專利名稱：血管內皮生長因子b(vegf－b)缺陷動物的心臟異常及與這些心臟異常相關的方法
技術領域：
本發明涉及VEGF-B缺陷動物及其心臟異常。本發明提供了用VEGF-B缺陷動物篩選減輕心臟異常，及診斷心臟疾病，尤其特征在于VEGF-B表達喪失的疾病的方法。
哺乳動物脈管系統的兩種主要組成成分是內皮細胞和平滑肌細胞。內皮細胞形成哺乳動物所有血管和淋巴管的內表面。新血管的形成可通過兩種不同過程發生，血管發生(vasculogenesis)或血管生成(angiogenesis)(參見Risau，W.，自然386671-674(1997))。血管發生特征在于內皮細胞前體原位分化為成熟內皮細胞及這些細胞的相結合形成血管，如發生在早期胚胎初級血管叢的形成中。相反，血管生成，通過預先存在的脈管的生長及分支形成血管，在胚胎生長后期是重要的，且負責成體中發生的血管生長。血管生成是一種復雜生理過程，包括內皮細胞增殖，胞外基質降解，血管分支，及隨后的細胞粘附。在成體中，在正常環境下血管生成被緊密控制并限制在雌性生殖系統中。然而血管生成可在組織損傷的情況下激活。重要的是實體腫瘤能誘導周圍組織中血管生成，因此維持腫瘤生長及促進腫瘤轉移的形成(Folkman，J.，自然醫學127-31，(1995))。復雜的血管生成的分子機制還遠未了解。
血管生成還參與許多病理情況，其在疾病的不同后遺癥中起作用或直接參與其中。一些血管生成例如包括與各種肝臟疾病相關的新血管生成，糖尿病的新血管生成后遺癥，高血壓的新血管生成后遺癥，外傷后的新血管生成，由于頭部外傷所致新血管生成，慢性肝臟感染(如慢性肝炎)中的新血管生成，由于燙傷或凍傷所致的新血管生成，與激素過量相關的功能異常，血管瘤的產生及血管成形術后的再狹窄。
由于血管生成在如此多的生理和病理過程中的重要作用，參與控制血管生成的因子已經深入研究。許多生長因子已示出可調節血管生成；這些因子包括成纖維細胞生長因子(FGFs)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，轉化生長因子α(TGFα)，和肝細胞生長因子(HGF)。見例如Folkman等，生物化學雜志26710931-10934(1992)所述。
已提示內皮細胞特異性生長因子的特殊家族—血管內皮生長因子(VEGFs)，及其相應的受體，主要負責內皮細胞生長和分化的刺激，以及分化的細胞的一些功能。這些因子是PDGF/VEGF家族的成員，并呈現通過內皮受體酪氨酸激酶(RTKs)起作用。生長因子的PDGF/VEGF家族屬于生長因子胱氨酸-結超家族，該超家族還包括神經營養因子和轉化生長因子β。
在PDGF/VEGF家族中已鑒別8種不同的蛋白質，有2種PDGF(A和B)，VEGF和5種與VEGF密切相關的成員。這5種與VEGF密切相關的成員是VEGF-B，見于Ludwig癌癥研究所和Helsinki大學的國際專利申請PCT/US96/02957(WO96/26736)和美國專利5840693及5607918所述；VEGF-C或VEGF2，見于Joukov等，EMBO雜志15290-298(1996)，Lee等，美國科學院院報931988-1992，和人體基因組科學有限公司的美國專利5932540和5935540所述；VEGF-D，見于國際專利申請No.PCT/US97/14696(WO98/07832)，和Achen等，美國科學院院報95548-553(1998)所述；胎盤生長因子(PlGF)，見于Maglione等，美國科學院院報889267-9271(1991)；和VEGF3，見于人體基因組科學有限公司的國際專利申請No.PCT/US95/07283(WO96/39421)所述。每個VEGF家族成員與VEGF有30％-45％的氨基酸序列相同性。VEGF家族成員共同具有一個VEGF同源結構域，該結構域含有形成胱氨酸—結基序的6個半胱氨酸殘基。VEGF家族的功能特點包括改變內皮細胞促分裂原性，誘導血管通透性及血管生成和淋巴管生成性。
血管內皮生長因子(VEGF)，如同其名稱，是內皮細胞特異性促分裂原。其具有強有力的血管生成活性，即其促進新血管生長。血管生成是一個維持生命所必需的生理過程，牽連許多血液中的蛋白質和血管中的細胞。在血管生成期間，促分裂原性因子如VEGF起重要作用。然而，這些因子所起的詳盡生物化學作用還不清楚。
由于對VEGF的鑒別和定性，關于血管生成因子的活性和新因子的闡明有許多重要發現。早期發現顯示血管生成是正常發育和生理所需的。如胚胎生成，傷口愈合，及黃體形成，均涉及血管生成和血管生成因子。例如在傷口愈合期間，VEGF水平提高提示VEGF表達與傷口愈合之間的直接相關性。同樣，VEGF調節缺陷可與傷口愈合失調有關(Frank，S.，等，生物化學雜志270512607-12613(1995))。
其它關于血管生成因子的重要發現表明持久和未調節的血管生成加重和/或導致疾病。例如，關節炎涉及新毛細管侵入關節并破壞關節軟骨。在糖尿病中，視網膜中的新毛細管侵入玻璃體，導致出血和失明。(Folkman，J.和Shing，Y.，生物化學雜志26710931-10934(1992))。血管生成因子在這些及其它疾病中的作用還不十分清楚。
另一種重要發現包括血管生成與腫瘤發育之間的關系。腫瘤生長與轉移均依賴于血管生成過程(Folkman，J.和Shing，Y.，生物化學雜志26710931-10934(1992))。例如，當腫瘤細胞導入動物時，VEGFmRNA的表達模式揭示在壞死的腫瘤生長區域周圍的細胞中有最高的表達水平。在這些區域內鑒別了許多血管。VEGF在這些區域中的表達提示血氧不足，一種缺氧狀態，引發VEGF在壞死的腫瘤中表達和釋放。另一種血管內皮細胞促分裂原，VEGF-B，如下更充分的闡述，也與腫瘤生長尤其惡性腫瘤生長直接相關(見美國專利No.5840693所述)。
VEGF是結構上與血小板衍生生長因子(PDGF)相關的蛋白質家族的成員。PDGF是平滑肌細胞，神經膠質細胞，和一些其它類型細胞的強促分裂原。一方面，PDGF家族的成員特征在于有8個保守的半胱氨酸殘基。在它們的活性生理狀態，蛋白質是在8個半胱氨酸殘基的分子間和分子內通過二硫鍵形成的二聚體。另一方面，此家族成員在其促分裂原作用，尤其對內皮細胞和相關類型細胞的促分裂原作用中是相關的。
血管內皮生長因子B(VEGF-B)，一種非糖基化的高度堿性的生長因子，是另一種PDGF家族成員。由于與VEGF，PDGF-A，PDGF-B，和PlGF(血小板生長因子)在結構上密切相關，VEGF-B在成體和胚胎組織，尤其在肌組織中的血管生成中起作用。VEGF-B還具有血管生成促分裂原作用。Northern印跡分析顯示VEGF-B mRNA在許多小鼠和人的組織中存在，包括心臟，腦，和骨骼肌中。RT-PCR分析已證實VEGF-B mRNA存在于黑素瘤，正常皮膚，和肌肉中。
因此，VEGF-B在哺乳動物的許多組織中表達，但大多數集中在心臟，骨骼肌，和胰腺。VEGF-B的表達模式不同于VEGF，盡管它們都在許多組織中表達(Olofsson，B.等美國科學院院報932576-2581(1996))。
小鼠和人的VEGF-B基因幾乎是相同的，且均跨越大約4kb的DNA。此基因由7個外顯子組成，且它們的外顯子—內含子組構類似于VEGF和PlGF基因(Grimmond等，基因組研究6124-131(1996)；Olofsson等，生物化學雜志27119310-19317(1996)；Townson等，生物化學生物生理學研究綜述220922-928(1996))。目前已識別通過mRNA的可變剪接產生的VEGF-B的兩種同種型(Grimmond等，基因組研究6124-131(1996)；Olofsson等，生物化學雜志27119310-19317(1996)；Townson等，生物化學生物生理學研究綜述220922-928(1996))。這兩種分泌形式的VEGF-B分別有167個(VEGF-B167)和186個(VEGF-B167)氨基酸殘基。該同種型具有相同的115個氨基酸殘基的N末端結構域，不包括信號序列，而C末端結構域不同。通常N末端結構域由外顯子1-5編碼。剩余的3個外顯子的不同用途是產生兩種剪接同種型。通過使用外顯子6中的可變剪接受體位點，導入一個101bp的插入引起讀框移位，和VEGF-B167cDNA編碼區終止。因此，這兩種VEGF-B同種型具有不同的C末端結構域。
VEGF-B的兩種剪接同種型的不同C末端結構域影響它們的生物化學和細胞生物學性質。VEGF-B167的C末端結構域與VEGF中相應區域在結構上相關，具有一些保守的半胱氨酸殘基和一段堿性氨基酸殘基序列。因此，此結構域是高度親水的和堿性的，且因此VEGF-B167在分泌時將保持細胞結合形式，除非生產細胞是用肝素隨后高鹽濃度處理的。結合VEGF-B167的細胞結合形式的分子似乎是細胞表面或細胞外周硫酸肝素蛋白聚糖。此同種型的細胞結合形式通過其獨特的堿性C末端區發生。
VEGF-B186的C末端結構域與數據庫中已知氨基酸序列無明顯相似性。VEGF-B186的C末端結構域的疏水性與VEGF-B167的親水性和堿性的C末端的性質相反。這可通過觀測到VEGF-B186在分泌時不保持細胞結合形式而證實。近來的研究結果表明此同種型是經蛋白酶解加工的，其調節蛋白質的生物學性質(Olofsson等，美國科學院院報9511709-11714(1998))。
關于人和小鼠VEGF-B及各自的同種型的分離和定性包括核苷酸和氨基酸序列詳見于路德維格癌癥研究所和赫爾辛基大學的PCT/US96/02957，美國專利5840693和5607918及Olofsson等，美國科學院院報932576-2581(1996)所述。國際專利申請PCT/US97/14696(WO98/07832)，美國專利5840693和5607918在此并入參考。
與其相關的促分裂原蛋白一樣，VEGF-B在體內呈現為二硫鍵連接的同源二聚體。VEGF-B的兩種同種型也與VEGF形成異源二聚體，與參與類PDGF蛋白的分子間和分子內二硫鍵內的8個半胱氨酸殘基的保守形式一致。另外，VEGF-B和VEGF在許多組織中的共同表達提示，VEGF-B167-VEGF異源二聚體是天然發生的。VEGF-B167-VEGF異源二聚體保持細胞結合形式。相反，VEGF-B186和VEGF異源二聚體在培養基中自由地從細胞中分泌。VEGF還與PlGF形成異源二聚體(DiSalvo等，生物化學雜志2707717-7723(1995))。生長因子此家族的成員之間異源二聚體復合物的生成可提供血管生成或調節分子的多樣性陣列的基礎。
如上所述，PDGF/VEGF家族成員通過與受體酪氨酸激酶結合而起作用。通常地，受體酪氨酸激酶是糖蛋白，其由能結合特異性生長因子的胞外結構域，通常是蛋白質α螺旋部分的跨膜域，在其處受體可例如通過蛋白質磷酸化調節的膜并列(juxtamembrane)結構域，作為受體酶組分的酪氨酸激酶結構域，及在許多受體中參與識別和結合酪氨酸激酶的底物的羧基端末尾組成。
已經鑒別了5個內皮細胞特異性受體酪氨酸激酶，稱為VEGFR-1(Flt-1)，VEGFR-2(KDR/Flk-1)，VEGFR-3(Flt4)，Tie和Tek/Tie-2。這些受體的特異性和親和性不同。所有這些受體都有為信號轉導所必需的固有的酪氨酸激酶活性。
已知與VEGFs結合的受體酪氨酸激酶是VEGFR-1，VEGFR-2，和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2與VEGF高親和性結合，VEGFR-1還結合PlGF。VEGF-B與VEGFR-1高親和性結合，但不與VEGFR-2或VEGFR-3結合(Olofsson等，美國科學院院報9511709-11714(1998))。VEGF-C已示出是VEGFR-3的配體，且還激活VEGFR-2(Joukov等，EMBO雜志15290-298(1996))。VEGF-D與VEGFR-2和VEGFR-3均結合(Achen等，美國科學院院報95548-553(1998))。Tek/Tie-2的配體已由Regeneron制藥公司的國際專利申請No.PCT/US95/12935(WO96/11269)闡述。Tie的配體還未鑒別。
近來，已純化和克隆了一種新的130-135kDa的VEGF同種型特異性受體(Soker等，細胞92735-745(1998))。發現VEGF受體通過外顯子7編碼的序列特異地結合VEGF165，其示出與肝素的微弱親和性(Soker等，細胞92735-745(1998))。令人驚奇地，此受體示出與人neuropilin-1(NP-1)相同，NP-1是一種參與早期神經形態發生中的一種受體。PlGF-2也呈現與NP-1相互作用(Migdal等，生物化學雜志27322272-22278(1998))。
VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3是通過內皮細胞不同表達的。通常地，VEGFR-1和VEGFR-2均在血管內皮中表達(Oelrichs等，癌基因811-18(1992)；Kaipainen等，實驗方法雜志1782077-2088(1993)；Dumont等，Dev.Dyn.20380-92(1995)；Fong等，Dev.Dyn.2071-10(1996))，VEGFR-3主要在成體組織的淋巴內皮中表達(Kaipainen等，美國科學院院報93566-3570(1995))。VEGFR-3還在腫瘤周圍的血管中表達。
盡管VEGFR-1在發育期間主要在內皮細胞中表達，但在胚胎發生的早期階段也發現其在造血前體細胞中(Fong等，自然37666-70(1995))。在成體中，單核細胞和巨噬細胞也表達此受體(Barleon等，血液873365-3343(1995))。在胚胎中，VEGFR-1由大多數血管表達(Breier等，Dev.Dyn.204228-239(1995)；Fong等，Dev.Dyn.2071-10(1996))。
轉基因動物是研究蛋白質功能和生理活性的有效工具，且已為此產生了許多這種動物。一種產生轉基因動物的特殊方法包括同源重組法。在同源重組中，所有或部分基因組序列用另一種含有同源序列的DNA置換。通過轉基因操作和同源重組，動物細胞中的基因或部分基因可被改變。改變基因以編碼不再有天然蛋白質的功能的蛋白質，產生無效突變體或無效等位基因。(見例如，美國專利No.5557032)。
為研究VEGF功能和生理學，已報道了含有VEGF基因無效突變體的轉基因胚胎(Carmetliet，P.，等，自然380435-439(1996))，從中得到一些重要發現。在VEGF無效突變體的胚胎雜合子中，血管形成是異常的，但未廢除。VEGF無效突變體的胚胎純合子在血管生成中表現更明顯的削弱。此純合子胚胎死于中期妊娠。在由生殖細胞系傳遞產生的雜合子子代胚胎中觀測到相似表型。然而，Carmetliet的關于胚胎的研究，未報道動物的表型和用途。另外，VEGF轉基因胚胎的產生，未有關于所有類VEGF蛋白質的血管生成或腫瘤生長調節性質的發現。
因此，盡管本領域闡述了血管生成因子的功能和生理，這些因子仍未完全清楚，仍需要可用于評價血管生成因子如VEGF-B的活性，以及它們在上述各種疾病中作用，和/或用于開發和/或評價其它血管生成肽的方法。
發明概述本發明一方面包括含有突變的VEGF-B基因的轉基因動物的應用。VEGF-B基因是通過同源重組方法突變的。這些轉基因動物有許多用途。例如，所述動物的研究可提供關于VEGF-B多肽，其片段或類似物如小分子的治療和施用的重要信息。尤其本發明的轉基因動物可用于闡明VEGF-B和/或其它細胞因子對生理現象如通透性，炎癥和/或組織修復的作用。此動物或衍生自此動物的細胞用于篩選分析，以鑒別調節血管生成和/或腫瘤生長的化合物。此動物也可用于測試VEGF-B激動劑在體內的分布和功能和非毒性，及含有VEGF-B的分子。
本發明另一方面提供了一種含有至少一種無功能突變的VEGF-B等位基因的轉基因非人動物的應用方法。此轉基因動物是通過將轉基因DNA導入非人動物優選小鼠的胚胎干細胞中而產生的。此轉基因DNA有一個同源于VEGF-B的序列的區域。然后，選擇這樣的細胞，其中轉基因DNA已整合入干細胞基因組DNA的至少一個拷貝的內源基因組VEGF-B序列位點。將此細胞導入發育動物的胚泡中，并使其發育成轉基因動物。
用于產生本發明方法所使用的轉基因動物的轉基因DNA，包含來自VEGF-B基因的核苷酸序列，該序列已通過本領域許多已知方法改變，突變或修改。因此，用于產生轉基因動物的DNA可含有許多不同的DNA序列。根據所需效應選擇適當的序列。例如，半胱氨酸的至少一個密碼子可改變或缺失。所得動物可產生一種VEGF-B，其具有與天然VEGF-B或另一種類PDGF蛋白質形成二聚體的改變的能力。在一優選的實施方案中，VEGF-B的8個半胱氨酸有7個已缺失，產生VEGF-B的無效突變體。
另一方面，本發明提供了一種篩選化合物的方法，該化合物在轉基因動物中具有實現血管生成，或調節腫瘤生長或進展，或增加心肌組織的能力。此方法包括將化合物導入轉基因動物中，并檢測動物體內血管發育。或者，此方法包括將腫瘤細胞導入轉基因動物中，并將化合物導入相同動物中，檢測動物體內腫瘤發育。
上述方法的各種實施方案包括在本發明范圍內。例如，可以衍生一種篩選具有恢復或可檢測地實現VEGF-B基因產物的活性的能力的化合物的方法，包括將化合物加入到合適的細胞系中。根據本發明產生的轉基因動物和細胞系可用于這些方法中。這種動物或細胞系系統也可用于選擇化合物，其能恢復或調節VEGF-B基因的活性和/或血管生成。此化合物可以是蛋白質形式(例如在體外重組或合成的)，或者是編碼VEGF-B或其類似物的DNA形式。可以是可操縱地與啟動子連接的裸基因組DNA或cDNA，其可進一步與病毒或細菌載體連接。DNA可摻入脂質體結構中，如Lui等，自然生物技術，15167-172(1997)。此DNA或蛋白質也可由VEGF-B剔除小鼠胚胎在8-16個細胞的胚胎階段提供。
具有突變體VEGF-B基因序列(其野生型或突變的片段)的所得轉基因動物可用于產生雙轉基因動物。為此，突變體VEGF-B轉基因動物可與其它相同物種的轉基因動物或與相同物種的天然發生的突變體動物交配。所得雙轉基因動物或衍生自其中的細胞，可作為突變體親代轉基因動物用于相同的應用中。
已知突變或修改核酸序列的方法，可用于產生本發明所用的VEGF-B突變體動物，細胞系或序列。這種方法包括但非限于點突變，定點誘變，缺失突變，插入突變，得自同源重組的突變，和得自化學或放射性處理的DNA或攜帶DNA的細胞的突變體。如果需要或必需，PCR分析或DNA測序可用于確定產生的突變。然后，突變體動物，細胞系或序列可用于所述DNA序列，系統，分析，方法中。定義上突變的或修飾的DNA與基因組DNA是不同的或不相同的。突變體動物也可通過將含有本文所述的或通過本發明產生的序列的第一個轉基因動物與第二個動物交配而產生。第二個動物可含有不同于第一個動物中所含有的DNA。以這種方式可產生各種突變體動物系。
另外，重組DNA方法適于突變本文所述DNA序列，將這些DNA序列連接于表達載體，并表達VEGF-B蛋白質或突變體。由此可分析VEGF-B突變體的生物化學或行為活性。以此方式可產生阻止有效的VEGF-B表達的突變的DNA序列。
本發明中“修飾的VEGF-B DNA”指來自已經通過體外或重組DNA方法修飾的VEGF-B基因的核苷酸序列。修飾的VEGF-B DNA不含有如來自一種胚胎干細胞的基因一樣的核苷酸序列，該胚胎干細胞已導入轉基因DNA。特別包括的是在VEGF-B DNA序列中由于核苷酸的缺失，取代和插入所作的修飾。例如，一個特殊修飾的VEGF-B DNA含有小鼠VEGF-B DNA序列的3個或所有4個外顯子的缺失。VEGF-B基因座的限制圖譜(

圖1和3)通過缺失至少一個限制性片段，可用于設計各種修飾的VEGF-B DNAs。
本發明的方法提供了解釋各種物質包括血管生成生長因子的血管生成和腫瘤生長調節活性的有效模型。VEGF-B的治療，診斷和調節用途可利用具有改變的VEGF-B基因的轉基因動物，從模型系統中確定。尤其地，轉基因動物根據本發明可用于基于VEGF-B影響生理現象如通透性，炎癥和/或組織修復的治療方案中。另外，本發明的方法可用于評價其它多肽或小分子的類VEGF-B活性，如血管生成活性，或VEGF-B對內皮細胞基因表達具有的一種活性，如影響其基本性質例如從血流中攝取營養至特殊組織中。
轉基因動物根據本發明可用于闡明VEGF-B的發育和體內平衡功能，通過監測和對比用于野生型(+/+)，雜合子(+/-)，和無效等位基因(-/-)動物的不同生理應激結果而進行。例如，VEGF-B對血液凝血時間的作用可通過在創傷分析中使用而監測；VEGF-B對腫瘤生長的作用可通過監測植入的腫瘤細胞的增殖而確定；VEGF-B對物理活性的作用可通過對比性物理活性研究而揭示；和/或VEGF-B對應激反應的作用可通過應用一些應激如暴露于壓縮空氣中而確定。另外，VEGF-B對心率，心輸出量(如血壓)和/或血動力(heamodynamic)性的作用，可用本發明的轉基因動物如Zhou等，自然醫學4201-07(1998)所述方法進行分析。
VEGF-B在正常心臟功能中作用可通過對比VEGF-B缺陷鼠(-/-)和正常鼠(+/+)的同窩仔而研究。VEGF-B表達喪失揭示一些明顯的不同。這些不同表明缺陷的動物有房室(AV)傳導缺陷和可表明心肌局部缺血的跡象。
本發明的另一方面提供了一種篩選化合物的方法，該化合物具有調節房室傳導或局部缺血的活性。此方法包括將要篩選的化合物導入VEGF-B缺陷的非人動物中，并分析對該動物的房室傳導和局部缺血的作用。此方法還可用于篩選多于一種的具有調節房室傳導或局部缺血活性的化合物，例如當篩選噬菌體，肽或組合文庫時。可溶性肽文庫及其應用的代表見于R.A.Houghten，基因1377-11(1993)所述。隨機呈遞肽的噬菌體文庫例如Barry等，自然醫學2299-305(1996)。一般的組合文庫及其應用見于K.S.Lam，抗癌藥物研究12145-167(1997)；Nefzi等，生物有機化學和藥物化學通信82273-2278(1998)；Coffen等，藥物化學研究8206-218(1998)；和Li等，現代藥物開發3105-112(1998)。
本發明另一個相關方面涉及一種治療或減輕房室傳導缺陷或局部缺血的方法，包括施用有效減輕房室傳導缺陷或局部缺血量的VEGF-B，或其具有VEGF-B生物活性的片段或類似物。
術語“類似物”或“功能類似物”指修飾形式的全長VEGF-B或其片段，其中已進行至少一個氨基酸取代，這樣所述類似物在體內和/或體外基本保持與未修飾的全長VEGF-B或其片段一樣的生物活性。
表達“VEGF-B的生物活性”是指刺激一或多種內皮細胞增殖，分化，遷移，存活或血管生成或血管通透性的能力。
用于治療或減輕房室傳導缺陷或局部缺血的VEGF-B多肽及其類似物也可與其藥物學適合的非毒性鹽，和藥物學合適的固體或液體載體或佐劑組合應用。
這種載體或佐劑例如包括但非限于鹽水，緩沖鹽水，林格式液，礦物油，滑石，玉米淀粉，明膠，乳糖，蔗糖，微晶纖維素，高嶺土，甘露糖醇，磷酸鈣，氯化鈉，藻酸，葡萄糖，水，甘油，乙醇，增稠劑，穩定劑，懸浮劑，及其組合。這種組合物可以是溶液，懸浮液，片劑，膠囊，乳狀液，藥膏，酏劑，糖漿，糊紙包藥，油膏，或其它常用形式。配方應適于施用方式。含有本發明肽的組合物含有大約0.1％-90％(重)的活性化合物，大多數為10％-30％(重)。
就肌內應用而言，無菌配方優選VEGF-B的適當的可溶的鹽形式，如鹽酸鹽，可以是溶于藥物稀釋劑中施用，所述稀釋劑如是無熱原水(蒸餾水)，生理鹽水，或5％葡萄糖液。可以制備適當的不溶形式的化合物，并在水基或藥物學合適的油基中形成懸浮液而施用，所述油基例如是長鏈脂肪酸酯如油酸乙酯。
施用劑量和途徑將依賴于病人的自然條件和治療的疾病，且要根據醫生或獸醫的意見而定。適當的施用途徑包括口服，舌下，肌內，腹膜內，或靜脈內注射，非腸道應用，局部應用，植入等。例如，將有效量的本發明的肽或抗體施用于需要其的機體，劑量為大約0.1-100mg/kg體重之間，優選1-10mg/kg體重。對治療進展，病人的副作用和循環多肽水平進行監測，將提供制定最佳劑量的另外的指導。局部施用VEGF-B或其片段或類似物的方式與施用VEGF相同。
另一種治療或減輕房室傳導缺陷或局部缺血的方法，包括施用有效量的編碼VEGF-B或其有VEGF-B生物活性的片段或類似物的核酸序列，其中所述核酸能編碼有效量的所述VEGF-B或其片段，以治療或減輕房室傳導缺陷或局部缺血。此核酸序列優選可操縱地與啟動子序列連接。
核酸可以是裸露的和/或在載體或脂質體中。本發明優選的載體是表達載體，其中本發明的核酸可操縱地結合一或多個適當的啟動子和/或其它控制序列，這樣用克隆入載體的核酸轉化或轉染適當的細胞時，細胞能表達本發明的多肽。大多數優選的載體是適于轉染進行基因治療的載體，如腺病毒載體，痘苗載體，或逆轉錄病毒載體或脂質體。本領域已知各種這種載體。
本發明另一方面提供了一種診斷測試個體中心臟疾病的方法，包括為病人做心電圖并查看PQ間期是否延長和/或ST段是否下移(或U波)。
本發明另一方面提供了一種診斷測試個體心臟疾病的方法，所述心臟疾病特征是喪失VEGF-B表達。這些方法可包括通過用聚合酶鏈反應尋找VEGF-B DNA擴增缺失或檢測特異性結合劑與VEGF-B結合缺失而尋找VEGF-B表達喪失。特異性結合劑優選是VEGF-B的抗體。最優選的抗體是VEGF-B的單克隆抗體。
本發明的抗體可用可檢測的標記進行標記。抗體可偶聯于適當的超磁性，順磁性，電子致密的，生態的(ecogenic)或放射性或非放射性制劑以顯影。放射性制劑/標記例如包括放射性原子或基團，如125I或32P。非放射性標記包括酶標記如辣根過氧化物酶，或熒光標記如異硫氰酸熒光素(FITC)。可直接或間接，共價或非共價進行標記。
附圖簡述本發明參考以下附圖將得以更進一步闡述。
圖1是產生小鼠VEGF-B基因的無效突變體的方案示意圖；圖2示出尾DNA的PCR擴增物的瓊脂糖凝膠電泳，所述尾DNA來自同窩純合子VEGF-B(+/+)，雜合子(+/-)和VEGF-B基因座的純合剔除鼠(-/-)的F2子代；圖3示出小鼠VEGF-B基因座的詳細限制性圖譜。限制酶及相應符號見以下所列；圖4示出用于產生定向于小鼠VEGF-B基因座的轉基因載體的方法圖示。以下所述的每個構建體A-E示于產生定向于小鼠VEGF-B基因座的轉基因載體的例證方法中；圖5a和5b是RNA的Northern印跡圖，RNA來自野生型(+/+)，雜合(+/-)，和剔除(-/-)小鼠的心臟和骨骼肌組織；圖6是在同窩的純合VEGF-B(+/+)和VEGF-B缺陷(-/-)小鼠中，對比移植的腫瘤的圖示；圖7A和7B是同窩的純合VEGF-B(+/+)和VEGF-B缺陷(-/-)小鼠的典型心電圖。
舉例性實施方案的詳述以下闡述和實施例是本發明實施方案和范圍的例證。本發明非限于此闡述范圍。本領域技術人員將意識到以下實施例和實施方案可用本領域已知的方法修改。例如，所述的或權利要求的核酸序列可通過已知方法改變，而不改變本發明人已示出的作用和優勢。這種變化因此包括在本發明范圍內。本領域已知的許多方法的詳細方案見于Ausubel，F.M.等編輯，分子生物學通用方法，Greene出版社和Wiley-Interscience，John Wiley&Sons，Boston，MA(1989)，及Jan于1997年的增補，后文稱為“Ausubel(1989)”，以及Sambrook，J等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.(1989)，后文稱為“Sambrook(1989)”，以及由B.Hogan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy所著的《操作小鼠胚胎實驗手冊》，冷泉港實驗室出版社，(1994)，后文稱為“Hogan(1994)”。這些文獻特別地并入參考。這些文獻利于本領域技術人員進行本發明的實施方案。
本文所用的“無效等位基因”，“無效突變”，和“無效突變體”指編碼與野生型蛋白質相比發生變化的蛋白質的基因序列。通常地，“無效突變體”是以基本不能發揮其原來功能的方式而改變。例如，VEGF-B突變體是編碼一種蛋白質的DNA序列，該蛋白質不能刺激血管內皮細胞生長，或不呈現任何上述VEGF-B的其它作用。然而，與VEGF-B的其它生物化學功能相關的結構，如肝素結合和二聚體化，可呈現于由無效等位基因編碼的蛋白質中。另外，術語“無效突變體”可以指攜帶如上述改變的蛋白質的基因序列的動物或細胞。
轉基因DNA指能導入細胞中的DNA，此DNA摻入到細胞的基因組中。此細胞能產生含有轉基因DNA的轉基因動物。通常地，轉基因DNA作為載體，轉基因載體而構建，以施用于特定的細胞中。這種載體不需要呈特殊的結構形式，如環狀形式。
重組基因或序列指已用本領域已知的許多重組DNA方法之一操作的基因或序列。
本文所用術語“修飾的VEGF-B DNA”指來自動物的一種VEGF-B核苷酸序列，所述動物已通過一或多種以下方法而修飾，如點突變，定點誘變，缺失誘變，插入誘變，得自同源重組誘變，和/或得自化學或放射性處理DNA或攜帶DNA的細胞，或其與另一種與野生型VEGF-B DNA性質不相關的DNA序列如標記序列連接的突變。修飾的VEGF-B DNA可保持一些或全部野生型VEGF-B DNA的活性，如Flt-1受體結合機制。
本文的VEGF-B基因和DNA序列非限于小鼠或人的基因或序列。任何物種的動物均可用作VEGF-B基因的來源。在摻入轉基因DNA的重組序列中，與特定胚胎細胞中的VEGF-B基因同源的序列不需是來自與胚胎細胞相同的物種。
產生轉基因動物的方法不管是何物種基本是相同的。簡而言之，轉染的細胞在胚胎能整合轉染的細胞的階段注射入胚胎中，例如在胚泡階段。接著，將胚胎再植入代理母親中，產生具有轉基因DNA的嵌合子代。因此，所需要的只是來自動物的適當的胚胎干細胞。
本領域已知各種動物的胚胎干(ES)細胞的產生方法。胚胎干細胞有許多來源，包括小鼠，大鼠，母牛，豬，羊和其它動物。例如，Joyner A.L，(1993)，基因定向實用方法，Wood，R.編輯，及Hames，B.D.，實用方法叢書，第126卷，牛津IRL出版社(特別并入參考)，闡述了產生ES細胞的方法。同樣，由B.Hogan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy所著《操作小鼠胚胎實驗手冊》，冷泉港實驗室出版社(1994)，闡述了操作小鼠胚胎的方法。另外，Couly和LeDouarin，發育108543-555(1990)，闡述了分離和操作雞和鵪鶉胚胎的方法。Kimmel和Warga，自然327234-237(1987)，闡述了分離和操作zebrafish胚胎的方法。及Ware等“飼養動物胚胎干細胞系的發育”，再生研究協會，38241(1988)揭示了適于許多物種如小鼠，牛，豬和羊的胚胎干細胞培養條件。因此，本發明可應用于其它動物如用于所特別例證的小鼠一樣。
本領域已知各種將DNA插入動物細胞的方法。例如，轉基因DNA可微注射入適當的細胞中。病毒載體可用于將DNA導入適當的細胞和這些細胞的基因組中(見例如，Tsukui等，自然生物技術14982-985(1996))。細胞也可通過轉染和電穿孔方法在體外操作(見Ausubel(1989)和Hogan(1994))。
通常地，轉基因DNA摻入細胞基因組是通過隨機整合或同源重組進行的。本領域技術人員熟知在ES細胞或其它細胞中，提高同源重組與隨機整合的相對頻率的策略，以鑒別和分離已發生同源重組的細胞(見例如Ausubel(1989)，美國專利No.5557032，和Hogan(1994))。設計轉基因DNA載體可包括將細胞序列的一些部分或同源于此細胞序列的序列摻入轉基因DNA中。該部分必須充分同源于細胞序列以使得轉基因DNA和細胞DNA體內雜交，以發生同源重組。
待插入到胚胎干細胞的轉基因DNA優選地包含5′和3′同源區。這些同源區能促進在胚胎干細胞中的同源重組。本領域技術人員已知的許多出版物討論了如何構建用于同源重組的同源區。例如，Thomas&Capechhi，細胞51503-512(1987)，Mansour等，自然317348-352(1988)，和Capecchi，美國專利5,487,992均討論了在同源重組技術中設計同源區的策略。因此，設計用于同源重組的序列的方法是本領域已知的。
但是，同源重組不是在已引入轉基因DNA的每一細胞中發生。另外，經常的情況是在細胞中存在超過一個拷貝的希望經同源重組改變或替換的細胞DNA序列，如在具有一個以上等位基因的基因的情況下。因此，通過同源重組，一些細胞可僅在一個細胞內序列中摻入轉基因DNA，而其它細胞將使轉基因DNA摻入一個以上細胞內序列，或者甚至摻入每個細胞內序列中。因此，純合子和雜合子動物均可產自用轉基因DNA進行同源重組的ES細胞。純合子動物可與野生型動物交配以產生與所述轉基因雜合的進一步的轉基因動物。實施例為分析VEGF-B在正常和疾病狀態下，在體內血管發育和維持中的作用，產生攜帶突變VEGF-B等位基因的小鼠。小鼠中的一個VEGF-B等位基因通過同源重組方法功能性地失活。產生自這些細胞的小鼠因此攜帶一個突變的和一個野生型的VEGF-B等位基因。
圖1由四部分組成，1A-1D，是代表以下產生小鼠VEGF-B基因的無效突變的方法的圖示。圖1A是小鼠VEGF-B基因的外顯子-內含子組構的示意圖。圖1B是VEGF-B基因座的限制圖譜，其中表明了許多限制酶的切割位點。在圖中，限制酶如下表示N＝NotI；S＝SpeI；K＝KpnI；H＝HindIII；和E＝EcoRI。在后文所述的轉基因DNA構建體中除去的SpeI-KpnI片段，以實心框表示。圖1C的轉基因DNA構建體用于產生突變VEGF-B等位基因。此構建體含有VEGF-B基因的5’同源片段(NotI/平端的SpeI)，和3’同源片段(平端的KpnI/HindIII)，它們位于pPGK-新霉素盒(neo)的兩側。圖1D示出在Southern印跡分析中，用于鑒別VEGF-B的野生型和突變等位基因的DNA探針的位置。
在圖2中，來自新霉素盒(neo)的擴增的野生型條帶(wt)和擴增的條帶的遷移示于右側。
在下述段落中，描述了產生攜帶突變的VEGF-B等位基因的動物的詳細過程，以及得到的小鼠表型的初步分析。實施例1可用作轉基因的VEGF-B序列的選擇用于產生轉基因動物的DNA可以含有多個不同的DNA序列。合適的序列的選擇取決于是希望的效果。例如，如果希望獲得攜帶VEGF-B的無效突變體的動物，轉基因DNA含有編碼不具有VEGF-B的主要功能即血管內皮細胞促分裂原的蛋白質的序列。盡管可使用確定突變的代表的促分裂原活性的分析，但是也可使用VEGF-B基因的結構信息以精確推導特定突變方案的效果。
在本實施例中，缺失了VEGF-B小鼠基因的一部分。缺失的部分含有對于二硫鍵結合重要的8個半胱氨酸殘基中的7個。如上所述，VEGF-B是生長因子PDGF家族的成員。由于這一家族的成員是結構上相關的，其它PDGF家族成員的突變的效果可外推指示對VEGF-B的效果。因此，產生特定效果的VEGF中的突變可類似地在VEGF-B中產生相同或相似的效果。類似地，PDGF家族中其它成員的突變可用于產生VEGF-B基因中的突變。當所有家族成員或甚至家族的一個其它成員的結構信息指示出與比活效果的保守結構時尤其如此。考慮到這些，產生一無效突變體，其中8個半胱氨酸殘基中的7個殘基缺失。由于從關于PDGF家族的數據中已知半胱氨酸殘基參與二硫鍵結合和二聚體化，缺失7個半胱氨酸殘基可推定產生無功能的突變體VEGF-B蛋白。在下文進一步闡述了關于本發明所用轉基因DNA中的序列的選擇。
為選擇在本發明中修飾的DNA序列，小鼠VEGF-B的基因首先用pcif-2作探針，克隆自小鼠λFIXII文庫(Stratagene La Jolla，CA)。此方法的詳細闡述見于Olofsson等，生物化學雜志27119310-19317(1996)所述(特別并入參考)。分離并定性3個均攜帶大約20kb小鼠基因組DNA的λ克隆10，11，和12。此基因組DNA的詳細限制圖譜是通過用不同的限制酶消化λDNA，接著通過Southern印跡鑒別限制的片段而產生的。得自小鼠cDNA克隆的序列的各種32P標記的寡核苷酸探針用于Southern印跡分析中。
得自含有VEGF-B基因的λDNA的限制圖譜的信息用于選擇進行轉基因的DNA。根據轉基因動物的性質，特征，基因型或表型選擇DNA。可需要各種性質，特征，基因型或表型。例如，一種動物，其中VEGF-B DNA已與標記序列連接，如與本領域已知的β-半乳糖苷酶，綠熒光蛋白或熒光素酶或其它標記連接，可以是確定表達的VEGF-B蛋白的位置的分析所需的。其中VEGF-B DNA可操縱地與高度可誘導的啟動子或在哺乳動物組織中驅動表達的啟動子連接這樣的動物可以是從動物中獲得VEGF-B蛋白的目的所需的。所用的啟動子或表達系統是本領域已知的。另外，突變VEGF-B序列可操縱地插入轉基因動物后，可提供用于確定血管生成或腫瘤發育的分子基礎的研究動物。
在一個轉基因方案中，希望VEGF-B基因的無效等位基因。無效等位基因的基因產物在VEGF-B的血管生成性質方面是無功能的。具有VEGF-B無效等位基因的動物可用于各種分析中以鑒別例如在動物中實現血管生成的化合物。
產生無效等位基因的一種方法包括缺失或修飾DNA序列以防止分子內或分子間二硫鍵的形成，或分子內和分子間二硫鍵的形成。具體地，編碼已知或據信參與二硫鍵的半胱氨酸殘基的區域被缺失。或者，通過本領域已知的點突變或定點誘變程序突變各個半胱氨酸殘基。但是，無效等位基因也可通過許多其它方式產生。從VEGF-B的限制圖譜，例如，可選擇方便的限制位點以產生缺失突變體。
原則上，有許多產生無效突變的方式，包括但不限于(i)缺失完整基因；(ii)缺失關鍵的蛋白編碼序列；和(iii)缺失轉錄調控序列。如果突變影響剪接、mRNA穩定性等，無效突變也可發生。另外，改變讀框或引入提前終止密碼子的插入或取代也可導致無效突變。
從圖1所示限制圖譜可看出，一種產生定向的轉基因構建體的方式是通過缺失限制片段而進行的，其將在VEGF-B基因中產生無效突變。將PTKneo插入外顯子1的“B”位點中也可產生無效突變。從圖3所示更詳細的限制圖譜中，可設計其它策略。例如，也可設計缺失外顯子1，2，3，4或5任一個，及缺失一個以上外顯子組合。
另一種產生無效突變體的方法包括缺失參與受體結合的那些區域。就PDGF和VEGF而言，存在關于受體結合的結構信息并為本領域所知。可利用此信息缺失VEGF-B的相關部分，以產生無效等位基因。同樣，與受體Flt-1結合的VEGF-B及鑒別與受體Flt-1結合的VEGF-B類似物的方法，見于同時在審的美國專利申請系列號08/994540所揭示，這些文獻特別地并入參考。此信息也可用于產生VEGF-B的無效等位基因。
如上所述，本領域技術人員將意識到本領域已知的許多方法可用于設計VEGF-B的無效等位基因。因此，本發明非限于所例證的產生攜帶VEGF-B無效等位基因的轉基因動物所進行的缺失。實施例2產生攜帶VEGF-B缺失突變體的轉基因載體在本發明的一個實施方案中，VEGF-B的氨基端結構域中的8個半胱氨酸殘基缺失7個。這種缺失破壞了用于成熟VEGF-B分子共價二聚體化的三個分子內二硫鍵以及兩個分子間二硫鍵。為此，缺失330bp SpeI-KpnI片段，這一片段含有VEGF-B基因的外顯子3的一部分以及外顯子4的全部。具體地，由外顯子3的3′部分編碼的33個氨基酸和由外顯子4編碼的所有24個氨基酸缺失。從這一定向等位基因產生的VEGF-B蛋白無功能，因為其缺少這些關鍵氨基酸，該等位基因是無效等位基因。
用于產生缺少VEGF-B的SpeI/KpnI片段的重組轉基因載體的起始材料是亞克隆進質粒pBluescriptTM(Stratagene)的來自λ-克隆10的10kb NotI/HindIII片段(構建體A)，和克隆進pBluescript的1.7kbpPGK-neo盒(Sibilia，M.，科學269234-238(1995))(構建體B)。
用KpnI消化來自構建體A的10kb VEGF-B片段，用T4聚合酶從KpnI粘末端產生平末端，最后用HindIII酶切，而分離用于產生轉基因載體的3′區的1.2kb KpnI/HindIII片段。這一片段和所有后續的片段均是在制備于1×TBE(Tris硼酸鹽EDTA)緩沖液中的低熔點(LGT)瓊脂糖凝膠上分離。分離的1.2kb片段隨后連接進EcoRV和HindIII消化的pBluescript載體，產生構建體C。
轉基因載體的5′片段通過用NotI/SpeI酶切從構建體A分離。分離的片段然后連接進NotI/SpeI酶切的構建體C，產生構建體D。
pPGK-neo盒是通過用NotI/HindIII消化構建體B，并用Klenow片段產生平端而分離的。所得片段凝膠純化，接著連接于用EcoRV消化并用Klenow片段產生平端的構建體D中，產生構建體E。選擇具有正向插入的pPGK-neo盒的11.2kb的載體，作為轉基因的定向載體。構建體A-E的圖示見于圖4。
Southern印跡分析用于確定野生型和突變等位基因之間的相同性。基因組DNA用EcoRI消化并制備以進行印跡。在上述篩選步驟中用作探針的450bp放射標記的片段，主要涵蓋了VEGF-B cDNA的外顯子7編碼序列和3’未翻譯區的序列。此探針是用克隆10的DNA作模板，通過PCR產生的。PCR中使用的引物是5’-GTGAAGCTCCAGCCGAGCA(有義鏈)(SEQ ID NO1)，和5’TAGTGTCTTCCATCTCTTT(反義鏈)(SEQ ID NO2)。在這些條件下，突變等位基因產生6.5kb的基因組EcoRI限制片段，而野生型等位基因產生大于20kb的片段。實施例3將轉基因載體插入動物細胞中含有突變VEGF-B的載體(構建體E)，通過電穿孔轉染入衍生自129/SW小鼠的E14.1細胞(Kuhn，R.等，科學254707-710(1991))中。通過標準方法分離新霉素抗性克隆并定性。由B.Hougan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy編輯的《操作小鼠胚胎實驗手冊》，冷泉港實驗室出版社(1994)，描述了用于分離和操作胚胎的程序(特別引入本文作參考)。分離來自幾百個克隆的基因組DNA，EcoRI消化，并用Southern印跡分析。用這些程序通過檢測6.5kb條帶和野生型20kb條帶鑒別了3個陽性克隆1a，8f和9h。對于克隆1a和9h用放射標記的PKG-neo盒探查Southern印跡也給出預期的6.5kb條帶。這些數據顯示在ES細胞中的兩個VEGF-B等位基因中的一個等位基因已由所述構建體正確定向，且含有VEGF-B無效等位基因的ES細胞已產生。實施例4產生轉基因動物將來自細胞系9h的細胞用標準程序注射進小鼠胚泡中。由B.Hougan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy編輯的《操作小鼠胚胎實驗手冊》，冷泉港實驗室出版社(1994)，描述了注射細胞的程序(特別引入本文作參考)。將胚泡植入假孕代理母親中。所產生的嵌合小鼠即具有轉基因DNA的小鼠通過子代皮毛顏色鑒別。
例如，由于ES細胞衍生自具有chincilla(黃白色)皮毛和攜帶Agouti基因座的129/SW小鼠，而宿主胚泡衍生自具有黑色皮毛和缺少Agouti基因座的C57B1/6小鼠，所以嵌合小鼠將是Chincilla(僅由ES細胞導致的皮膚塊)，黑色(僅由宿主細胞導致的皮膚塊)和褐色或Agouti(有129/SW和C57B1/6細胞混合物存在的皮膚塊)。由于從129/SW細胞分泌的Agouti蛋白將刺激C57B1/6毛囊細胞加工黑色素(黑色色素)，由此毛發變為褐色，因此嵌合動物是褐色的。
將雄性嵌合小鼠與C57B1/6野生型雌鼠交配。這些雌鼠的子代中存在褐色鼠，表明轉基因DNA的種系傳遞。
對制備自這些F1鼠尾的DNA進行如上述Southern印跡分析。通常地，通過外科手術取0.5cm的尾部組織，并用于制備DNA樣品。在50％的褐色鼠中存在6.5kb的EcoRI片段，表明無針對VEGF-B的定向無效等位基因的選擇。攜帶定向的VEGF-B基因座的F1小鼠是雜合子，因為它們也攜帶VEGF-B的野生型等位基因。攜帶一個失活的VEGF-B等位基因的F1小鼠正常發育，示出VEGF-B的基因劑量對存活不是關鍵的。
雜交雜合子F1小鼠，并通過Southern印跡和PCR分析子代的尾部DNA。用兩種方法獲得的結果是相同的，現提供PCR基因分型方法的詳細情況。用F2子代的尾DNA作模板，在標準條件下進行PCR擴增。用位于外顯子3和外顯子4的兩個引物，鑒別野生型等位基因存在316bp的擴增條帶。這些引物分別是5’-GCCCAGCTGTGTGACTGT(正向)(SEQ ID NO3)，和5’-CCCACCCCATGCTACACT(反向)(SEQ ID NO4)。用位于新霉素抗性基因中的兩個引物，鑒別定向等位基因具有140bp的條帶。這些引物分別是5’-TGTTCTCCTCTTCCTCATCTCC(正向)(SEQID NO5)，和5’-ATTGTCTGTTGTGCCCAGTC(反向)(SEQ IDNO6)。圖2中總結了來自PCR擴增的結果。分析顯示VEGF-B的定向等位基因純合的小鼠是存活的，且分析大量的F2代動物得出野生型、雜合子和攜帶無效等位基因的純合動物的比率為1∶2∶1。因此，無效等位基因以經典孟德爾方式遺傳。
對成年VEGF-B剔除小鼠的首次外部觀察未揭示與野生型小鼠相比有任何大的形態學改變。但是，觀察到某些轉基因VEGF-B突變小鼠的心臟似乎畸形(malform)。這些心臟的大小通常比野生型小，且較大的血管似乎更粗。這些表型表明VEGF-B剔除小鼠可用作模型篩選化合物對心臟組織生長或發育的效果。實施例5在細胞或組織樣品中檢測VEGF-B核酸細胞或組織樣品可通過本領域已知的許多常規方法獲得。通常，離心的細胞沉淀或組織樣品應立即冷凍。用異硫氰酸胍方法(Chomczynski等，分析生物化學，162156-159(1987))分離總RNA。用0.2μg隨機六脫氧核苷酸引物、5單位小鼠反轉錄酶、作為模板的5μg總RNA和第一鏈cDNA合成試劑盒(Pharmacia)合成cDNA。在37℃保溫1小時后，反應混合物貯存于-70℃。PCR擴增的陰性對照樣品類似地制備，只是不加反轉錄酶。作為內標也測試β-肌動蛋白，因為其以組成性高水平表達，且其表達在不同細胞中不顯示太大的差異。
就PCR擴增而言，引物序列選自VEGF-B和β-肌動蛋白基因，序列如下VEGF-B有義5’-GCCATGTGTCACCTTCGCAG-3’(SEQID NO7)VEGF-B反義5’-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC-3’(SEQ ID NO8)β-肌動蛋白有義5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’(SEQ ID NO9)β-肌動蛋白反義5’-GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3’(SEQ ID NO10)(β-肌動蛋白序列包含來自Ng等，分子細胞生物學52720-732(1985)所述的2105-2125位和2411-2432位核苷酸)。將取自cDNA反應產物的4μl等份加熱至94℃5分鐘，并用作模板，用20pmole引物，10×PCR緩沖液，1μl的20mM dNTP和2.5U的Taq聚合酶進行PCR。終體積用DEPC處理的水調整為100μl。在95℃變性1分鐘，在62℃退火45秒，在72℃聚合50秒，VEGF-B進行35次循環，β-肌動蛋白進行25次循環。在每5次循環之后，取15μl等分進行分析。
5μl的PCR反應混合物電泳是在含有溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠中進行的。大小標記DNA片段的范圍在24-726個堿基對之間(Promega，Madison，WI，USA的ΦX174DNA/HinfI標記)。實施例6來自轉基因動物的細胞和組織的應用如上所述，VEGF-B剔除小鼠的心臟比野生型的小，提示該動物在心臟細胞生長分析、心率分析、心輸出量分析或其它血液動力學性質分析中實用性。在篩選分析中的其它應用是本領域技術人員能意識到的。
為了在這些篩選方法中應用轉基因動物的細胞和組織，可利用含有至少一個衍生自轉基因動物的細胞的轉基因動物細胞或組織培養物。將細胞作為外植體培養，或通過機械分散而分離并作為原代培養物培養。或者，通過本領域已知的轉化方法或通過首先將轉基因小鼠與例如Jat等，PNAS USA 885096-5100(1991)描述的H-2KtsA58小鼠雜交或本領域已知的其它相關方法(例如見McClean，J.S.，Tibtech 11232(1993))將細胞轉化為細胞系。以此方式，剔除突變體與H-2KbtsA58轉基因小鼠雜交將產生各種細胞的條件永生細胞系。具體地，細胞首先在ts(溫度敏感)A58 T-抗原允許的溫度下生長，從而細胞可培養許多代。T-抗原永生化細胞。當細胞轉至失活T-抗原活性的不允許溫度時，細胞分化，由此可產生來自不同組織的許多不同的細胞系。實施例7血管生成性和/或腫瘤生長調節活性分析可使用也含有應答細胞的組織樣品，如來自VEGF-B剔除小鼠的心臟外植體測試VEGF-B類似物。組織樣品或外植體保持在本領域已知的溶液中。向組織樣品或外植體中加入化合物如VEGF-B類似物或小分子，并分析對組織樣品或外植體的作用。以此方式，生理作用如血管生成性，抑制或促進腫瘤生長，增加肌結構，或與VEGF-B相關的其它作用可被分析。本領域技術人員可根據已知方法例如Ausubel(1989)和Hogan(1994)所述方法，設計特殊的實施方案。實施例8評價VEGF-B轉錄物的表達心臟和骨骼肌中VEGF-B轉錄物的表達，在野生型小鼠(+/+)，雜合小鼠(+/-)，和純合剔除小鼠(-/-)中通過Northern印跡而評價。處死VEGF-B缺陷的小鼠和野生型C57B1/6小鼠，將不同的組織立即冷凍并貯存在-80℃直至使用。用硫氰酸胍/酸性苯酚方法制備總細胞RNA(見Chomczynski等，分析生物化學162156-159(1987))。1％瓊脂糖凝膠中的每條泳道使用每個樣品的20μgRNA，在80V電泳大約3小時。接著將凝膠移至尼龍膜(HybondTM-N+，Amersham)上，隨后通過UV交聯。在5×SSC，5×Denhardt溶液，0.5％SDS，和100μg/ml單鏈DNA中進行預雜交2小時，接著用特異的探針根據廠商指導(Amersham)在65℃雜交過夜。
使用的兩個探針是(a)全長小鼠VEGF-B cDNA，和(b)覆蓋無效等位基因中VEGF-B基因缺失部分的探針。一個1.8kb的VEGF-B167cDNA片段用于產生第一個探針，使用隨機標記試劑盒(Amersham)根據推薦方案進行。Northern分析中使用的第二個探針用在VEGF-B外顯子3和4內的148bp片段產生，該片段用無效等位基因/定向載體最高的Neo基因置換并經PCR方法標記(見Konat等，PCR技術，pp37-42，Griffin編輯，CRC出版社，Boca Raton(1994))。在標記PCR中使用Taq聚合酶和32P-dCTP，循環條件為94℃1分鐘，58℃2分鐘，72℃3分鐘，共30個循環。
洗滌后，膜用X-光膠片曝光2-6天。膜在煮沸的0.5％SDS中洗滌，并在磷成象器曝光過夜以保證完整的洗滌。圖5a示出用全長小鼠VEGF-B cDNA探針的Northern印跡結果。圖5b示出來自覆蓋無效等位基因中缺失的VEGF-B部分的探針的結果。
結果示出，兩個探針均與得自+/+小鼠的高豐度1.4kb VEGF-BmRNA雜交，且也檢測到2個另外的豐度較低的轉錄物。這兩個次要轉錄物分別為3.0kb和6kb長。在+/-小鼠中獲得明顯降低的雜交信號，而在得自-/-小鼠的RNA樣品中兩個探針均未檢測到任何VEGF-B轉錄物。這表明定向的VEGF-B等位基因已被剔除且產生無效等位基因，-/-小鼠不合成VEGF-B蛋白。在雜合子中VEGF-B轉錄物的水平降低還表明保留的完整VEGF-B等位基因的轉錄不是補償性上調的。實施例9腫瘤移植及測量因為已知腫瘤生長和轉移依賴于腫瘤組織的新血管化，在同窩的野生型(+/+)和VEGF-B缺陷(-/-)小鼠中研究移植腫瘤的生長。雄性VEGF-B缺陷(-/-)小鼠和同窩純合C57B1/6小鼠(+/+)用于測試。真皮內注射小鼠T241纖維肉瘤細胞。在植入腫瘤細胞前用甲氧基氟烷麻醉6-8周齡小鼠，隨后將1×106個生長至對數期的T241小鼠纖維肉瘤細胞懸浮于100微升PBS中，并皮下植入每個小鼠的背部中線。測量每只動物中的腫瘤生長。用測徑器每隔一天觀測腫瘤大小。腫瘤體積用以下公式計算寬度2×長度×0.52(見Boehm等，自然390404-407(1997))。
結果示于圖6。從圖中可以看出在-/-動物中腫瘤的生長明顯低于+/+動物。示出在指數生長階段之前的初始階段，在突變體動物中較長(+/+動物18-20天，-/-動物30-32天)。此結果表明VEGF-B也許通過影響腫瘤基質從而影響腫瘤血管生成。此論斷可根據腫瘤細胞也許表達內源VEGF-B，同時在突變體動物中觀測到此作用而得出。
此結果可歸因于對內皮細胞生長的直接作用，或非直接作用如遷移，胞外基質的降解等。在每種情況下，結果示出VEGF-B具有促進腫瘤生長作用并表明抗腫瘤方案可在例如通過用與VEGFR-1結合的抗VEGF-B的單克隆抗體或通過與VEGFR-1結合的小分子，或通過抗VEGF-B療法，或通過上述兩種或多種方法的組合抑制VEGF-B作用的基礎上設計。實施例10來自正常和VEGF-B缺陷小鼠的心臟組織的組織學檢查來自正常和VEGF-B缺陷小鼠的心臟組織切片的組織學檢查未揭示有大的差異。另外突變動物的心肌橫斷面的毛細血管密度也正常。這提示VEGF-B在控制心肌血管化的血管生成過程中可能不起關鍵作用。實施例11在VEGF-B缺陷動物中分析血管生成因子的表達用放射標記的cRNA探針經RNAse保護分析對來自正常和VEGF-B缺陷小鼠的心臟中基因表達的分析揭示，所研究的大多數基因在突變動物中正常表達。正常表達的基因包括VEGF、PIGF、PDGF A、PDGF受體a和b、VEGF受體1和2、neuropilin 1、Tie 1受體、尿激酶纖溶酶原激活物、纖溶酶原激活物抑制劑1和血小板內皮細胞粘附分子的基因。在突變動物中的表達被改變的唯一基因是PDGF B(下降約30％，p＞0.05)。目前尚不清楚PDGF B的表達改變的意義。實施例12VEGF-B缺陷小鼠中的心臟異常為研究VEGF-B在正常心臟功能中的作用，用遙測系統(DATA Science，St.Paul，MN，USA)比較VEGF-B缺陷小鼠和正常同窩仔以尋找心臟異常。遙測系統由植入式發射器(TA10ETA-F20)，遙感接收器(RA1010)，和轉播來自遙感接收器的信息的鞏固基質(BCM100)組成。為記錄心電圖(ECGs)和其它參數，將發生器植入動物的腹部。將兩個電極分別置于接近心尖，和右肩皮下。數據獲得系統由數據翻譯(DT2801)AD轉換器和計算機程序PC-LAB v.5.0(Axenborg和Hirsch，Comp，Meth.Progr.Biomed.4155-67(1993))組成。獲得的數據用Excel宏程序進一步分析，數據表示為每分鐘自發活動計數，體溫和每分鐘的心率。心電圖用于研究心臟節律。用計算機程序PC-LAB v.5.0，從平均心電圖中以毫秒計算PQ，QRS和QT間期。使用的是Johansson和Thoren，Acta Physiol.Scand.160133-138(1997)所述的方法，在此特別并入參考。
對正常小鼠(+/+)和VEGF-B缺陷小鼠的平均心電圖進行分析顯示出一些明顯不同。結果示于圖7。
-/-動物的PQ間期與+/+動物相比延長(見表139.7ms對35.7ms，p＞0.05)。這表明缺陷的動物具有房室(AV)傳導缺陷。此原因還未清楚，但人體內AV傳導降低可以是由AV束狀纖維局部缺血，由于疤痕組織壓迫AV束，或心臟鈣化，AV束或AV結合纖維炎癥，或由于迷走神經極端刺激心臟所致。
盡管QRS復波顯示是正常的，但小鼠中的U波顯示有輕度下移的異常。U波輕度下移可能是局部缺血的指示，因為在人中觀察到的相應ST復波的類似下移可表示心肌缺血。U波的面積和振幅如表1所示并在圖7A和7B中示出。在-/-小鼠中U波下移由圖7B的陰影區表示，這表明-/-動物中的另一異常。在人中，ST復波的下移是心肌局部缺血的指示。在大多數情況下，局部缺血有冠狀循環不足導致。-/-動物的心率和體溫均正常。表1 來自正常(+/+，n＝4)和VEGF-B缺陷(-/-，n＝4)動物的ECG測量的一些數據基因型+/+ -/-p值PQ間隔 35.7ms 39.7ms 0.014U面積(a.u.1) 4.31 9.62 -U振幅(a.u.1) -0.013 -0.034 -1a.u.任意單位；ms毫秒；對于U面積和振幅，示出的是不同組的平均值上述描述和實施例僅為了舉例示出而非限制本發明。因為本領域技術人員理解在本發明精神和實質內可對所公開的實施方案進行修改，因此本發明應被理解為包括在所附權利要求書及其等價物范圍內的任何事情。
權利要求
1.一種篩選具有調節心房與心室傳導活性的化合物的方法，所述方法包括將所述化合物導入VEGF-B缺陷的非人動物中，并分析在所述動物體內對房室傳導的作用。
2.一種篩選具有調節局部缺血活性的化合物的方法，所述方法包括將所述化合物導入VEGF-B缺陷的非人動物中，并分析在所述動物體內對局部缺血的作用。
3.一種治療或減輕哺乳動物房室傳導缺陷的方法，包括給予減輕房室傳導缺陷有效量的VEGF-B，或其具有VEGF-B生物活性的片段或類似物。
4.一種治療或減輕哺乳動物局部缺血的方法，包括給予減輕局部缺血有效量的VEGF-B，或其具有VEGF-B生物活性的片段或類似物。
5.一種治療或減輕哺乳動物房室傳導缺陷或局部缺血的方法，包括給予有效量的編碼VEGF-B或其有VEGF-B生物活性的片段或類似物的核酸序列，其中所述核酸能編碼有效量的所述VEGF-B，或其片段或類似物，以治療或減輕房室傳導缺陷或局部缺血。
6.權利要求5的方法，其中所述核酸序列可操縱地與一啟動子序列連接。
7.權利要求5的方法，其中所述核酸序列克隆入載體中并可操縱地與一啟動子序列連接。
8.權利要求7的方法，其中載體是表達載體。
9.權利要求8的方法，其中表達載體選自基于腺病毒，痘苗病毒或逆轉錄病毒的載體。
10.一種在測試個體中診斷特征在于喪失VEGF-B表達的心臟疾病的方法，包括以下步驟提供來自所述測試個體的第一個DNA樣品；提供含有VEGF-B DNA的第二個DNA樣品；將第一個DNA樣品與一系列特異于VEGF-B DNA的引物接觸，所述引物可操作地偶聯于聚合酶；將第二個DNA樣品與一系列特異于VEGF-B DNA的引物接觸，所述引物可操作地偶聯于聚合酶；用第一個和第二個DNA樣品進行聚合酶鏈反應；及對比第一個和第二個DNA樣品的聚合酶鏈反應，以確定在所述第一個DNA樣品中VEGF-B DNA擴增的缺失。
11.一種在測試個體中診斷特征在于喪失VEGF-B表達的心臟疾病的方法，包括以下步驟提供來自所述測試個體的生物樣品；將所述樣品與VEGF-B的特異結合試劑接觸；及檢測所述特異結合試劑結合的喪失。
12.權利要求11的方法，其中特異結合試劑包括VEGF-B的抗體。
13.一種診斷測試個體心臟中VEGF-B缺陷的方法，所述方法包括為所述測試個體作心電圖；并與正常心電圖相比較，評測所作心電圖的PQ間期延長，或ST復波下移。
14.一種檢測測試個體心臟中VEGF-B缺陷的方法，所述方法包括為所述測試個體作心電圖；并與正常心電圖相比較，評測所作心電圖的PQ間期延長，或ST復波下移。
全文摘要
VEGF－B缺陷動物顯示出似乎由房室(AV)傳導缺陷以及心肌局部缺血導致的心臟異常。本發明提供了用VEGF－B缺陷的非人類動物篩選具有調節房室傳導或局部缺血活性的化合物,用于治療或減輕房室傳導缺陷或局部缺血,以及用于診斷心臟病。
文檔編號G01N33/566GK1342264SQ00804556
公開日2002年3月27日 申請日期2000年3月3日 優先權日1999年3月3日
發明者卡琳·奧瑟, 彼得·托倫, 烏爾夫·埃里克松 申請人:路德維格癌癥研究所