專利名稱：一種促進降解菌定植于生物膜用于對污染水體的處理方法
技術領域：
本發明涉及一種污水處理技木，特別涉及一種促進降解菌定植于生物膜用于對污染水體的處理方法。
背景技術：
向廢水生化處理系統投加特效降解菌的生物強化(bioaugmentation)技術,是去除環境中有毒難降解有機物有效、簡便且沒有二次污染的方法。多年來能降解不同復雜有機物的微生物資源不斷被發現，如中國發明專利CN 101343616 B公開了ー株高壞多環芳烴降解菌及其應用、CN 101638630 B公開了苯こ烯降解菌MJ001及其分離，雖然這些寶貴的降解菌資源已為生物強化處理帶了了希望，但仍然存在著投加的降解菌流失或不易定植的問題。
凝集是兩個細菌之間通過細胞表面特異的多糖與蛋白質凝集素分子進行的相互吸附，同種細菌間的自凝集和不同種屬細菌之間的共凝集在生物膜的形成中發揮著重要的作用，以生物膜形式存在的細菌能更好的停留于水處理系統中。中國發明專利(CN 101255403 B )公開的“一株吡啶降解菌及其應用”，利用了吡啶降解菌同時具有自絮凝(凝集)作用，提高了系統的耐沖擊性。Diana等報道了沒有降解能力但能與壬基酹降解菌發生共凝集作用的一株芽孢桿菌(ガaciパ 5· sp. VA160)促進了壬基酚的降解效率([J] Research in Microbiology, 2004，155 (9) : 761-769)。大多數細菌一般僅可與其它少數幾種細菌發生共凝集。從口腔生物膜中發現能與多種菌發生廣泛共凝集能力的架橋細菌一具核梭桿菌iFusobacteriumnucleatum)后([J] FEMS Microbiology Letters, 2000, 182 (I) :57_62)，1997 年 Buswell 等從人工培養的水體生物膜中分離到19株細菌,研究發現藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)能與其中的11株細菌發生明顯共凝集，扮演了架橋細菌的角色([J] Journal of AppliedMicrobiology 1997，83，477 - 484) ；2002年Rickard等人從淡水生物膜中分離到19株細菌，發現ガnatatoria 2. I能與其它18個種屬的菌株發生特異性凝集([J]Applied and Environmental Microbiology,2002,68 (7) :3644-3650) ;2008 年 Sim5es 等人發現來源于飲用水環境的calcoacticus不僅具有自凝集能力，還能與其它5個分離株中的4個發生共凝集,沒有A. calcoacticus則不發生共凝集([J] Appliedand Environmental Microbiology, 2008, 74 (4) :1259 - 1263)。這些有廣泛共凝集能力的架橋細菌分屬于多個菌屬，目前的研究發現其在進化系統中的分布還是比較分散的。在本發明作出之前，在文獻“廢水處理系統生物膜中細菌的共凝集研究”([J]安徽農業科學，2010,38( 11) : 5752- 5754)中，公開了 2種能與多株細菌發生共凝集作用的架橋細菌，并且證明篩選出的有廣泛共凝集能力的2株細菌具有將多株細菌固定于生物膜的功能。中國發明專利(CN 1076323 C)公開的“廢水處理方法”，采用在污泥活化工序中，加入含有腐殖物、溶出性硅石、溶出性硅石前驅物中的至少一種填充材料的溶出成分，進行接觸混合的技術方案，可以提高活性污泥的凝集吸附カ及絮凝物的形成能力。
現有技術在對架橋細菌的篩選后所達到的效果是自凝集或只能與ー種降解菌發生共凝集，從而提高系統的耐沖擊性或一種污染物的降解效率。而有廣泛共凝集能力的細菌與多種降解菌組合，并通過凝集條件的改進進一步提高凝集活性，并且用于生物強化的技術還未見報道。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術存在的不足，提供一種能促進多種降解菌定植于生物膜，減少降解菌的流失，維持穩定，有效提高對污染水體治理效果的方法。實現本發明目的的技術方案是ー種促進降解菌定植于生物膜用于對污染水體的處理方法，從生物膜法廢水處理池或河道、湖塘水體中采集生物膜樣品，篩選具有廣泛共凝集能力的架橋細菌，再進行如下步驟
(1)將架橋細菌和降解菌分別在各自的培養基液中培養20 30小吋，離心分離后收集 菌體；
(2)用含有促進共凝集的液體制成OD66tl=I的菌懸液，所述含有促進共凝集的液體為在濃度為O. I O. 2 mo I/L的磷酸緩沖液中含有I 3 mmol的CaCl2 ·2Η20和I 3 mmol的 MgSO4 · 7H20, pH = 7. O 7. 5 ;
(3)按體積比I 3:1將架橋細菌與降解菌的菌懸液混合，靜置3小時后，投加到含有毒難降解有機物的生物膜法廢水處理池中，或受有毒難降解有機物污染的水域中，投菌量為 I 10% V/Vo架橋細菌的培養基液為在每IL水中，包括蛋白胨5 10 g，酵母粉2 5 g，(NH4)2NO3 I. O I. 5 g’NaCl O. I O. 5 g,MgSO4 ·7Η20 O. I O. 2 g; CaCl2 ·2Η20 O. 05
O.2 g, FeCl3 · 6H20 O. 01 O. 05 g, K2HPO4 O. 5 I. O g，調節 pH =7. 2 7. 4。降解細菌的培養基液為在每IL水中，包括蛋白胨O I. O g，葡萄糖O I. O g，有毒難降解有機物 O. I I g, (NH4)2NO3 I. O I. 5 g，NaCl O. I O. 5g, MgSO4 ·7Η20 O. I
O.2 g; CaCl2 ·2Η20 O. 05 O. 2 g,FeCl3 ·6Η20 O. 01 O. 05g,K2HPO4 O. 5 I g，調節 pH7. 2 7· 4。所述的有毒難降解有機物包括苯、甲苯、苯酚、硝基苯、苯胺、氯苯和吡啶。在受有毒難降解有機物污染的水域中，放置有供生物膜附著生長的填料，所述的填料固定于箱式框架或網袋內。與現有技術相比，本發明的優點是針對廢水或污染水體中常常含有多種難降解有機物的現象，采用具有廣泛共凝集能力的細菌與多種高效降解菌混合，通過細菌培養條件和共凝集條件的改進，進ー步增強各種功能菌間的共凝集作用，促使多種降解菌固定于生物膜，減少降解菌的流失，維持穩定的降解效果。


圖I是在本實施例提供的菌懸液和普通磷酸緩沖液中G5與A3的共凝集率對比曲線 圖2是本發明實施例I提供的凝集體菌懸液和對比例接種于反應器后出水中3，5- ニ硝基苯甲酸含量的對比曲線圖；圖3是本發明實施例2提供的凝集體的掃描電鏡照片；
圖4是本發明實施例2提供的凝集體菌懸液和對比例投入到水體中后水池出水中苯酚含量的對比曲線圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明技術方案作進ー步的闡述。實施例I
(O共凝集菌(架橋細菌)的培養取事先分離篩選到的有廣泛共凝集能力的架橋細^Bacillus cereus G5，分離篩選方法參見文獻“廢水處理系統生物膜中細菌的共凝集研究”([J]安徽農業科學，2010，38( 11) : 5752- 5754)，經活化培養后接種到架橋細菌培養 液，30°C，150轉/分鐘培養20小時，離心收集菌體。架橋細菌培養液的配方為在每IL自來水中包括蛋白胨 5 g，酵母粉 5 g，(NH4)2NO3 I. 5 g，NaCl O. I g，MgSO4 · 7H20 0. 2 g;CaCl2 · 2H20 0. 05 g, FeCl3 · 6H20 0. 01 g, K2HPO4 0. 5 g，調節 pH =7. 2。(2)降解菌的培養降解菌可選擇使用已報道或通過篩選獲得的多種降解菌，如睪丸酮叢毛單胞菌A3，在本實施例中，取事先分離篩選到的具有3，5-ニ硝基苯甲酸細菌Comamonas testosterone A3,具體方法參見文獻“3，5- ニ硝基苯甲酸降解菌A3的分離及降解特性”([J]中國環境科學，2007，27(1) :106 110)。經活化培養后接種到降解菌培養液中，A3降降解菌培養液的配方為在每IL自來水中包括蛋白胨O. 5 g，3，5-ニ硝基苯甲酸 O. I g, (NH4)2NO3 I. 5 g, NaCl O. I g, MgSO4 · 7H20 O. 2 g ；CaCl2 · 2H20 O. 05 g,FeCl3 ·6Η20 0.01 g，K2HPO4 I g，調節pH 7.2。細菌培養液溫度為30°C，150轉/分鐘培養20小時，離心收集菌體。(3)凝集體的制備將離心收集的上述2種菌體分別重懸于含2 mmol CaCl2 ·2Η20和2 mmol MgSO4 ·7Η20的O. I mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.0)中，調節菌體濃度為OD66tl=I,按I: I體積將上述2種菌懸液混合，靜置3小時后，得到G5A3凝集體菌懸液。參見附圖I，它是本實施例提供的在G5A3凝集體菌懸液和普通磷酸緩沖液中的G5與A3的共凝集率對比曲線圖；由圖I可以看出，在本實施例提供的含鈣、鎂離子的菌懸液中，G5與A3的共凝集效果明顯高于不含鈣、鎂離子的普通磷酸緩沖液。(4)在3個有效容積為5L的反應器中分別加入4個懸浮球填料。按接種量為5%(V/V)，在3反應器中分別投加本實施例提供的G5A3凝集體菌懸液，對比例A3菌懸液和城市生活污水處理廠曝氣池含活性污泥的菌懸液。3個反應器接種后悶曝24h，第二天開始每天更換人工合成的廢水I L，反應器運行溫度28±2°C。人工合成廢水的配方為蛋白胨0.2g，3, 5-ニ硝基苯甲酸O. 2 g, (NH4)2NO3 I. 5 g，NaCl O. I g,MgSO4 ·7Η20 O. 2 g; CaCl2CH2OO. 05 g, FeCl3 · 6H20 O. 01 g, K2HPO4 I g,自來水 1L，調節 pH 7. 2 · 4。參見附圖2，它是本實施例提供的G5A3凝集體菌懸液和A3菌懸液、含活性污泥的菌懸液接種于反應器后，出水中的3，5-ニ硝基苯甲酸含量的對比曲線圖。由圖2可以看出，投加G5與A3凝集體的反應器比只投加降解菌A3的反應器對3，5- ニ硝基苯甲酸的降解速度更快，而只接種生活污水處理廠活性污泥的反應器對3，5- ニ硝基苯甲酸的降解最慢。實施例2
(I)共凝集菌的培養按實施例I技術方案分離篩選到具有廣泛共凝集能力的架橋細菌Bacillus megaterium TI，經活化培養后接種到架橋細菌培養液，30°C，150轉/分鐘培養20小時，離心收集菌體。架橋細菌培養液的配方包括蛋白胨5 g，酵母粉2 g，(NH4)2NO3
I.5 g, NaCl O. I g, MgSO4 · 7H20 O. 2 g ；CaCl2 · 2H20 O. 05 g, FeCl3 · 6H20 0. 01 g, K2HPO4
0.5 g,自來水1L，調節pH =7. 4。(2)降解菌的培養取苯酹降解細菌AeWtZofflmas sp. FY_6,具體方法參見文獻“苯酚降解菌株FY-6的初步鑒定及苯酚降解特性的研究”([J]科技通報，2009，25 (4)441-444)，經活化培養后接種到降解菌培養液中，降解菌培養液的配方為細菌培養液，30°C，150轉/分鐘培養20小時，離心收集菌體。降解菌培養液的配方為蛋白胨O. 5 g，苯酚O. 2 g, (NH4)2NO3 I. 5 g，NaCl O. I g,MgSO4 ·7Η20 O. 2 g ;CaCl2 ·2Η20 O. 05 g,FeCl3 ·6Η20
O.01 g，K2HPO4 I g,自來水 1L，調節 pH =7.4。
(3)凝集體的制備將離心收集的上述2種菌體分別重懸于含2 mmol CaCl2 ·2Η20和2 mmol MgSO4 ·7Η20的O. I mol/L的磷酸緩沖液(pH 7. O)中，調節菌體濃度為0D660=1，按I :1體積將2種菌懸液混合3小時，2種菌凝集體的掃描電鏡照片見圖3，由圖3可以看出，共凝集菌ガ.megaterium Tl (大桿菌)與降解菌P (小桿菌)緊密的凝集在一起，形成了較大塊的凝集體。(4)在O. 5 m3的水池中引入河水并在河水中加入苯酹,使苯酹濃度達到250mg/L,池水深O. Sm，將直徑8cm的懸浮球填料裝入長方形網袋，扎緊網袋ロ，使懸浮球填料在網袋內堆疊5 10層，同時在網袋上系幾根掛了磚石的尼龍繩，使網袋位于水面下20cm左右的位置，將本實施例步驟(3)制得的廣泛共凝集菌與降解菌的凝集體液按2%d的比例投加到已放置生物膜填料的水池內，使共凝集體在沉降的過程中附著到層層堆疊的懸浮球填料上，2天后將池子中的水全部排空(待附著在填料表面的凝集體形成微小菌落)，重新換上添加苯酹至250mg/L的河水(以此為O天)，I天后姆天更換添加苯酹至250mg/L的河水50L,運行過程中每隔12小時開啟I次水循環泵，毎次I小時，水溫為24 28°C，第5天時水池出水中苯酚含量為50mg/L，以相同處理方式但不投加共凝集體的水池和只投加降解菌P的水池為對比例，出水中苯酚含量見圖4。由圖4可以看出，沒有投加降解菌的水池中，苯酚降解情況最差，排空池水后，運行到第3天時苯酚濃度較高為241. 3mg/L ;只投加降解菌的水池中，苯酚的降解情況比沒投加降解菌的水池略好ー些，第3天時苯酚濃度較高為203. 2mg/L，說明大多數降解菌在排空池水的時候流失掉了 ；在投加架橋細菌Tl與降解菌的凝集體的水池中，苯酚的降解效果最好，第3天出水中苯酚含量為94. 3mg/L，說明在排空池水吋，由于共凝集菌促使降解菌已定植于填料表面，降解菌沒有隨著排空池水流失掉，在以后的24天里，出水中的苯酚含量始終保存在較低的濃度，說明降解菌一直存在于水池中。實施例3
(I)按常規微生物學實驗方法，將事先培養獲得的具有廣泛共凝集能力的細菌和降解菌劃線接種至LB試管斜面，30°C培養24小吋。(2)挑取試管上的菌體接種到裝有IOOmL LB液體培養基的250 mL的三角瓶中，30°C，150轉/分鐘振蕩培養24小時。(3)按10%接種量將三角瓶內的菌種分別接種到裝有300 mL LB液體培養基的1000 mL的三角瓶中，30°C，150轉/分鐘振蕩培養24小時。(4)收集2種菌體的菌懸液，6000轉/分鐘離心，分別用含2 mmol CaCl2 ·2Η20和2 mmol MgSO4 · 7H20mol/L的0. I磷酸緩沖液(pH 7. O)制成OD66tl=I的菌懸液,兩種菌懸液按I: I比例混合，靜置3小吋，使廣泛共凝集菌與降解菌的進行共凝集，形成共凝集體。(5)按實施例I或2的技術方案將共凝集體投加到含有毒難降解有機物的生物膜法廢水處理池中，或受有毒難降解有機物污染的水域中，對廢水或污染水體進行生物治理。 ·
權利要求
1.一種促進降解菌定植于生物膜用于對污染水體的處理方法，從生物膜法廢水處理池或河道、湖塘水體中采集生物膜樣品，篩選具有廣泛共凝集能力的架橋細菌，其特征在于再進行如下步驟 (1)將架橋細菌和降解菌分別在各自的培養基液中培養20 30小吋，離心分離后收集菌體； (2)用含有促進共凝集的液體制成OD66tl=I的菌懸液，所述含有促進共凝集的液體為在濃度為O. I O. 2 mo I/L的磷酸緩沖液中含有I 3 mmol的CaCl2 ·2Η20和I 3 mmol的 MgSO4 · 7H20, pH = 7. O 7. 5 ; (3)按體積比I 3:1將架橋細菌與降解菌的菌懸液混合，靜置3小時后，投加到含有毒難降解有機物的生物膜法廢水處理池中，或受有毒難降解有機物污染的水域中，投菌量為 I 10% V/Vo
2.根據權利要求I所述的ー種促進降解菌定植于生物膜用于對污染水體的處理方法，其特征在于架橋細菌的培養基液為在每IL水中，包括蛋白胨5 10 g，酵母粉2 5 g, (NH4)2NO3 I. O I. 5 g, NaCl O. I O. 5 g, MgSO4 · 7H20 O. I O. 2 g; CaCl2 · 2H20.0.05 O. 2 g, FeCl3 · 6H20 O. 01 O. 05 g, K2HPO4 O. 5 I. O g，調節 pH =7. 2 7. 4。
3.根據權利要求I所述的ー種促進降解菌定植于生物膜用于對污染水體的處理方法，其特征在于降解細菌的培養基液為在每IL水中，包括蛋白胨O I. O g，葡萄糖O .1.O g，有毒難降解有機物 O. I I g，(NH4)2NO3 I. O I. 5 g，NaCl O. I O. 5g，MgS04 ·7Η20.O. I O. 2 g; CaCl2 · 2H20 O. 05 O. 2 g, FeCl3 · 6H20 O. 01 O. 05g, K2HPO4 O. 5 I g,調節pH 7. I . 4。
4.根據權利要求I所述的ー種促進降解菌定植于生物膜用于對污染水體的處理方法，其特征在于所述的有毒難降解有機物包括苯、甲苯、苯酚、硝基苯、苯胺、氯苯和吡啶。
5.根據權利要求I所述的ー種促進降解菌定植于生物膜用于對污染水體的處理方法，其特征在干在受有毒難降解有機物污染的水域中，放置有供生物膜附著生長的填料，所述的填料固定于箱式框架或網袋內。
全文摘要
本發明公開了一種促進降解菌定植于生物膜用于對污染水體的處理方法。篩選具有廣泛共凝集能力的架橋細菌和降解菌，分別收集菌體，用含有CaCl2·2H2O和MgSO4·7H2O促進共凝集的液體制成OD660=1的菌懸液，將架橋細菌與降解菌的菌懸液混合后，投加到含有毒難降解有機物的生物膜法廢水處理池中，或受有毒難降解有機物污染的水域中。本發明針對廢水或污染水體中常常含有多種難降解有機物的現象，采用具有廣泛共凝集能力的細菌與多種高效降解菌混合，通過細菌培養條件和共凝集條件的改進，進一步增強各種功能菌間的共凝集作用，促使多種降解菌固定于生物膜，減少降解菌的流失，維持穩定，有效提高了對污染水體的治理效果。
文檔編號C02F3/34GK102826661SQ20121034631
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者李蒙英 申請人:蘇州大學