專利名稱：精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測試劑及免疫微球的制備方法
技術領域：
本發明屬于體外診斷試劑類，具體適用于活動精子膜表面的抗精子抗體的檢測。
背景技術：
免疫因素為男性不育的病因之一。射精前精子抗體與精子表面的結合，是精子抗體干擾男性生殖的唯一途徑。其干擾機制為①干擾精子的代謝活化；②降低進入受精部位的精子數；③干擾受精；④抑制合子細胞分裂。男性免疫性不育診斷的主要依據是證實射精精子表面抗體的附著，因此活體精子膜表面抗體檢測是免疫性不育最具診斷價值的指標。
目前國內主要是采用酶聯免疫實驗(ELISA)測血清或精漿內抗精子抗體，其原理是利用純化的精子抗原包被，用酶標抗人抗體與相應底物顯色。
雖然測女性血清內抗精子抗體有一定的臨床意義，檢測男性血清抗精子抗體卻意義不大，其主要原因在于男性特有的血睪屏障對精子施行封閉式保護，即使血清內有抗精子抗體也不一定會影響生育；再者精子抗原的復雜性給診斷試劑的制備帶來困難，正常人血清、精漿中存在許多與精子抗原交叉成分，造成很高的假陽性率。
混合凝集反應(MAR)是WHO推薦的免疫性不育診斷方法。但是WHO推薦的診斷方法試劑價格昂貴且難以購買，而且其中MAR檢測方法中由于IgG大小不一，難以觀察檢測結果，試驗中還有假陽性精子出現，使得檢測的準確度和可靠性不高。

發明內容
本發明的主要目的在于提供一種易于觀察、結果準確的精子膜表面抗體(MAR)IgG檢測試劑及免疫微球的制備方法。
本發明的再次一目的在于提供一種穩定性更好、保存期更長的精子膜表面抗體(MAR)IgG檢測試劑及免疫微球的制備方法。
為實現上述目的，本發明提出一種精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測試劑，包括抗血清和免疫微球，所述免疫微球的直徑為1.8um~2.2um。
還包括磷酸鹽緩沖液，所述免疫微球在磷酸鹽緩沖液中的體積含量為1~2％。
所述免疫微球是結合有反應量的人IgG的羧化膠乳。
所述抗血清是含反應量的抗人IgG或抗人IgG-Fab段的磷酸鹽緩沖液。
所述抗血清為凍干粉，還包括抗血清溶解液，用于溶解抗血清凍干粉。
所述抗血清溶解液是單糖重量含量為0.9~1.0％、無機鹽的物質的量濃度為20~40mmol/L、酪蛋白重量含量為0.15~0.25％的水溶液。
進一步的，提出一種用于精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測的免疫微球的制備方法，包括如下步驟1)洗去羧化膠乳中為保存而加入的穩定成分，所述羧化膠乳的直徑為1.8um~2.2um；2)活化步驟1)所述的羧化膠乳表面的羧化基團；3)使人IgG包被在步驟2)所述羧化膠乳表面的活化基團上面；4)封閉羧化膠乳表面未結合抗體的羧化基團，得到免疫微球。
所述步驟1)洗去羧化膠乳中的穩定成分的方法為以PH為9.4~9.8、濃度為0.1~0.2mol/L的第一碳酸鹽緩沖液沖洗羧化膠乳，直至洗去羧化膠乳中為保存而加入的穩定成分；所述步驟2)活化羧化膠乳表面基團的方法為步驟1)中的羧化膠乳懸浮于PH為9.4~9.8、濃度為0.1~0.2mol/L的第二碳酸鹽緩沖液中，直至羧化膠乳表面基團被活化，該第二碳酸鹽緩沖液中含有丙烯酸樹脂S-100，丙烯酸樹脂S-100的重量含量為0.2~0.4％；所述步驟3)中人IgG包被的方法為步驟2)中的第二碳酸鹽緩沖液離心，棄上清，再將羧化膠乳懸浮于PH為4.3~4.7、濃度為0.15~0.25mol/L的第一磷酸鹽緩沖液中，加入人IgG，輕輕混勻使人IgG結合在羧化膠乳表面的活化基團上面；所述步驟4)羧化膠乳表面的活化基團封閉的方法為在步驟3)中的第一磷酸鹽緩沖液中加入濃度為0.8~1.2mol/L的氯化氨，封閉羧化膠乳表面未與人IgG結合的羧基位點，最后得到的即為免疫微球。
所述步驟1)之前還包括如下步驟在PH為7.2~7.6、濃度為0.01~0.02mol/L的第二磷酸鹽緩沖液中加入摩爾濃度為100~150mmol/L的無機鹽、質量濃度為1.5~2.5g/L的牛血清蛋白制得免疫微球稀釋液。
還包括如下步驟5)步驟4)所述的第一磷酸鹽緩沖液再次離心，免疫微球重懸于免疫微球稀釋液中；所述步驟5)之后還包括如下步驟免疫微球與抗血清作做交叉試驗，得到免疫微球的合適稀釋度，并用免疫微球稀釋液稀釋步驟5)所述的免疫微球至上述合適稀釋度。
本發明的檢測原理為人的活動精子與致敏有人IgG的免疫微球混合，再與抗血清反應，如果精子結合有抗精子抗體(anti-sperm antibody，AsAb)，則可以形成活動精子與免疫微球的混合凝集物；反之，免疫微球互相粘著成團。由于上述技術方案，結合下面將要詳述的實施例，本發明突出的技術效果在于1、采用直徑在1.8um~2.2um的免疫微球，可以保證免疫微球的大小一致，大小一致的免疫微球與傳統方法相比，結合抗體的活性基團的數目多，交聯率高。
直徑在上述范圍內的免疫微球易于與精子相互凝集，大小一致的免疫微球在結合有抗精子抗體的陽性精子表面形成的凝集顆粒大小適中，易于觀察結果，并且讀取的結果準確性更高；否則，免疫微球大小不一，則易非特異性粘附在精子上，以致出現假陽性結果。
2、免疫微球在磷酸鹽緩沖液中的體積含量為1~2％，該含量是免疫微球在顯微鏡下觀察以及免疫微球與精子、抗血清反應的合適濃度范圍。免疫微球的含量低于上述濃度范圍時，免疫微球與精子的碰撞少，易出現假陰性結果；免疫微球的含量高于上述濃度范圍時，顯微鏡下視野內的珠數量過多影響結果觀察，而且凝集的免疫微球易堆積在精子周圍，出現假陽性結果。
3、抗人IgG-Fc段會在反應中有非特異性的反應，因此將抗人IgG整鏈經胃蛋白酶消化除去Fc段，僅含有抗人IgG-Fab段的抗血清使反應更特異。
4、采用含單糖、無機鹽、酪蛋白的水溶液作為抗血清溶解液，其中單糖重量含量為0.9～1.％、無機鹽物質的量濃度為20～40mM，酪蛋白重量含量有利于抗原抗體結合的親和力及抗血清凍干粉復溶后的穩定性。
5、制備方法中用pH值在9.4~9.8之間，濃度在0.1~0.2mol/L之間的碳酸鹽緩沖液沖洗羧化膠乳中的穩定成分，可以所述PH值范圍可以充分開放羧化膠乳的酸性基團，且此濃度有利于維持反應體系的離子強度。
6、采用Eudragit S-100的含量在0.2~0.4％的碳酸鹽緩沖液活化羧化膠乳，Eudragit S-100的濃度與免疫微球在磷酸鹽緩沖液中的體積含量間的配比關系，決定了免疫微球制備的交聯率高低，0.2~0.4％是達到最佳交聯率時的濃度，過高或過低會使交聯到羧化膠乳上的人IgG減少。
具體實施例方式
下面通過具體的實施例對本發明作進一步詳細的描述。
一種精子膜表面抗體(MAR)IgG檢測試劑，包括含有免疫微球的磷酸鹽緩沖液、抗血清凍干粉和抗血清溶解液。
其中免疫微球起抗體載體的作用，所述免疫微球在本發明中采用的是結合有人IgG的羧化聚苯乙烯膠乳，該免疫微球的直徑為1.8um~2.2um，其在磷酸鹽緩沖液中的體積含量為1~2％。磷酸鹽緩沖液還可以用PH在7.4左右(PH為7.2-7.6)的其它常見緩沖液替換，用于維持免疫微球上結合的人IgG所處環境的PH值、離子強度。
直徑在1.8um～2.2μm是為了保證免疫微球的大小一致，同時在上述直徑范圍內的免疫微球適合與精子相互凝集，還可以采用其他常用的羧化微粒替換本發明中的羧化聚苯乙烯膠乳，或者采用其他表面具有羧基、氨基的化學膠乳替換本發明中的羧化聚苯乙烯膠乳，當不采用羧化膠乳時，交聯人IgG與膠乳的方法需要相應改變。
免疫微球在磷酸鹽緩沖液中的體積含量，是免疫微球在顯微鏡下觀察及免疫微球與精子、抗血清反應的合適濃度范圍。免疫微球的含量過低時，免疫微球與精子的碰撞少，易出來假陰性結果；免疫微球的含量過高時，顯微鏡下視野內的微球數量過多影響結果觀察，而且凝集的免疫微球易堆積在精子周圍，易出現假陽性結果。
抗血清凍干粉被復溶后起連接免疫微球與結合有抗精子抗體陽性精子的作用，也可以直接使用抗血清溶液，這樣就無需使用抗血清溶解液了，所述抗血清凍干粉在本發明中采用的是含抗人IgG-Fab段的磷酸鹽凍干粉，這是由于抗人IgG-Fc段具有非特異性，會在檢測中發生非特異性的反應，因此將抗人IgG整鏈經胃蛋白酶消化除去Fc段，使用純化的抗人IgG-Fab段作抗血清，使檢測結果更特異，還可以采用其他常用的抗人IgG的抗血清替換本發明中的抗血清。
羧化聚苯乙烯膠乳上人IgG的含量為需與抗血清溶液內的抗人IgG或抗人IgG-Fab段效價相適應，當它們含量配比過低時，免疫微球難以結合在陽性精子表面導致出現假陰性結果；當它們含量配比過高時，免疫微球凝集速度過快，難以與陽性精子凝集或堆積在陰性精子表面，影響檢測。此含量配比可作交叉實驗得出。
抗血清溶解液起復溶抗血清凍干粉及穩定復溶后抗血清的作用，所述抗血清溶解液在本發明中采用含葡萄糖含量為0.9～1.％、氯化鈉20～40mM，酪蛋白0.15～0.25％的水溶液，其中葡萄糖還可以用其他的單糖替換，氯化鈉還可以用其他的無機鹽替換，葡萄糖、氯化鈉、酪蛋白的含量過高或過低都會影響抗原抗體結合的親和力及抗血清凍干粉復溶后的穩定性。
上述檢測試劑的各成分采用如下工藝方法制得A、免疫微球稀釋液的制作工藝方法1)含氯化鈉(NaCl)125mmol/L、牛血清蛋白(BSA)2mg/ml、疊氮鈉(NaN3)0.15％的pH7.3，0.015mol/L的第二磷酸鹽緩沖液，以孔徑0.22um過濾器濾過后2~8℃保存。
其中NaCl是為了保持溶液的滲透壓和離子強度，BSA是為了穩定抗人IgG-Fab段，NaN3是為了防腐；NaCl的含量為100~150mmol/L、BSA的含量為1.5~2.5mg/ml、NaN3的含量為0.1~0.2％，NaCl、BSA、NaN3的含量不在所給范圍之內會使效果不明顯；孔徑0.22um過濾器過濾是為了除過溶液內的細菌和沉淀，能保證產品的穩定性，還可以采用其他過濾器過濾，只要過濾器的孔徑小于細菌的直徑即可。
第二磷酸鹽緩沖液的PH值在7.2~7.6之間，濃度在0.01~0.02mol/L之間，指定PH值在7.2~7.6之間是因為在此pH值范圍內的第二磷酸鹽緩沖液可以穩定連接到免疫微球上的抗體的空間構型，維持抗體活性；其濃度范圍在0.01~0.02mol/L之間有利于維持溶液的離子強度和滲透壓，不在或超出該范圍交聯抗體易脫落或空間構型發生變化導致失活。
B、免疫微球的制作工藝方法2)羧化膠乳15ul，以pH9.6、濃度為0.15mol/L的第一碳酸鹽緩沖液洗兩次或洗凈至洗去為保存羧化膠乳而加入的穩定成分，小珠懸浮于2.5ml pH9.40.15mol/L含0.3％Eudragit S-100的第二碳酸鹽緩沖液，輕輕混合置2~8℃下1小時或直到活化羧化膠乳表面的基因。
其中，羧化膠乳用于提供致敏所需的載體，在本制備方法中采用的羧化聚苯乙烯膠乳微粒，還可以用其他的羧化微粒替換，或者用其他表面具有羧基的化學膠乳替換本制備方法中的羧化聚苯乙烯膠乳。
在本實施例中該第二碳酸鹽緩沖液的pH值在9.4～9.8之間，濃度在0.1～0.2mol/L之間第一碳酸鹽緩沖液用于沖洗羧化膠乳中的穩定成分，該第一碳酸鹽緩沖液的pH值在9.4~9.8之間，濃度在0.1~0.2mol/L之間，指定第一碳酸鹽緩沖液的PH值在9.4~9.8之間是因為pH值范圍在開放膠乳酸性基團時起到決定性的作用，其濃度范圍在0.1~0.2mol/L之間有利于維持反應體系的離子強度。
第二碳酸鹽緩沖液的pH值在9.4~9.8之間，濃度在0.1~0.2mol/L之間，其中Eudragit S-100的含量在0.2~0.4％之間，Eudragit S-100的濃度與免疫微球在磷酸鹽緩沖液中的體積含量間的配比關系，決定了免疫微球制備的交聯率高低，本制備方法中指定Eudragit S-100的含量為0.2~0.4％是達到最佳交聯率時的濃度，過高或過低會使交聯到羧化膠乳上的人IgG減少。
3)將上述第二碳酸鹽緩沖液離心，棄上清，羧化膠乳懸浮于2.5ml含0.1ml抗體pH4.5、濃度為0.2mol/L第一磷酸鹽緩沖液中，輕輕混勻后置2~8℃3小時或直至抗體結合在羧化膠乳的活化基團上面。
上述第一碳酸鹽緩沖液的pH值為4.3~4.7，為0.15~0.25mol/L，指定PH值為4.3~4.7是因為pH值范圍在開放抗體氨基基團時起到決定性的作用，其濃度在0.15~0.25mol/L之間有利于維持反應體系的離子強度。
4)在上述的第一磷酸鹽緩沖液中加入1mol/L氯化氨50ul 2~8℃下反應10min，再次離心，羧化膠乳重懸于0.015M pH7.24的第二磷酸鹽緩沖液中。
氯化氨的濃度為0.8~1.2mol/L，此濃度為實現氯化氨封閉羧化膠乳表面化學基團的最適反應配比，低于此濃度會導致封閉不完全，高于此濃度會破壞交聯在羧化膠乳上的抗體。
5)與抗血清作做交叉試驗，根據不同稀釋度的抗血清與羧化膠乳反應形成凝集顆粒所用的時間及形成凝集顆粒大小，得免疫微球合適稀釋度和抗人IgG-Fab段的合適稀釋度，根據免疫微球合適稀釋度，用步驟1)得到的免疫微球稀釋液稀釋，2~8℃保存。
C、抗血清凍干粉的制作工藝方法6)根據步驟5)所得到的抗人IgG-Fab段的合適稀釋度，用0.015M pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋抗體液后，分裝稀釋后的抗體液，加蓋后置-80℃冷凍過夜。
7)待冷凍干燥機預冷后，迅速將步驟6)所述稀釋后的抗體液置于凍干機樣品室，開啟凍干程序，冷凍6~8小時或直到抗體液完全凍干，放氣后，加蓋，得到抗血清凍干粉。
D、抗血清溶解液的制作工藝方法8)稱取葡萄糖10克，氯化鈉30mM，酪蛋白2克，溶于800毫升蒸餾水。所述抗血清溶解液中含葡萄糖的含量為0.9~1.％、氯化鈉的含量為20~40mM、酪蛋白的含量為0.15~0.25％，其中葡萄糖還可以為單糖替換，氯化鈉還可以用其余可溶性含鈉的無機鹽替換，葡萄糖、氯化鈉、酪蛋白基本上都是起穩定復溶后抗體的作用，如果各組分的含量低于所給出的下限或高于所給出的上限都會影響抗原抗體結合的親和力及抗血清凍干粉復溶后的穩定性。
9)將步驟8)得到的溶液移入1000毫升裝容量瓶內，用蒸餾水定容至1000毫升。置2~8℃保存。
MAR IgG檢測試劑檢測精子膜表面抗體，具體步驟為一、試劑準備每瓶抗血清凍干粉加130ul抗血清溶解液，溶解30min或直至溶液穩定，待用，抗血清凍干粉與抗血清溶解液的最佳配比是凍干前的抗血清量與抗血清溶解液的體積比是1∶1的關系。
二、樣本新鮮精液三、操作方法1、在潔凈載玻片上加5ul液化的新鮮精液和5ul免疫微球，以加樣器頭或蓋玻片邊緣混合5次或充分混合。
2、加5ul抗血清，以加樣器頭或蓋玻片邊緣混合5次或充分混合，蓋上蓋玻片。
3、室溫(25~35℃)孵育10分鐘后(提供抗體反應所需要的時間與溫度)，在400X至600X高倍顯微鏡或相差顯微鏡下判讀結果，10分鐘后(或反應結束)再觀察一次。記錄片中兩次記錄的差值，計算附著在免疫微球上的活動精子百分率(忽略尾尖結合)。每片至少計數200個活動的精子，記錄免疫微球同精子結合的部位(頭、中段、尾)。
四、參考值如果10％或更多活動陽性精子包裹在免疫微球上，則有臨床意義，即表示這次實驗的受試者可能是免疫性不育，WHO規定還需要做重復試驗或其實抗精子抗體的檢測方法來確證；如果低于10％的陽性活動精子包裹在免疫微球上，則說明受試者不是免疫性不育。
五、臨床適用性是WHO推薦的男性免疫性不育診斷的標準方法。
權利要求
1.一種精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測試劑，包括抗血清和免疫微球，其特征在于所述免疫微球的直徑為1.8um~2.2um。
2.根據權利要求1所述的精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測試劑，其特征在于還包括磷酸鹽緩沖液，所述免疫微球在磷酸鹽緩沖液中的體積含量為1~2％。
3.根據權利要求2所述的精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測試劑，其特征在于所述免疫微球是結合有反應量的人IgG的羧化膠乳。
4.根據權利要求3所述的精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測試劑，其特征在于所述抗血清是含反應量的抗人IgG或抗人IgG-Fab段的磷酸鹽緩沖液。
5.根據權利要求1-4其中之一所述的精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測試劑，其特征在于所述抗血清為凍干粉，還包括抗血清溶解液，用于溶解抗血清凍干粉。
6.如權利要求5所述的精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測試劑，其特征在于所述抗血清溶解液是單糖重量含量為0.9~1.0％、無機鹽的物質的量濃度為20~40mmol/L、酪蛋白重量含量為0.15~0.25％的水溶液。
7.一種用于精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測的免疫微球的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)洗去羧化膠乳中為保存而加入的穩定成分，所述羧化膠乳的直徑為1.8um~2.2um；2)活化步驟1)所述的羧化膠乳表面的羧化基團；3)使人IgG包被在步驟2)所述羧化膠乳表面的活化基團上面；4)封閉羧化膠乳表面未結合抗體的羧化基團，得到免疫微球。
8.根據權利要求7所述的免疫微球的制備方法，其特征在于，所述步驟1)洗去羧化膠乳中的穩定成分的方法為以PH為9.4~9.8、濃度為0.1~0.2mol/L的第一碳酸鹽緩沖液沖洗羧化膠乳，直至洗去羧化膠乳中為保存而加入的穩定成分；所述步驟2)活化羧化膠乳表面基團的方法為步驟1)中的羧化膠乳懸浮于PH為9.4~9.8、濃度為0.1~0.2mol/L的第二碳酸鹽緩沖液中，直至羧化膠乳表面基團被活化，該第二碳酸鹽緩沖液中含有丙烯酸樹脂S-100，丙烯酸樹脂S-100的重量含量為0.2~0.4％；所述步驟3)中人IgG包被的方法為步驟2)中的第二碳酸鹽緩沖液離心，棄上清，再將羧化膠乳懸浮于PH為4.3~4.7、濃度為0.15~0.25mol/L的第一磷酸鹽緩沖液中，加入人IgG，輕輕混勻使人IgG結合在羧化膠乳表面的活化基團上面；所述步驟4)羧化膠乳表面的活化基團封閉的方法為在步驟3)中的第一磷酸鹽緩沖液中加入濃度為0.8~1.2mol/L的氯化氨，封閉羧化膠乳表面未與人IgG結合的羧基位點，最后得到的即為免疫微球。
9.根據權利要求7或8所述的免疫微球的制備方法，其特征在于，所述步驟1)之前還包括如下步驟在PH為7.2~7.6、濃度為0.01~0.02mol/L的第二磷酸鹽緩沖液中加入摩爾濃度為100~150mmol/L的無機鹽、質量濃度為1.5~2.5g/L的牛血清蛋白制得免疫微球稀釋液。
10.根據權利要求9所述的免疫微球的制備方法，其特征在于，還包括如下步驟5)步驟4)所述的第一磷酸鹽緩沖液再次離心，免疫微球重懸于免疫微球稀釋液中；所述步驟5)之后還包括如下步驟免疫微球與抗血清作做交叉試驗，得到免疫微球的合適稀釋度，并用免疫微球稀釋液稀釋步驟5)所述的免疫微球至所述合適稀釋度。
全文摘要
本發明公開一種精子膜表面抗體混合凝集反應IgG檢測試劑，包括抗血清和免疫微球，所述免疫微球的直徑為1.8um~2.2um。直徑為1.8um~2.2um的免疫微球，大小一致、易于與精子相互凝集，從而在結合有抗精子抗體的陽性精子表面形成的凝集顆粒大小適中，易于觀察結果，且結果的準確性更高；否則會出現假陽性結果。還提出一種免疫微球的制備方法，包括如下步驟1)洗去羧化膠乳中為保存而加入的穩定成分，所述羧化膠乳的直徑為1.8um~2.2um；2)活化步驟1)所述的羧化膠乳表面的羧化基團；3)使人IgG包被在步驟2)所述羧化膠乳表面的活化基團上面；4)封閉羧化膠乳表面未結合抗體的羧化基團，得到免疫微球。
文檔編號G01N33/531GK1755366SQ20041004079
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月30日 優先權日2004年9月30日
發明者傅劍華, 劉瑜, 胡家純, 何林, 何小紅 申請人:深圳華康生物醫學工程有限公司