本發明屬于生化分析、納米材料，具體涉及一種聚集誘導電化學發光復合材料及其在葉酸檢測中的應用，特別涉及一種基于paa水凝膠對cu?ncs進行聚集誘導的電化學發光傳感器的構建方法以及對葉酸檢測的應用。

背景技術：

1、葉酸（fa）在人體生理中作用關鍵，對孕婦可預防胎兒神經管缺陷、保障胎兒發育、降低孕婦貧血風險，對中老年人能降低腦卒中幾率、預防老年癡呆、提高記憶力、降低慢性疾病風險。但人體無法合成葉酸，需從食物或補充劑獲取，缺乏或過量都會引發健康問題，因此開發靈敏可靠的葉酸檢測技術至關重要。當前葉酸檢測方法多樣，傳統的電化學分析、熒光分析、化學發光測定和液相色譜分析等雖各有特點，但普遍存在不足。這些方法大多耗時費力，操作流程復雜且檢測時間長，背景信號高影響準確性和靈敏度，動態范圍窄難以滿足不同濃度檢測需求，限制了實際應用。與這些方法相比，近年來新興的電化學發光（ecl）在生物分析中得到了廣泛的應用，ecl具有優良的可控性、簡單的設備、光學設置簡單并且接近零背景和較高靈敏度等優點而得到廣泛應用。

2、電化學發光（ecl）技術新興且具潛力，背景低、靈敏度高、操作簡便等優勢在生物分析領域展現出巨大的應用潛力。然而，傳統有機發光體存在分子密度高導致聚集猝滅（acq效應）的問題，限制了ecl發展。雖有聚集誘導電化學發光（aiecl）的概念，但現有aiecl材料面臨成膜差、合成繁瑣、條件苛刻、含稀有貴金屬成本高的困境，阻礙其廣泛應用和突破。因此，尋找具有高aiecl性能、合成方法簡單、毒性低、成膜性好和減少acq現象的新型aiecl發射體，是一個值得研究的課題。近年來，金屬納米團簇(例如au?ncs、ag?ncs和cuncs)的aiecl的研究也有報道。其中銅納米團簇（cu?ncs）制備成本低、光學性質好、生物相容性佳，在多領域有應用前景。非常適合作為aie材料，但cu?ncs穩定性差易團聚或氧化，ecl發射弱，在高靈敏度檢測應用受限。

3、眾所周知，聚丙烯酸（paa）是一種已知的水凝膠，它具有高水溶性、耐候性、無毒性、可生物降解性和生物相容性等優良性能。paa水凝膠的三維結構能夠導致“籠效應”，這為金屬納米團簇提供了的穩定的環境。ag+是形成paa網絡的合適交聯劑，paa為功能化水凝膠還具有良好的導電性和生物相容性，可以通過模板限制以增強熒光，從而產生強aie。

4、在本發明中將cu?ncs引入具有約束體積的paa水凝膠中，制備了一種具有優異aiecl性能的新型功能性cu?ncs@paa水凝膠復合材料。并基于cu?ncs@paa水凝膠系統建立了一種用于人血清中和實際藥品中葉酸（fa）檢測的新型生物傳感器。所設計的ecl傳感器靈敏度高，穩定性好。此外，該工作將為aiecl在cu?ncs間的進一步應用提供堅實的基礎。

技術實現思路

1、鑒于現有技術中存在的上述問題，本發明旨在提供一種基于paa水凝膠對cu?ncs進行聚集誘導的電化學發光傳感器的構建方法，以實現對葉酸的超靈敏、高選擇性檢測，同時克服現有檢測技術和材料的諸多不足，為生物醫學研究和臨床診斷提供一種可靠、便捷的檢測手段。

2、為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：

3、第一方面，本發明提供了一種聚集誘導電化學發光復合材料，該復合材料為銅納米團簇（cu?ncs）限閾于聚丙烯酸（paa）水凝膠三維結構內，所述paa水凝膠為丙烯酸在引發劑和ag+交聯劑作用下形成的水凝膠，該復合材料表示為cu?ncs@paa水凝膠復合材料。

4、進一步地，所述cu?ncs與丙烯酸的比例為0.1~0.5mol：30l；優選比例為0.2~0.4mol：30l；更優選0.3mol：30l。所述引發劑為過硫酸銨。

5、第二方面，本發明提供了上述cu?ncs@paa水凝膠復合材料的制備方法，包括如下步驟：

6、步驟a、paa水凝膠模板的制備：精確量取硝酸銀溶液、新鮮配制的過硫酸銨溶液以及丙烯酸，將它們充分分散于超純水中；在室溫條件下，經過3～7分鐘的快速反應，即可實現超快速成膠，得到具有彈性和粘性的paa水凝膠；其中，硝酸銀溶液、過硫酸銨溶液、丙烯酸和超純水的體積比為7:10:12:23。

7、步驟b、以上述合成的paa水凝膠為模板，在其基礎上生成銅納米團簇；向paa水凝膠中加入硫酸銅溶液，待充分混合后；使用氫氧化鈉溶液將體系的ph值調節至堿性；在這個過程中，可以觀察到溶液的顏色由無色開始逐漸變為淺藍色；待溶液充分混合均勻后，小心加入水合肼溶液；隨著水合肼的加入，溶液的顏色會進一步由淺藍色變為深棕色，這一顏色變化表明cu?ncs@paa成功制備。

8、在一些實例中，步驟a中，硝酸銀溶液的濃度為5～15mmol?l?1，優選為10mmol?l?1，過硫酸銨溶液的濃度為30～70mmol?l?1，優選為50mmol?l?1，paa水凝膠的成膠時間為3～7分鐘。

9、在一些實例中，步驟b中，硫酸銅溶液的濃度為5～15mmol?l?1，優選為8mmol?l?1，硫酸銅溶液的體積與丙烯酸的體積比為5~25:12。

10、在一些實例中，步驟b中，ph的調節優選為12。

11、第三方面，本發明提供了一種聚集誘導電化學發光生物傳感器，包括將cu?ncs@paa水凝膠復合材料修飾在導電基底表面得到的修飾電極。

12、在一些實例中，將制備好的cu?ncs@paa水凝膠修飾到玻碳電極表面，待干燥后，得到cu?ncs@paa/gce。

13、第四方面，本發明還提供了上述生物傳感器在葉酸檢測中的應用。

14、具體地，以cu?ncs@paa水凝膠復合材料修飾的電極（cu?ncs@paa/gce）為工作電極，鉑絲電極為對電極，銀/氯化銀電極為參比電極，基于三電極檢測體系，在含有80～120mm的k2s2o8且ph為7.4磷酸緩沖鹽溶液中測試其ecl性能；實驗施加的掃描電位范圍為-2～0v，光電倍增管高壓為800v，掃描速率為100mv/s。葉酸對cu?ncs@paa的ecl信號探針的有著明顯猝滅作用。這是因為葉酸能夠被so4??（k2s2o8的中間體）優先氧化fa生成2-氨基-1,4-二氫-4-氧嘧啶-6-羧酸（adoca），從而導致so4??自由基被消耗，與cu?ncs@paa反應的so4??就減少了，相應的cu?ncs@paa的電化學發光信號就會降低，從而導致fa的信號關閉檢測。通過在連續的電勢掃描下，測定不同濃度的fa獲得穩定的ecl-時間曲線，根據ecl測試結果繪制線性關系曲線；檢測樣本中葉酸的ecl強度，根據得到的線性關系曲線計算樣本中葉酸的濃度。

15、本發明所構建的生物傳感器不僅可以用于人血清的實際分析還能用于實際藥物檢測中。

16、在一些實例中，構建的生物傳感器的適用檢測范圍為100pm～50μm，具有高效的分析檢測能力；根據對多種干擾物質的信號測試結果，表明構建的生物傳感器具有高的特異性；根據多次循環測試結果，可得構建的生物傳感器具有良好的穩定性；根據不同批次生物傳感器的信號響應，可得構建的生物傳感器具有良好的再現性。

17、與現有技術相比，本發明具有至少如下之一的有益效果：

18、本發明成功合成了cu?ncs@paa水凝膠復合材料，由于在paa水凝膠對cu?ncs具有限制作用，該復合材料呈現出明顯聚集和明顯的晶格結構。本發明所提供的cu?ncs@paa的ecl發射源于表面狀態，而不是帶隙驅動的發射，paa水凝膠的引入能夠使cu?ncs的ecl強度明顯增強，該復合材料具有優異的聚集誘導電化學發光性能。

19、本發明制備方法簡單易行，所制得的復合材料用于檢測葉酸時，具有較高的靈敏度和較低的檢測限，良好的穩定性和重現性，優異的選擇性以及實際應用前景比較廣泛。