洗液;最后將上述備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開口朝上，使淋洗液淹沒微生物球基體，靜置6h，將微生物球基體取出浸泡于質量分數為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置5min，將微生物球基體取出室溫下風干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε -聚賴氨酸的微生物球。
[0015]本實例操作簡便，使用時，將本發明制得的ε-聚賴氨酸的微生物球放入發酵罐中，在溫度55°C，相對濕度42%下密封發酵7天，待發酵完畢，取出，經檢測，經此發酵制得的ε-聚賴氨酸收率和純度均達到了 95 %，比傳統發酵法收率提高了 2倍，可用于工業化生產。
【主權項】
1.一種用于制備ε-聚賴氨酸的微生物球的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質量分數為1.2 %碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設定壓力為70?80kPa，溫度為95?100°C，蒸煮50?70min后自然冷卻至室溫，過濾收集蠶繭殼浸泡于質量分數為15%的氨水溶液中，再置于15?20°C下靜置2?4h; (2)上述靜置后過濾，將過濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1:3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在23?26KHz下振蕩50?60min，過濾并將濾渣放入風干機中風干，得處理蠶繭殼； (3)按重量份數計，取60?70份蛋白胨、40?50份酵母浸膏、20?25份玉米胚芽柏、I?3份制霉素、0.3?0.6份磷酸二氫鉀、0.4?0.5份磷酸氫二鉀、0.6?0.8份水楊酸及6?8份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基，將所得的培養基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用； (4)按接種量10?15%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養基，并將培養基移至恒溫搖床中，設定溫度為28?32°C，使用紫外線進行照射，培養10?15h，再將培養基移至微波反應器中，室溫下培養4?6h，隨后取出，使用無菌水淋洗培養基表面至其表面無菌絲，收集淋洗液； (5)將步驟(3)備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開口朝上，使淋洗液淹沒微生物球基體，靜置4?6h，將微生物球基體取出浸泡于質量分數為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置3?5min，將微生物球基體取出室溫下風干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε -聚賴氨酸的微生物球。
【文檔編號】C12P13/02GK106085998SQ201610468620
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月25日
【發明人】張靜, 張明, 宋奇
【申請人】張靜