專利名稱：用于監控人健康的基于聚集誘導發光性發光物(aie)的尿蛋白檢測裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種便攜式尿蛋白檢測裝置，其利用聚集誘導發光性(AIE)發光物檢測尿蛋白并且對尿樣品中的總尿蛋白進行定量，以便監控人的健康。尤其涉及一種利用水溶性AIE發光物檢測一種或多種尿蛋白以便測定受試對象中的靶蛋白和總尿蛋白兩者的含量的裝置。所述裝置可在家庭或臨床環境使用，用于定期監控人的健康。
背景技術：
許多人類疾病除非到了很晚的時期，否則不容易被診斷出，因為其生理癥狀不明顯。體液組分的輕微變化可意味著體內出現問題，因此，檢測體液成份是尤其重要。尿通常被用作診斷學和臨床研究中的生物標志，因為其是可以從非侵害性方式容易地獲得的體液。尿液中的蛋白質和肽的復雜混合物可反映血清組成和腎功能。尿液中出現過量的蛋白質警示出現了慢性病，例如糖尿病、高血壓和腎臟炎癥相關的問題等。如今，不少用于定量溶液中的蛋白質的比色方法如布拉德福德(Brandford)和洛瑞(Lowry)分析等已經開發。然而，這些方法一般缺乏靈敏性和準確性，并且程序繁瑣。所綜述可用作每日監控尿蛋白的大部分驗尿片(urine-testing dipstick)都利用浸有pH敏感性染料。對于尿中的主要蛋白質人血清白蛋 白(HSA),驗尿片的檢測閾值可達到100-200mg/L,但健康人的正常尿中的蛋白質濃度卻小于30mg/L，可見驗尿片明顯不夠靈敏，不足以分析腎病。因此開發對低濃度的尿蛋白進行檢測和定量的有效方法具有臨床價值。基于優越的功能性、靈敏性、選擇性和快速性，熒光有機物質的蛋白質生物傳感器已經吸引了很多關注。常規發光物通常遇到的一個棘手問題是聚集引起的淬滅(aggregation-caused quenching ；ACQ)。當它們分散在水性介質中或結合于緩沖溶液中的蛋白質上時，這些分子傾向于聚集，這會淬滅其熒光且因此極大地限制其作為生物探針的有效范圍。我們最近已經發現了一種特別的聚集誘導發光(AIE)現象，其與ACQ作用完全相反(美國專利號7，939，613、8，129，111和8，263，018 ;美國專利申請公開號2012/0172296A1，其公開內容通過引用并入本文)。與淬滅相反，聚集反使某些螺旋槳狀分子發光，使得所述分子由弱熒光團變成強發光體。四苯基乙烯(TPE)是這類AIE發光物中的一種，且具有高熒光量子產率、易合成和易官能化的優點。具有磺酸化官能團的TPE產生水溶性衍生物，其可用作HSA的開啟突光探針(turn-on fluorescent probe)。在人造尿中0-100mg/L的HSA濃度范圍下，熒光強度線性增加，且檢測限可降至低達lmg/L。除了具有優良的靈敏性以外，熒光團在不同的蛋白質和DNA中對HSA顯示極佳的選擇性。這些激動人心的結果鼓舞我們進一步探索其臨床應用。在本發明中，公開了一種低成本、便攜式且技術上簡單的多路尿蛋白裝置，其基于AIE熒光技術，具有高靈敏性。所述裝置可在家庭和診所廣泛使用，以便每日監控健康狀況。

發明內容
本發明的第一方面涉及一種使用AIE發光物檢測尿樣品中的靶蛋白的裝置。本發明的裝置主要包含殼體、光源、用于容納尿樣品的樣品容器、比色皿座、光檢測器、信號放大器、輸出兀件和相關集成電路。光源、比色皿座、光檢測器、信號放大器和集成電路被封閉在殼體中，所述殼體被配置成用于在對來自AIE發光物與靶蛋白的復合物的熒光信號進行檢測期間，避免來自外部光的背景信號。光源盡可能地亮，而裝置中所有元件的尺寸相對較小以便允許裝置容易攜帶。所述裝置的工作原理是利用窄帶寬光源的激發使尿樣品中的靶蛋白與AIE發光物的復合物產生熒光信號，并且將熒光信號與針對人造尿樣品預先確定的參比值進行比較，以便測定尿樣品中的靶蛋白含量，從而測定總尿蛋白。所述裝置可提供對應于靶蛋白含量的定性和定量數據輸出。對于尿蛋白的工作范圍為0-300mg/L，且檢測限值可低達5mg/L。然而，可通過調節AIE發光物的濃度調節工作范圍以使得線性范圍適合所測試的分子。本發明的第二方面涉及一種使用基于AIE發光物的原理的所述裝置來檢測尿樣品中的尿蛋白并測定總尿蛋白的方法。所述方法包含:制備含AIE化合物的溶液，將溶液預先放置在由比色皿座固定的所述裝置的樣品容器中，將尿樣品注射入樣品容器中，使容器暴露在由光源產生的光中，檢測從AIE發光物-靶蛋白復合物發射的熒光信號，將熒光信號轉換成電壓，測量電壓，和比較所測電壓與針對人造尿樣品在不同靶蛋白濃度下預先確定的參比值以定量尿樣品中的靶蛋白含量，和基于靶蛋白含量測定總尿蛋白。如果從熒光信號轉換而來的電信號達到閾電壓，那么所述信號也可用于開啟其它輸出元件，因此可產生定性輸出信號，例如光信號或聲音信號。當開始檢測熒光發射時，所述裝置的定性和定量輸出幾乎都是即時的。


圖1為本發明使用的不同水溶性AIE發光物的分子結構。圖2: (A)化合物I (SATPE)在含不同濃度的HSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的熒光(FL)光譜；⑶在475nm下FL強度隨HSA濃度的變化；10 =在不存在HSA的情況下的FL強度。插圖:SATPE與HSA的結合等溫線的線性區域。[SATPE] = 5 u M ； A ex = 350nm。圖3: (A)在人造尿和PBS緩沖液中的HSA與SATPE的結合等溫線；⑶在475nm下SATPE的FL強度對人造尿和PBS緩沖液中的不同蛋白質的依賴性。[SATPE] = 5 y M ;[蛋白質]=100 ii g/mL ;入 ex = 350nm。圖4是關于尿蛋白檢測裝置如何工作的流程圖。圖5是尿蛋白檢測裝置的集成電路的框圖。圖6是本發明中使用的UV LED光源的發射光譜。圖7是尿蛋白檢測裝置的一個實施方案的俯視圖。圖8:⑷電壓對尿蛋白裝置的人造尿與SATPE混合物中的不同HSA濃度的依賴性；(B)針對人造尿中的不同HSA濃度標準化的電壓。[SATPE] = IOmM
具體實施例方式定義提供以下定義以用于理解本發明的主題并用于構成隨附專利權利要求書。應理解，除非上下文另有明確指示，本說明書和隨附權利要求書中所用的單數形式“一”和“所述”包括復數個參考對象?！熬奂T導發光”或縮寫“ALE”意思是在聚集體形成時或在固態下熒光/磷光被開啟。當在分子水平上溶解時，具有這種性質的物質無發光性。然而，當分子內旋轉受限時，發光開啟?！熬奂鸬拇銣纭被蚩s寫“ACQ”意思是在聚集體形成時或在固態下熒光/磷光被淬滅。當發光物在分子水平上溶解在溶液中時，其可以發光。

“發射強度”意思是通常從熒光分光計、熒光顯微測量裝置獲得的熒光/磷光的量值。除非另外定義，否則本文所用的所有科學技術術語的含義與本發明描述的主題所屬的領域的一般技術人員通常所了解的含義相同。除非另外說明，否則本申請所用的所有化學物質都購自Sigma-Aldrich。在臨近使用前在干燥氮氣下從二苯甲酮羰游基鈉(sodium benzophenone ketyl)中蒸懼THF。水通過Millipore過濾系統進行純化。人造尿是制備得到并在臨近使用前在高壓鍋中消毒。在Bruker AV 300分光計上，使用四甲基硅烷(TMS，6 = 0)作為內標在⑶Cl3中測量1H和13C NMR光譜。高分辨率質譜(HRMS)記錄在以MALD1-T0F模式工作的GCT premierCAB048質譜儀上。發射光譜記錄在Perkin-Elmer LS 55熒光分光計上。術語“發光物”和“熒光團”在本文中可互換使用，指能夠在峰值約350_355nm的UV光的激發下，發射約470-475nm熒光信號的AIE化合物的熒光染料。本發明的水溶性AIE發光物具有以下任一種化學式的骨架:
權利要求
1.一種便攜式尿蛋白檢測裝置，其使用水溶性的聚集誘導發光性發光物檢測和定量尿樣品中的總尿蛋白，所述裝置包含隔光的殼體、光源、樣品容器、比色皿座、光檢測器、信號放大器、多個輸出兀件和相關集成電路， 其中所述光源、所述比色皿座、所述光檢測器、所述信號放大器和相關集成電路被封閉在所述殼體中以便在所述檢測期間與外部光隔絕； 所述光源為LED光源，其能夠產生具有窄帶寬的光，所述窄帶寬的光與所述水溶性的聚集誘導發光性發光物的激發波長匹配，且位于所述聚集誘導發光性發光物的發射光譜之外； 所述樣品容器被配置成用于容納所述水溶性的聚集誘導發光性發光物和所述尿樣品的混合物，并暴露于所述光源時發射熒光； 所述比色皿座被配置成用于固定所述樣品容器的位置； 所述光檢測器被配置成用于檢測熒光信號并將所述熒光信號轉換成電信號，所述熒光信號是由所述樣品容器中的所述水溶性的聚集誘導發光性發光物和所述尿樣品在暴露于所述光源的情況下發射的；和 所述信號放大器被配置成用于將電信號放大到0-9V ； 所述電壓比較器配置成設定閥電壓，用于與通過所述信號放大器放大的電信號比較，以確定所述輸出元件是否被開啟，和/或所述放大的電信號的量值是否可通過所述輸出元件定量地測量；和 所述輸出元件被配置成定性和/或定量反映樣品中尿蛋白的水平。
2.根據權 利要求1所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導發光性發光物包括以下任一種化學式的骨架: R1 IIIHI 其中R1獨立地被化合物(X)nSOfNa+取代，且其中X選自烷基、不飽和烷基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基，且其中n = 0到20。
3.根據權利要求2所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導發光性發光物能夠與所述靶尿蛋白相互作用，以便產生通過儀器可檢測的熒光發射和可見顏色。
4.根據權利要求2所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導發光性發光物包括以下任一種化學式:
5.根據權利要求4所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導發光性發光物對人血清白蛋白具有特異性。
6.根據權利要求1所述的裝置，其中所述光源為UVLED光源，其產生的UV光具有330nm到390nm帶寬且其峰值約在350nm，這與所述水溶性的聚集誘導發光性發光物的激發波長匹配。
7.根據權利要求3所述的裝置，其中當所述水溶性的聚集誘導發光性發光物在暴露于所述光源下與所述尿蛋白相互作用時，所述水溶性的聚集誘導發光性發光物在約475nm下具有最大發射強度。
8.根據權利要求1所述的裝置，其中所述樣品容器的尺寸為IcmXIcmX 5cm且最大體積為約5mL。
9.根據權利要求1所述的裝置，其中所述樣品容器由塑料制成并且是一次性的。
10.根據權利要求1所述的裝置，其中所述相關集成電路包含用于控制所述光源的開啟和關閉的光源部分、用于接收來自所述光檢測器的熒光信號并將所述熒光信號轉換成電信號的樣品和檢測部分、用于控制所述信號放大器的信號處理部分、和用于接收電壓并開啟所述輸出元件的輸出部分。
11.根據權利要求1所述的裝置，其中所述輸出元件包含一個或多個發光裝置、發聲裝置和電壓計。
12.根據權利要求1所述的裝置，其尺寸為約162mmX124mmX80mm。
13.根據權利要求1所述的裝置，其凈重小于1.5kg。
14.根據權利要求1所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導發光性發光物對于所述尿蛋白的工作范圍是0-300mg/L。
15.根據權利要求1所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導發光性發光物對于所述尿蛋白的檢測限是約5mg/L。
16.根據權利要求4所述的裝置，其中當所述水溶性的聚集誘導發光性發光物與所述尿樣品中的人血清白蛋白相互作用時，所述水溶性的聚集誘導發光性發光物能夠在約475nm下發射最大熒光信號，且具有約InM的檢測限。
17.一種用于基于水溶性的聚集誘導發光性發光物測定尿樣品中總尿蛋白的方法，其包括: 制備含有所述水溶性的聚集誘導發光性發光物的溶液； 將所述溶液預先放置到樣品容器中，所述樣品容器安裝在比色皿座上； 將所述尿樣品注入預先放置有所述溶液的所述樣品容器中； 將容納所述溶液與所述尿樣品的混合物的所述樣品容器暴露于由光源產生的約355nm的UV光； 檢測從所述溶液與所述尿樣品的混合物發射的約475nm的熒光信號； 將所述熒光信號轉換成電信號并將所述電信號放大成可檢測的電壓； 測量所述電壓，并將所述電壓與從具有不同濃度靶蛋白的參比樣品記錄的預定電壓進行比較，以便測定所述尿樣品中所述靶蛋白的含量；和 基于所述尿樣品中所述靶蛋白的含量來測定所述總尿蛋白。
18.根據權利要求17所述的方法，其中當所述電壓超過閾電壓時，所述電壓另外開啟其它輸出裝置以產生輸出信號。
19.根據權利要求18所述的方法,其中所述輸出信號選自發光或聲音或人可察覺的任何信號。
20.根據權利要求17所述的方法，其中從所述預先放置到所述檢測是在隔光的環境或隔室中進打。
21.根據權利要求17所述的方法，其中所述水溶性的聚集誘導發光性發光物包括以下任一種化學式:
全文摘要
本發明涉及一種便攜式尿蛋白檢測裝置，其利用聚集誘導發光性(AIE)發光物檢測一種或多種尿蛋白并且對尿樣品中的總尿蛋白進行定量以便監控人的健康。尤其涉及一種裝置，該裝置利用水溶性AIE發光物檢測一種或多種尿蛋白聚集體以便測定受試對象中的靶蛋白和總尿蛋白兩者的含量。所述裝置可在家庭或臨床環境使用，用于定期監控人的健康。
文檔編號C09K11/06GK103196874SQ20131000111
公開日2013年7月10日 申請日期2013年1月4日 優先權日2012年1月9日
發明者唐本忠, 林榮業, 郭子健 申請人:納米及先進材料研發院有限公司