專利名稱：精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外診斷試劑類，具體適用于檢測(cè)精漿檸檬酸含量。
背景技術(shù)：
精漿檸檬酸來(lái)自前列腺，其作用是絡(luò)合鈣離子，通過(guò)與鈣離子結(jié)合，而調(diào)節(jié)精漿鈣離子濃度。精漿檸檬酸既影響射精后精液液化功能，又參與維持精漿滲透壓，對(duì)精子活力及透明質(zhì)酸酶的活性也起重要作用。研究表明，精漿檸檬酸含量還與睪酮水平相關(guān)，因此精漿檸檬酸含量是幫助判斷雄激素分泌狀態(tài)及評(píng)價(jià)前列腺功能的重要指標(biāo)。
目前，精漿檸檬酸測(cè)定主要有吡啶顯色法和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的酶法。吡啶顯色法方法學(xué)存在缺陷，特異性不夠；WHO推薦的酶法方法學(xué)特異，準(zhǔn)確性好，但其檢測(cè)線性范圍不夠?qū)挘以噭┙M成復(fù)雜穩(wěn)定性差，精漿標(biāo)本需去蛋白處理，不便于手工操作，同時(shí)WHO推薦的酶法需要用到三種工具酶，對(duì)反應(yīng)的干擾較大。
精漿檸檬酸是評(píng)價(jià)前列腺功能的常用指標(biāo)，因此建立一種特異、靈敏、操作簡(jiǎn)單的方法學(xué)顯得特點(diǎn)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明意在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性好、方法學(xué)指標(biāo)優(yōu)、操作簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定、貯存期長(zhǎng)、可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化/手工雙選擇操作的精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，包括保護(hù)液、緩沖液、含有檸檬酸的水溶液標(biāo)準(zhǔn)品和含有苯駢咪唑的水溶液，所述保護(hù)液是含有檸檬酸裂解酶的酶保護(hù)液，所述水溶液中苯駢咪唑含量?jī)?yōu)選0.1～1.0％，所述酶保護(hù)液中檸檬酸裂解酶的含量?jī)?yōu)選2000～8000U/L。。
所述保護(hù)液由檸檬酸裂解酶和酶保護(hù)液組成。
所述緩沖液中還包括防腐劑，所述標(biāo)準(zhǔn)品中還包括防腐劑。
還包括溶解液，所述酶保護(hù)液為凍干粉，溶解液用于溶解酶保護(hù)液凍干粉。
由于上述技術(shù)方案，結(jié)合下面將要詳述的實(shí)施例，本發(fā)明突出的技術(shù)效果在于采用苯駢咪唑和檸檬酸裂解酶，大大加快了反應(yīng)速度；只有酶保護(hù)液中的檸檬酸裂解酶能催化標(biāo)準(zhǔn)品中的檸檬酸生成能與苯駢咪唑反應(yīng)的物質(zhì)—丙酮，因此定量檢測(cè)的精漿檸檬酸含量只與酶保護(hù)液中的檸檬酸裂解酶有關(guān)，只需用到傳統(tǒng)酶保護(hù)液中的一種工具酶—檸檬酸裂解酶，排除了保護(hù)液中其他酶的干擾因素小，相對(duì)WHO推薦的酶法(需用到三種酶)，方法更特異，方法學(xué)指標(biāo)更優(yōu)；樣本無(wú)需去蛋白處理，使得整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程操作更簡(jiǎn)單，同時(shí)檢測(cè)既可以采用原有的自動(dòng)化檢測(cè)方法，又可以采用手工檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化/手工雙選擇，使得人們?cè)跈z測(cè)方法上有更大的選擇性；由于手工操作對(duì)操作環(huán)境及儀器的限定更小，實(shí)用性更強(qiáng)，更適于臨床常規(guī)檢測(cè)的開(kāi)展；將酶保護(hù)液凍干，并采用了防腐劑，試劑穩(wěn)定，2～8℃保存貯存期可達(dá)一年。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)具體的實(shí)施例并結(jié)合附圖
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
實(shí)施例，一種精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，包括如下成分A液含苯駢咪唑的水溶液，每100mlA液中含苯駢咪唑0.25毫升；B液(凍干粉)含檸檬酸裂解酶的酶保護(hù)液凍干粉，每100ml酶保護(hù)液中含檸檬酸裂解酶470U；凍干粉溶解液含葡萄糖、氯化鈉和酪蛋白的水溶液，每1000ml凍干粉溶解液中含葡萄糖10克、氯化鈉30mmol、酪蛋白2克；緩沖液含疊氮鈉、硫酸鎂(MgSO4)和三羥甲基氨基甲烷(Bis-Tris)90mmol的水溶液，每1000ml緩沖液中含疊氮鈉0.2g、MgSO40.1mmol、Bis-Tris 90mmol；標(biāo)準(zhǔn)品含疊氮鈉和檸檬酸的水溶液，每1000ml標(biāo)準(zhǔn)品中含疊氮鈉0.2g、檸檬酸2mmol。
上述精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑各成分采用如下步驟制得A、A液的制作工藝方法1)取苯駢咪唑0.25毫升，加蒸餾水至100毫升，充分溶解后，置4℃保存；B、B液(凍干粉)的制作工藝方法2)稱取檸檬酸裂解酶470U，加酶保護(hù)液100ml，充分溶解，分裝凍干。置4℃保存；C、緩沖液的制作工藝方法3)稱取Bis-Tris90mmol、MgSO40.1mmol，疊氮鈉0.2g，置燒杯內(nèi)，加蒸餾水800毫升，攪拌充分溶解，4)調(diào)pH至9.2，定容至1000ml，置4℃保存；D、標(biāo)準(zhǔn)品(2μmol/ml)的制作工藝方法5)稱取2mmol檸檬酸、0.2g疊氮鈉溶于1000ml蒸餾水中，置4℃保存；E、凍干粉溶解液的制作工藝方法6)稱取葡萄糖10克，氯化鈉30mmol，酪蛋白2克，溶于800毫升蒸餾水中，7)用蒸餾水定容至1000毫升。置4℃保存。
上述實(shí)施例中，A液是苯駢咪唑含量為0.1～1.0％的水溶液，苯駢咪唑用于與檸檬酸被檸檬酸裂解酶作用后的產(chǎn)物-酮酸結(jié)合，形成在330nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰的化合物，當(dāng)苯駢咪唑的含量低于0.1％時(shí)，由于反應(yīng)不與檸檬酸含量成正比，而無(wú)法進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)苯駢咪唑的含量高于1.0％時(shí)，反應(yīng)速度不再快速增加，只是增加成本；B液凍干粉是檸檬酸裂解酶含量為2000～8000U/L的酶保護(hù)液凍干粉，一般而言，精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑的酶保護(hù)液中，檸檬酸裂解酶的含量的下限為2000U/L，為控制成本，檸檬酸裂解酶的含量的上限為8000U/L，在2000～8000U/L的范圍內(nèi)，檸檬酸裂解酶的含量越高，催化反應(yīng)到終點(diǎn)的速度越快；凍干粉溶解液是葡萄糖含量為0.2～2.0％、氯化鈉含量為10～100mM、酪蛋白含量為0.1～1.0％的水溶液，其中葡萄糖還可以用其他的單糖來(lái)替換，氯化鈉還可以用其余可溶性含氯的無(wú)機(jī)鹽替換，凍干粉溶解液也可以采用其他常見(jiàn)的酶保護(hù)液凍干粉溶解液；緩沖液是疊氮鈉含量為0.01～0.1％、MgSO4含量為0.02～0.2mmol/L的Tris緩沖液，其中疊氮鈉還可以用其他的防腐劑替換，MgSO4用于提供測(cè)定中所需的陽(yáng)性離子-鎂，加快酶促反應(yīng)的速度，還可以用別的可溶性鎂鹽替換，緩沖液也可以采用別的酶促反應(yīng)中的緩沖液替換；標(biāo)準(zhǔn)品是疊氮鈉含量為0.01～0.1％、檸檬酸含量為1～5mmol/L的水溶液，標(biāo)準(zhǔn)品中的檸檬酸被酶保護(hù)液中的檸檬酸裂解酶催化后，與苯駢咪唑反應(yīng)，生成可供檢測(cè)的物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)品采用的是現(xiàn)有精漿檸檬酸測(cè)定中使用的標(biāo)準(zhǔn)品。
試驗(yàn)例，用精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑檢測(cè)精漿檸檬酸含量，具體步驟為一、試劑準(zhǔn)備B液凍干粉以500μl凍干粉溶解液充分溶解。
二、樣本準(zhǔn)備1、記錄受檢者一次射精的精液總量(ml)。精液液化后以3000g離心10分鐘，保留精漿。
2、測(cè)定前用稀釋液將待測(cè)精漿標(biāo)本1∶10稀釋三、操作方法準(zhǔn)備1cm的石英比色皿若干，按如下測(cè)定步驟，在石英比色皿中完成反應(yīng)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管標(biāo)本稀釋液(μl) 20----- -----標(biāo)準(zhǔn)品(μl) ----- 20-----稀釋標(biāo)本(μl) ----- ----- 20A液(μl)202020緩沖液(μl) 2000 2000 2000顛倒混勻，室溫放置15min。以空白管調(diào)零，330nm測(cè)定第一次吸光度A1B液(μl)202020顛倒混勻，室溫放置10～40min。以空白管調(diào)零，330nm測(cè)定第二次吸光度A2四、結(jié)果計(jì)算因?yàn)闃?biāo)本的吸光度(A)與標(biāo)本的濃度的比值等于標(biāo)準(zhǔn)液的A值與標(biāo)準(zhǔn)液的濃度的比值，即 又因?yàn)榈谝淮挝舛華1測(cè)的是反應(yīng)液的干擾物的吸光度；第二次吸光度A2測(cè)的是反應(yīng)液的總吸光度；同時(shí)已經(jīng)用稀釋液將精漿標(biāo)本稀釋了10倍，因此在計(jì)算標(biāo)本濃度時(shí)也相應(yīng)地將標(biāo)準(zhǔn)品的濃度2μmol/ml乘以10用20μmol/ml進(jìn)行計(jì)算。
綜上所述，計(jì)算精漿中檸檬酸含量(C標(biāo)本)的公式如下 其中，ΔA標(biāo)本＝A標(biāo)本2-A標(biāo)本1，ΔA標(biāo)準(zhǔn)＝A標(biāo)準(zhǔn)2-A標(biāo)準(zhǔn)1實(shí)際檢測(cè)，采用酶標(biāo)儀比色完成。
五、結(jié)果報(bào)告標(biāo)本最終檢測(cè)結(jié)果以“精漿檸檬酸總濃度”方式報(bào)告總濃度＝標(biāo)本濃度(μmol/ml)×一次射精的精液體積(ml)＝μmol/一次射精六、正常參考值≥100μmol/l次射精七、臨床適用性檢測(cè)精漿檸檬酸對(duì)前列腺炎具有診斷價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，包括保護(hù)液、緩沖液和含有檸檬酸的水溶液標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于還包括含有苯駢咪唑的水溶液，所述保護(hù)液是含有檸檬酸裂解酶的酶保護(hù)液。
2.如權(quán)利要求1所述的精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述保護(hù)液由檸檬酸裂解酶和酶保護(hù)液組成。
3.如權(quán)利要求1或2所述的精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述水溶液中苯駢咪唑含量為0.1～1.0％，所述酶保護(hù)液中檸檬酸裂解酶的含量為2000～8000U/L。
4.如權(quán)利要求3所述的精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述緩沖液是含有硫酸鎂的三羥甲基氨基甲烷緩沖液。
5.如權(quán)利要求4所述的精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述緩沖液中還包括防腐劑，所述標(biāo)準(zhǔn)品中還包括防腐劑。
6.如權(quán)利要求5所述的精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，其特征在于還包括溶解液，所述酶保護(hù)液為凍干粉，溶解液用于溶解酶保護(hù)液凍干粉。
7.如權(quán)利要求6所述的精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述溶解液是含有單糖、無(wú)機(jī)鹽、酪蛋白的水溶液。
8.如權(quán)利要求7所述的精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述溶解液中單糖的含量為0.2～2.0％、無(wú)機(jī)鹽的含量為10～100mM、酪蛋白的含量為0.1～1.0％。
9.如權(quán)利要求8所述的精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品為含檸檬酸含量為1～5mmol/L的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種精漿檸檬酸定量檢測(cè)試劑，包括保護(hù)液、緩沖液、含有檸檬酸的水溶液標(biāo)準(zhǔn)品和含有苯駢咪唑的水溶液，所述保護(hù)液是含有檸檬酸裂解酶的酶保護(hù)液。所述保護(hù)液由檸檬酸裂解酶和酶保護(hù)液組成。所述緩沖液中還包括防腐劑，所述標(biāo)準(zhǔn)品中還包括防腐劑。還包括溶解液，所述酶保護(hù)液為凍干粉，溶解液用于溶解酶保護(hù)液凍干粉。由于上述技術(shù)方案，結(jié)合下面將要詳述的實(shí)施例，本發(fā)明突出的技術(shù)效果在于酶保護(hù)液中只有一種工具酶檸檬酸裂解酶，使得反應(yīng)中來(lái)自其他酶的干擾因素小，方法更特異，方法學(xué)指標(biāo)更優(yōu)；樣本無(wú)需去蛋白處理，操作簡(jiǎn)單；將酶保護(hù)液凍干，并采用了防腐劑，試劑穩(wěn)定，2～8℃貯存期可達(dá)一年。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1595154SQ20041004024
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月14日
發(fā)明者傅劍華, 劉瑜, 胡家純, 何林, 何小紅 申請(qǐng)人:深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司