專利名稱：一種混合模式擴張吸附床介質及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種混合模式擴張床吸附介質及其制備方法，以巰基苯并咪唑 和砜基為配基，屬于層析分離中擴張床吸附分離蛋白質技術。
背景技術：
抗體是一種重要的生物技術產品，廣泛用于免疫治療、疾病預防和醫學診
斷。近年來針對抗體的分離技術取得了一定的進展，但是還需要不斷的補充和
6第 兀香°
常規的離子交換層析和疏水相互作用層析能夠結合抗體，但是特異性和選
擇性較差，分離步驟多，影響抗體的活性收率。Protein A親和層析介質能夠選 擇性吸附抗體，但是介質價格昂貴，且配基易被料液中蛋白酶降解，重復使用 次數低，操作成本極高，限制其大規模應用?；旌夏Ｊ綄游?Mixed-mode chromatography)是近年來發展的一種新型生化分離技術，結合兩種以及兩種以 上的配基一蛋白質相互作用模式，可以顯著提高吸附容量和吸附選擇性，其中 耐鹽性親硫層析是一個重要方向。自1985年Porath (Porath et al. i^5S /e"e^， 1985,185:306)等首次應用親硫層析(thiophilicchromatography)從血清中分離 出抗體以來，親硫層析在蛋白質純化方面，特別是抗體純化方面有了諸多應用。 親硫配基中砜基的硫是個缺電子區，可作為電子受體，而臨近的硫醚中的硫則 為電子富集區，作為電子供體。該特殊結構可以對抗體分子保守區的一些電子 供體-受體位點產生特異性作用，提高抗體吸附的選擇性。然而，傳統親硫層析 必須在一定濃度的硫酸銨或硫酸鈉下才能進行有效吸附抗體，不利于抗體分離， 限制其規?；瘧?，尋找新型的、耐鹽的親硫性混合模式配基是發展趨勢。
擴張床吸附(Expanded Bed Adsorption, EBA)技術形成于20世紀90年代，是
一種集固液分離、濃縮和初期純化于一個操作單元之中的新型蛋白質分離純化 技術。EBA能直接從細胞液、細胞勻漿液或者組織提取液中捕獲目標產物，減 少了操作單元數，縮短了處理時間，節約了生產成本，是近十幾年來出現的一
個新的單元操作。因此，本發明以纖維素/無機增重劑復合微球為擴張床吸附基 質，經二乙烯基砜活化后引入的砜基和偶聯后的巰基苯并咪唑作為其主要功能 配基，形成了一種新型親硫性混合模式擴張吸附床介質，可用于大規模擴張床 吸附分離抗體，成為一種高效集成化的新型抗體分離工藝，相關研究未見文獻 報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種以巰基苯并咪唑和砜基為配基的混合模式擴張床 吸附介質及其制備方法。
以巰基苯并咪唑和砜基為配基的混合模式擴張床吸附介質介質的組成中 基質為纖維素/無機增重劑復合微球，配基為二乙烯基砜活化后引入的砜基和偶 聯后的巰基苯并咪唑，結構組成為<formula>formula see original document page 4</formula>
所述的纖維素/無機增重劑復合微球的骨架為纖維素，增重劑為鈦白粉、不 銹鋼粉、鎳粉或碳化鎢粉，增重劑占濕球的質量百分比含量為16% 61%;纖維
素/無機增重劑復合微球的粒徑為50 250,。配基為2-巰基-l-R-苯并咪唑，R 為0-2個碳原子的短鏈垸烴。配基密度為28 58 iLimol/ml介質。
混合模式擴張床吸附介質的制備方法首先將纖維素粘膠和無機增重劑充 分混合，無機增重劑在混合物中的質量百分含量為16% 61%，加入5倍纖維素 粘膠質量的泵油，控制轉速500 800rpm，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌， 篩選50 250pm粒徑的纖維素/無機增重劑復合微球作為基質；其次將纖維素/ 無機增重劑復合微球、二乙烯基砜、0.1 0.5M pH12的碳酸鈉緩沖液和二甲基 亞砜混合，二乙烯基砜添加的體積量為纖維素/無機增重劑復合微球體積的 18% 36%， 25"C下180rpm搖床中活化4小時，抽濾，用去離子水洗滌得到活 化基質；然后將活化基質、3倍雙鍵摩爾量的巰基乙基吡啶和含25mg/ml過硫酸 銨的0.2 0.7M氫氧化鈉溶液混合，6(TC下180rpm搖床中偶聯8h;最后將微球 加入到含有1% &02和1%甘油的溶液中浸泡2小時，去離子水洗漆，得到以 巰基苯并咪唑和砜基為配基的混合模式擴張床吸附介質。反應過程示意圖為<formula>formula see original document page 5</formula>
本發明充分結合了疏水相互作用、電荷誘導作用和親硫作用等多種配基一 蛋白質相互作用原理，形成特殊的混合模式吸附，具有吸附容量大、選擇性高 等優點。同時，新型混合模式計配基偶聯到纖維素/無機增重劑復合擴張床基質 上，形成了新型的擴張床吸附介質，可以用于抗體等蛋白質的規?；?、高效分 離純化。


圖1混合模式介質吸附卵黃抗體的靜態吸附等溫線(不同pH);
圖2混合模式介質吸附卵黃抗體的靜態吸附等溫線(不同鹽濃度，pH=7)。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的描述 實施例1
將50g纖維素粘膠和40g碳化鉤粉末在500ml圓底燒瓶中300rpm攪拌混合， 加入300g泵油，700rpm轉速，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌，去離子水洗 滌3 5次，篩選50 250(im粒徑大小的纖維素/無機增重劑復合微球作為基質; 將10ml抽干的復合微球、3.6 ml 二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸鈉緩沖液 和1.5ml 二甲基亞砜加入到錐形瓶中，25'C下180rpm搖床中活化4小時，抽濾 除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。加入3倍雙鍵摩爾量的2-巰基苯并咪唑 和10ml含有25mg/ml過硫酸銨的0.5M氫氧化鈉溶液，60"C下180rpm搖床中偶 聯反應8小時，抽濾除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。介質加入到100ml 含有1% &02和1%甘油的溶液中浸泡2小時，去離子水洗滌，得到疏水性電 荷誘導型親硫擴張床吸附介質，介質濕真密度為1.81g/ml，配基密度為 58pmol/ml。 實施例2
將50g纖維素粘膠和40g碳化鎢粉末在500ml圓底燒瓶中300rpm攪拌混合， 加入300g泵油，700rpm轉速，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌，去離子水洗 滌3 5次，篩選50 250|Lim粒徑大小的纖維素/無機增重劑復合微球作為基質;將10ml抽干的復合微球、0.9ml 二乙烯基砜、9ml 0.5MpH12的碳酸鈉緩沖液和 1.5ml二甲基亞砜加入到錐形瓶中，25。C下180rpm搖床中活化4小時，抽濾除 去混合液，用去離子水洗滌，抽干。加入3倍雙鍵摩爾量的2-巰基苯并咪唑和 10ml含有25mg/ml過硫酸銨的0.7M氫氧化鈉溶液，6(TC下180rpm搖床中偶聯 反應8小時，抽濾除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。介質加入到100ml含 有1% &02和1%甘油的溶液中浸泡2小時，去離子水洗滌，得到疏水性電荷 誘導型親硫擴張床吸附介質，介質濕真密度為1.81g/ml，配基密度為28|amol/ml。 實施例3
將50g纖維素粘膠和80g碳化鴇粉末在500ml圓底燒瓶中300rpm攪拌混合， 加入310g泵油，800rpm轉速，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌，去離子水洗 滌3 5次，篩選50 250)Lim粒徑大小的纖維素/無機增重劑復合微球作為基質； 將10ml抽干的復合微球、1.8ml二乙烯基砜、9ml0.1MpH12的碳酸鈉緩沖液和 1.5ml二甲基亞砜加入到錐形瓶中，25'C下180rpm搖床中活化4小時，抽濾除 去混合液，用去離子水洗滌，抽干。加入3倍雙鍵摩爾量的2-巰基苯并咪唑和 10ml含有25mg/ml過硫酸銨的0.2M氫氧化鈉溶液，6(TC下180rpm搖床中偶聯 反應8小時，抽濾除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。介質加入到100ml含 有1% 11202和1%甘油的溶液中浸泡2小時，去離子水洗滌，得到疏水性電荷 誘導型親硫擴張床吸附介質，介質濕真密度為2.40g/ml，配基密度為41|imol/ml。 實施例4
將50g纖維素粘膠和60g碳化輿粉末在500ml圓底燒瓶中300rpm攪拌混合， 加入300g泵油，800rpm轉速，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌，去離子水洗 滌3 5次，篩選50 250)Lim粒徑大小的纖維素/無機增重劑復合微球作為基質; 將10ml抽干的復合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸鈉緩沖液 和1.5ml二甲基亞砜加入到錐形瓶中，25'C下180rpm搖床中活化4小時，抽濾 除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。加入3倍雙鍵摩爾量的2-巰基苯并咪唑 和10ml含有25mg/ml過硫酸銨的0.5M氫氧化鈉溶液，6(TC下180rpm搖床中偶 聯反應8小時，抽濾除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。介質加入到100ml 含有1% 11202和1%甘油的溶液中浸泡2小時，去離子水洗滌，得到疏水性電 荷誘導型親硫擴張床吸附介質，介質濕真密度為2.11g/ml，配基密度為 56|imol/ml。 實施例5
將50g纖維素粘膠和12g鎳粉在500ml圓底燒瓶中300rpm攪拌混合，加入300g泵油，700rpm轉速，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌，去離子水洗滌3 5次，篩選50 250pm粒徑大小的纖維素/無機增重劑復合微球作為基質;將10ml 抽干的復合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml0.25MpH12的碳酸鈉緩沖液和1.5ml 二甲基亞砜加入到錐形瓶中，25'C下180rpm搖床中活化4小時，抽濾除去混合 液，用去離子水洗滌，抽干。加入3倍雙鍵摩爾量的2-巰基苯并咪唑和10ml含 有25mg/ml過硫酸銨的0.5M氫氧化鈉溶液，6(TC下180rpm搖床中偶聯反應8 小時，抽濾除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。介質加入到100ml含有1% H202 和1%甘油的溶液中浸泡2小時，去離子水洗滌，得到疏水性電荷誘導型親硫擴 張床吸附介質，介質濕真密度為1.42g/ml，配基密度為57^imol/ml。 實施例6
將50g纖維素粘膠和20g不銹鋼粉在500ml圓底燒瓶中300rpm攪拌混合， 加入300g泵油，700rpm轉速，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌，去離子水洗 滌3 5次，篩選50 250pm粒徑大小的纖維素/無機增重劑復合微球作為基質; 將10ml抽干的復合微球、3.6ml 二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸鈉緩沖液 和1.5ml二甲基亞砜加入到錐形瓶中，25。C下180rpm搖床中活化4小時，抽濾 除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。加入3倍雙鍵摩爾量的2-巰基苯并咪唑 和10ml含有25mg/ml過硫酸銨的0.5M氫氧化鈉溶液，6(TC下180rpm搖床中偶 聯反應8小時，抽濾除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。介質加入到100ml 含有1% }1202和1%甘油的溶液中浸泡2小時，去離子水洗滌，得到疏水性電 荷誘導型親硫擴張床吸附介質，介質濕真密度為1.71g/ml，配基密度為 54(imol/ml。 實施例7
將50g纖維素粘膠和15g鈦白粉在500ml圓底燒瓶中300rpm攪拌混合，加 入300g泵油，700rpm轉速，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌，去離子水洗滌 3 5次，篩選50 250^im粒徑大小的纖維素/無機增重劑復合微球作為基質；將 10ml抽干的復合微球、3.6ml二乙烯基砜、9 ml 0.25M pH12的碳酸鈉緩沖液和 1.5ml二甲基亞砜加入到錐形瓶中，25。C下180rpm搖床中活化4小時，抽濾除 去混合液，用去離子水洗滌，抽干。加入3倍雙鍵摩爾量的2-巰基苯并咪唑和 10ml含有25mg/ml過硫酸銨的0.5M氫氧化鈉溶液，6(TC下180rpm搖床中偶聯 反應8小時，抽濾除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。介質加入到100ml含 有1% 11202和1%甘油的溶液中浸泡2小時，去離子水洗滌，得到疏水性電荷 誘導型親硫擴張床吸附介質，介質濕真密度為1.39g/ml，配基密度為58pmol/ml。實施例8
將50g纖維素粘膠和40g碳化鉤粉末在500ml圓底燒瓶中300rpm攪拌混合， 加入300g泵油，700rpm轉速，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌，去離子水洗 漆3 5次，篩選50 250^im粒徑大小的纖維素/無機增重劑復合微球作為基質; 將10ml抽干的復合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25MpH12的碳酸鈉緩沖液 和1.5ml二甲基亞砜加入到錐形瓶中，25"下180rpm搖床中活化4小時，抽濾 除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。加入3倍雙鍵摩爾量的2-巰基-l-甲基-苯 并咪唑和10ml含有25mg/ml過硫酸銨的0.5M氫氧化鈉溶液，60'C下180rpm搖 床中偶聯反應8小時，抽濾除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。介質加入到 100ml含有1% &02和1%甘油的溶液中浸泡2小時，去離子水洗滌，得到疏 水性電荷誘導型親硫擴張床吸附介質，介質濕真密度為1.81g/ml，配基密度為 51|jmol/ml。 實施例9
將50g纖維素粘膠和40g碳化鉤粉末在500ml圓底燒瓶中300rpm攪拌混合， 加入300g泵油，700rpm轉速，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌，去離子水洗 滌3 5次，篩選50 250|_im粒徑大小的纖維素/無機增重劑復合微球作為基質； 將10ml抽干的復合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸鈉緩沖液 和1.5ml二甲基亞砜加入到錐形瓶中，25'C下180rpm搖床中活化4小時，抽濾 除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。加入3倍雙鍵摩爾量的2-巰基-l-乙基-苯 并咪唑和10ml含有25mg/ml過硫酸銨的0.5M氫氧化鈉溶液，6(TC下180rpm搖 床中偶聯反應8小時，抽濾除去混合液，用去離子水洗滌，抽干。介質加入到 100ml含有lX &02和1%甘油的溶液中浸泡2小時，去離子水洗滌，得到疏 水性電荷誘導型親硫擴張床吸附介質，介質濕真密度為1.81g/ml，配基密度為 49|xmol/ml。 實施例10
混合模式介質(配基密度為58pmol/ml)吸附卵黃抗體的靜態吸附實驗，首 先將介質用pH5的檸檬酸緩沖液進行平衡；抽濾后分別準確稱取0.4g介質于 25ml帶塞錐形瓶中，加入8ml不同卵黃抗體(IgY)濃度的緩沖溶液；將錐形 瓶置于水浴搖床中，25'C下180rpm振蕩8h;平衡后取出上清液測定IgY的濃度； 根據物料橫算求得吸附蛋白的量和溶液剩余濃度，繪制靜態吸附等溫線，并根 據Langmuir方程擬合得到介質的飽和吸附量為167.3mg/ml。采用同樣方法，測 定了 pH4和pH8時的靜態吸附等溫線，介質對IgY在pH4和8下的靜態飽和吸附容量分別為101.9和114.9mg/ml。結果表明，介質對抗體的吸附容量高，且對 pH變化十分敏感，體現出典型的混合模式吸附特點。 實施例11
混合模式介質(配基密度為58pmol/ml)吸附卵黃抗體的靜態吸附實驗，首 先配置含有0.2M硫酸銨的品pH5檸檬酸緩沖液；將介質用緩沖液進行平衡；抽 濾后分別準確稱取0.4g介質于25ml帶塞錐形瓶中，加入8ml不同不同卵黃抗 體(IgY)濃度的緩沖溶液；將錐形瓶置于水浴搖床中，25。C下180rpm振蕩8h; 平衡后取出上清液測定IgY的濃度；根據物料橫算求得吸附蛋白的量和溶液剩 余濃度，繪制靜態吸附等溫線，并根據Langmuir方程擬合得到介質的飽和吸附 量為144.5mg/ml。采用同樣方法，測定含有0.6M硫酸銨的pH7的檸檬酸緩沖 液中IgY的靜態吸附等溫線，IgY的靜態飽和吸附容量為171.4mg/ml。結果表 明，介質對抗體的吸附容量高，且對鹽濃度變化不敏感，體現出典型的混合模 式吸附特點。
權利要求
1. 一種混合模式擴張床吸附介質，其特征在于介質的組成中基質為纖維素/無機增重劑復合微球，配基為二乙烯基砜活化后引入的砜基和偶聯后的巰基苯并咪唑，結構組成為id="icf0001" file="S2008100618140C00011.gif" wi="78" he="78" top= "57" left = "67" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>
2. 根據權利要求1所述的一種混合模式擴張床吸附介質，其特征在于所述 纖維素/無機增重劑復合微球的骨架為纖維素，增重劑為鈦白粉、不銹鋼粉、鎳 粉或碳化鎢粉，增重劑占濕球的質量百分比含量為16% 61%;纖維素/無機增 重劑復合微球的粒徑為50 250|am。
3. 根據權利要求1所述的一種混合模式擴張床吸附介質，其特征在于配基 為2-巰基-l-R-苯并咪唑，R為0-2個碳原子的短鏈烷烴。
4. 根據權利要求1所述的一種混合模式擴張床吸附介質，其特征在于配基 密度為28 58 |umol/ml介質。
5. —種如權利要求1所述的一種混合模式擴張床吸附介質的制備方法，其特征在于首先將纖維素粘膠和無機增重劑充分混合，無機增重劑在混合物中的質量百分含量為16% 61%，加入5倍纖維素粘膠質量的泵油，控制轉速500 800rpm，反相懸浮熱再生制成球，沸水洗滌，篩選50 250nm粒徑的纖維素/ 無機增重劑復合微球作為基質；其次將纖維素/無機增重劑復合微球、二乙烯基 砜、0.1 0.5M pH12的碳酸鈉緩沖液和二甲基亞砜混合，二乙烯基砜添加的體 積量為纖維素/無機增重劑復合微球體積的18% 36%，25°CT 180rpm搖床中活 化4小時，抽濾，用去離子水洗滌得到活化基質；然后將活化基質、3倍雙鍵摩 爾量的巰基乙基吡啶和含25mg/ml過硫酸銨的0.2 0.7M氫氧化鈉溶液混合， 6(TC下180rpm搖床中偶聯8h;最后將微球加入到含有1% &02和1%甘油的 溶液中浸泡2小時，去離子水洗滌，得到以巰基苯并咪唑和砜基為配基的混合 模式擴張床吸附介質。
全文摘要
本發明公開了一種混合模式擴張吸附床介質及其制備方法。介質組成中基質為纖維素/無機增重劑復合微球，配基為砜基和巰基苯并咪唑。采用反相懸浮熱再生法，得到纖維素/無機增重劑復合微球作為基質；混合二乙烯基砜、碳酸鈉緩沖液和二甲基亞砜進行活化；混合抽干的活化基質、巰基苯并咪唑和含有過硫酸銨的氫氧化鈉進行偶聯，以巰基苯并咪唑和砜基為配基的混合模式擴張床吸附介質。本發明所研制的新型擴張床吸附介質，結合了疏水相互作用、電荷誘導作用和親硫作用等多種配基—蛋白質相互作用機理，形成混合模式吸附，具有吸附容量大、選擇性高等優點，可以用于抗體等生物活性物質的高效分離純化。
文檔編號B01J20/22GK101279243SQ20081006181
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月14日 優先權日2008年5月14日
發明者夏海鋒, 姚善涇, 林東強, 王立平 申請人:浙江大學